一种辣椒内生贝莱斯芽孢杆菌PEB23及其应用的制作方法

一种辣椒内生贝莱斯芽孢杆菌peb23及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物和生物防治领域，具体涉及抗菌谱较广的贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis）及其应用。


背景技术：

2.辣椒是我国种植面积最大的蔬菜作物之一，辣椒产业是湖南省的优势与特色产业之一，年种植面积约13万hm2。但是，随着大棚蔬菜等设施农业的推广以及连作重茬，导致湖南省辣椒土传病害发生逐年严重，其中青枯病和疫病是该省发生最严重辣椒的两种毁灭性土传病害，青枯病和疫病的病原菌可以在病区土壤中长期存活、难以根治，而且可以危害辣椒的整个生育期，导致严重的经济损失。采用化学农药对土壤进行熏蒸是目前较为有效的土传病害防治方法，但是成本高、操作难，对土壤微生态破坏严重，且污染环境。应用拮抗微生物菌剂对土传病害进行生物防治被认为是绿色环保的防治措施，近年来成为研究的热点。但如何获得效果好的拮抗微生物却是十分困难的。
3.关于辣椒土传病害的拮抗细菌筛选和生物防治的研究报道较多(郝楠，仝赞华，邱德文. 侧孢短芽孢杆菌a60的筛选及其对辣椒疫霉的室内防效测定[j]. 生物技术通报，2017，33（9）：160-165.；李师默. 辣椒和番茄青枯病等土传病害的生物防治研究[d]. 南京：南京农业大学，2008.；梅新兰，赵青云，谭石勇，等. 辣椒疫病拮抗菌株筛选、鉴定及其防效[j]. 应用生态学报，2010，21（10）：2652-2658.；王玲，刘二明，周鑫钰，等. 一株辣椒青枯病菌拮抗内生细菌的筛选鉴定与发酵条件优化[j]. 南方农业学报，2014，45（10）：1781-1787.；杨万荣，邢丹，蓬桂华，等. 木霉菌生物防治辣椒疫病的研究进展[j]. 现代农业科技，2015，（19）：127-129.；张爱民，邢丹，杨万荣，等. 辣椒疫病生物防治技术研究进展[j]. 长江蔬菜，2013，（8）：1-4.)，主要集中在根际土壤中拮抗细菌、拮抗链霉菌等的筛选上，对于内生菌的筛选并不多见。相比较土壤微生物，内生菌除了能在根际土壤中定植之外，还能通过根系进入植株体内，比暴露于外部环境的微生物具有更稳定的生存环境，更易于发挥抗病和促生长的作用，显示了植物内生菌作为对环境无公害生物农药开发的广阔前景（石晶盈，陈维信，刘爱媛. 植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[j]. 生态学报，2006，26（7）：2395-2401.；文才艺，吴元华，田秀玲. 植物内生菌研究进展及其存在的问题[j]. 生态学杂志，2004，23（2）：86-91.）。


技术实现要素：

[0004]
本发明人尝试从多年连作的辣椒地里，采集发病高峰期还保持健康的植株，从其根系中分离到了一株内生拮抗细菌peb-23，该菌株对辣椒青枯雷尔氏菌、辣椒疫霉菌、辣椒炭疽病菌、辣椒镰刀枯萎病菌都有显著抑制效果，菌株发酵培养液同样对几种病原真菌和细菌都有显著的抑菌活性，对该内生拮抗细菌进行了初步鉴定，并对其促生长潜力因子进行了测定。最终完成本发明。
[0005]
本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌（bacillus velezensis），其保藏编号cctccno：
m2021910。
[0006]
进而提供所述的贝莱斯芽孢杆菌在生物防治中的应用。具体地，所述生物防治是用于辣椒作物。更优选地，所述生物防治对象是辣椒白绢病菌、辣椒青枯雷尔氏菌、辣椒疫霉菌、辣椒炭疽病菌和/或辣椒镰刀枯萎病菌。
[0007]
本发明还提供所述的贝莱斯芽孢杆菌在促进植物生长中的应用。具体地，所述植物是辣椒作物。
[0008]
本发明也提供一种生物防治制剂，其特征在于，其含有所述的贝莱斯芽孢杆菌作为活性成分。其中优选地，以培养后的贝莱斯芽孢杆菌菌体形式作为活性成分。
[0009]
本发明进一步提供一种植物生物促进剂，其特征在于，其含有所述的贝莱斯芽孢杆菌作为活性成分。优选地，其作为肥料添加剂添加肥料中。
[0010]
本发明分离到的内生拮抗细菌peb-23，与已经报道的辣椒拮抗细菌相比，该菌株抗菌谱更广，对多种辣椒病原细菌（辣椒青枯雷尔氏菌）、辣椒病原真菌（辣椒白绢病、辣椒疫霉菌、辣椒炭疽病菌、辣椒镰刀枯萎病菌）都有显著抑制效果。通过16srdna测序对该菌株进行了鉴定，确定peb-23菌株为贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）。除了抑菌活性较强植物，该菌还能产生铁载体、吲哚-3-乙酸（iaa），还具有较强的溶解有机磷的能力，显示了很好的抗病促生长潜能，具备开发成为辣椒土传病害生防菌剂或抗病促生长微生物肥料的潜力。
[0011]
内生拮抗细菌bacillusvelezensispeb23已于2021年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉市武汉大学），保藏编号cctccno：m2021910。
附图说明
[0012]
图1peb-23菌株菌落形态图。
[0013]
图2peb-23菌株菌落显微镜下芽孢形态。
[0014]
图3拮抗菌peb-23对辣椒白绢病病原菌（sclerotiumrolfsii）的抑菌活性。其中，pda平板中间接种白绢病菌，上下各划线接种peb23，对峙培育；下图为单独接种白绢病菌对照）。
[0015]
图4拮抗菌peb-23对其他辣椒病原菌的抑菌活性。其中，1.辣椒青枯雷尔氏菌（ralstoniasolanacearum）gm1000；2.辣椒疫霉菌（phytophthoracapsici）；3.辣椒炭疽菌（colletotrichumcapsici）；4.枯萎病尖孢镰刀菌（fusariumoxysporum）。
[0016]
图5内生拮抗菌peb-23的16srdna系统进化树。
[0017]
图6内生菌peb23菌剂对辣椒白绢病的防治效果。
具体实施方式
[0018]
本发明从多年连作的辣椒地分离到了1株内生拮抗细菌peb-23。
[0019]
材料与方法1.1试验材料2017年从湖南省农科院蔬菜研究所辣椒抗病育种试验田中采集健康辣椒植株，辣椒品种为湖南大面积种植的兴蔬105，试验田为连续3a连作辣椒，青枯病、疫病、白绢病发生严重。
[0020]
供试植物病原菌青枯雷尔氏菌（ralstoniasolanacearum）gm1000为湖南农业大学陈武副教授提供，辣椒白绢病（sclerotiumrolfsii）、辣椒疫霉菌（phytophthoracapsici）、辣椒炭疽菌（colletotrichumcapsici）、枯萎病尖孢镰刀菌（fusariumoxysporum）为湖南省农科院蔬菜研究所郑井元副研究员提供。
[0021]
内生细菌分离采用lb培养基和1/10lb培养基，常规细菌培养采用lb培养基，病原真菌培养基采用pda培养基，青枯雷尔氏菌采用ttc培养基（江欢欢，程凯，杨兴明，等.辣椒青枯病拮抗菌的筛选及其生物防治效应[j].土壤学报，2010，47（6）：1225-1231.），液体发酵培养基采用landy培养基（别小妹，吕凤霞，陆兆新，等.bacillussubtilisfmbj脂肽类抗菌物质的分离和鉴定[j].生物工程学报，2006，22（4）：644-649.）。除pda培养基外，其余培养基ph均为7.0~7.2。
[0022]
lb培养基：胰蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、琼脂20g，1l蒸馏水。landy培养基：pda培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g，加水至1000ml1.2试验方法1.2.1内生菌的分离纯化内生菌的分离参考现有文献（袁珊珊.水稻内生菌osish-10的分离及其抗稻瘟病与促植物生长的研究[d].长沙：湖南大学，2015），进行了细微的调整。将辣椒的主根和侧根剪下用清水洗净泥沙，放入超净工作台中吹干，然后放入磷酸氢二钠中超声1min进一步去除表面杂质，取出根系依次用无水乙醇、4%次氯酸钠、硫代硫酸钠进行表面消毒，消毒后大量无菌水洗去残留的消毒剂，取最后一步清洗液涂布lb平板检测消毒是否彻底，将消毒彻底的根系在超净工作台中吹干。然后放入灭菌的研钵中研磨成浆液，取1、10、50μl汁液涂布lb和1/10lb平板，30℃培养箱中培养3~7d，挑取单菌落划线至lb平板，获得纯培养物。
[0023]
内生菌拮抗菌的筛选对辣椒病原真菌的拮抗试验采用对峙培养法
[14]
，将在pda平板上培养2~3d的病原真菌用打孔器在菌丝生长外缘打若干孔，用接种针将菌丝块取出，放置在一个新的pda平板中央，在距离中央3cm处用接种环划线或点接筛选出来的细菌，28℃共培养3~5d，观察并测量抑菌圈大小。对辣椒青枯病菌的拮抗试验采用双层平板法，将青枯病加入ttc培养基中，倒平板，在平板上点接筛选出来的细菌，培养2d，观察并测量抑菌圈大小。
[0024]
内生拮抗菌的初步鉴定采用uniq-10柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取内生菌基因组，方法参考试剂盒说明书。内生拮抗菌基因组提取完后，取样进行琼脂糖凝胶电泳检测基因组提取质量，并用微量分光光度计nanodropone测定dna浓度。然后，以内生拮抗菌的基因组dna为模板，用细菌通用的16srdna27f/1492r引物对拮抗菌的16srdna进行pcr扩增，扩增产物送至进行测序。pcr扩增体系，体系：pcrmix25μl，引物27f（10μmol/l）1μl，引物1492r（10μmol/l）1μl，模板dna约10pmol，加重蒸水至50μl。扩增条件：98℃5min；94℃35s，55℃35s，72℃1min，35个循环；72℃10min。采用dna胶回收试剂盒，通过琼脂糖凝胶电泳回收目标dna片段，由湖南擎科生物技术有限公司测序；测序结果用blast软件在genbank进行同源性比较，以clustalx进行多序列比对后，再利用软件mega6进行多序列同源性分析，构
建系统进化树。
[0025]
含有内生拮抗菌peb23菌剂的制备及防治辣椒白绢病的盆栽试验将内生拮抗菌peb23的活菌体活化后，接种于lb液体培养基中，于28℃、150rpm条件下培养至对数生长期得到种子液；将种子液以体积2%的接种量接种于lb液体培养基中，在28℃、150rpm的条件下摇床培养40-48h得到发酵液；将发酵液倒出后，通过平板计数的方式对发酵液的终浓度进行有效活菌数的计数，菌液离心后弃去上清，然后根据评估结果将发酵液用水稀释成108cfu/ml的溶液，用于辣椒盆栽试验。盆栽试验设置两个组，即空白组（ck）、处理组（peb23），每个处理15株，盆栽土壤采用取自田间的菜地土，每盆装2kg土壤。移栽前处理组（peb23）的辣椒苗采用peb23菌液浸根处理30s后进行种植，而后每10天对辣椒植株浇灌一次制备的菌剂（菌液浓度为108cfu/ml），菌剂用量为10ml/株，共浇灌2次；空白组用清水替代菌剂进行浸根处理和辣椒植株的浇灌，各处理组的其它水肥管理条件完全相同，施肥按农民习惯施肥用量进行，统一不使用防治病害的药剂。种植15天后，对所有苗进行人工接种白绢病病原菌。10天后，观察辣椒的生长及发病情况，统计发病率及病情指数。
[0026]
内生拮抗菌peb-23促进植物生长指标的检测为预测内生拮抗菌peb-23除了抗病植物，是否还具备促进植物生长的潜力，根际文献的方法（李引，虞丽，李辉信，等.一株花生根际促生菌的筛选鉴定及其特性研究[j].生态与农村环境学报，2012，28（4）：416-421；[16]蒙渊.产铁载体和acc脱氨酶的氢氧化细菌筛选及促生作用研究[d].西安：西北大学，2011），进行了peb-23产铁载体、产吲哚-3-乙酸（iaa）、溶解有机磷、溶解无机磷、解钾、固氮等能力的测定。
[0027]
内生拮抗菌peb23菌株的促生盆栽试验将内生拮抗菌peb23的活菌体活化后，接种于lb液体培养基中，于28℃、150rpm条件下培养至对数生长期得到种子液；将种子液以体积2%的接种量接种于lb液体培养基中，在28℃、150rpm的条件下摇床培养，48h后取样镜检，芽孢率超过90%后停止培养，得到含有拮抗菌peb23的；将发酵液倒出后，通过平板计数的方式对发酵液的终浓度进行有效活菌数的计数，菌液离心后弃去上清，然后根据评估结果将发酵液用水稀释成108cfu/ml的溶液，用于辣椒盆栽试验。盆栽试验设置两个组，即空白组（ck）、处理组（peb23），每组种植20株，盆栽土壤采用取自田间的菜地土，每盆装2kg土壤。移栽前处理组（peb23）的辣椒苗采用peb23菌液浸根处理30s后进行种植，而后每10天对辣椒植株浇灌一次制备的菌剂（菌液浓度为108cfu/ml），菌剂用量为10ml/株，共浇灌3次；空白组用清水替代菌剂进行浸根处理和辣椒植株的浇灌，各处理组的其它水肥管理条件完全相同，施肥按农民习惯施肥用量进行，统一不使用防治病害的药剂。种植50天后，观察辣椒的生长及发病情况，记录株高、展幅指标；统计辣椒植株从开始结果到50天的有效采收期内所有成熟辣椒的鲜重，结果数是采收辣椒的数量，所有数据均用spss22.0软件进行统计分析。
[0028]
2结果与分析2.1拮抗菌的分离和筛选结果从发病严重的田块中的健康植株根系中分离到了132株内生细菌，经过初筛有22株具有抑菌活性，其中1株编号为peb-23的菌株，对辣椒白绢病（sclerotiumrolfsii）、辣椒青枯雷尔氏菌（ralstoniasolanacearum）gm1000、辣椒疫霉菌（phytophthoracapsici）、辣椒炭疽菌（colletotrichumcapsici）、枯萎病尖孢镰刀菌（fusarium
oxysporum）均有强拮抗作用，平均抑菌圈直径分别达到23.8mm，10.0mm、13.8mm、26.4mm、24.5mm，显示出较广的抑菌谱（图4和表1）。
[0029]
peb-23在lb平板培养基上，菌落呈淡黄色，具有明显褶皱（图1），显微镜下菌体为杆状，可形成芽孢（图2）。
[0030]
表1内生拮抗菌peb-23对5种辣椒病原菌的抑菌直径 2.3内生拮抗菌的的16srdna序列及其同源性分析结果为进一步鉴定该菌株的种属，采用试剂盒提到的peb-23菌株的基因组dna，以peb
–
23菌株基因组为目标，以引物27f/1492r成功扩增到了1.5kb左右的条带，测序后内生拮抗菌peb-23的16srrna基因片段大小为1427bp，以此序列及同源序列构建系统发育树（图5），显示peb-23与贝莱斯芽孢杆菌（bacillusvelezensis）cbmb205（登录号：nzcp011973.1））亲缘关系最近，同源性达到99.65%。
[0031]
》peb-23acttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcagacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacc。
[0032]
内生菌peb23对辣椒白绢病的防治效果进行了盆栽试验，测定了peb23菌株对辣椒白绢病的防控效果（图6），根据表2中结果表明peb23菌剂对辣椒白绢病的防治效果可达58.8%，说明单独使用peb23菌剂对辣椒白绢病具有较好的的防治效果。
[0033]
表2内生菌peb23菌剂对辣椒白绢病的盆栽防治效果组别病株数/总株数发病率（%）病情指数防治效果（%）peb235/1533.32958.8ck13/1586.768\2.5内生拮抗菌peb-23促进植物生长潜能的测定通过对peb-23产铁载体、产吲哚-3-乙酸（iaa）、溶解有机磷、溶解无机磷、解钾、固氮等能力的测定。
[0034]
细菌产铁载体检测采用cas平板，首先配置溶液i，60.5mg铬天青（cas）溶于50ml超纯水，与10mlfe
3
溶液混合，加入到十六烷基三甲基溴化胺（hdtma）溶液中；再配溶液ii，0.3gkh2po4，0.5gnacl、1.0gnh4cl，15g琼脂粉，30.24g呱嗪二乙酸磺酸钠（pipes），调节ph到6.8；再配其它溶液：20%蔗糖溶液；10%酸水解酪素；1mmol/lcacl2，10mmol/lmgso4。单独灭菌，所有培养基均要121℃高压灭菌30min，备用。配置cas平板前将上述溶液加热熔化，冷却至50℃，按比率混合后倾注平板。
[0035]
由表3可知，内生拮抗菌peb-23能在cas平板上产生橙黄色晕圈，说明其具有铁载体产生能力。同时还能在添加色氨酸的情况下，产生iaa。此外，在有机磷为唯一磷源的培养基上都能产生较大的透明水解圈，但是在无机磷为唯一磷源的培养基上只能产生较小的水解圈。在钾长石和阿须贝无氮培养基上都能很好的生长，说明其可能具有解钾和固氮活性。
[0036]
表3内生拮抗菌peb-23促生指标测定促生长指标产铁载体产iaa溶解有机磷溶解无机磷解钾固氮水平 注：“ ”表示该项活性很强，“ ”表示该项活性较强，“ ”表示该项活性较低，
“‑”
表示没有活性。
[0037]
内生菌peb23对辣椒的促生长效果采用盆栽试验，测定了peb23菌株对辣椒的促生长效果，结果如表4所示。
[0038]
表4内生菌peb23对辣椒的促生长效果组别结果数（个/株）产量（g/株）株高（cm）展幅（cm）peb23107
±
5.72013.2
±
273.449.0
±
2.745.0
±
3.2ck82
±
4.91614
±
12344.4
±
2.139.2
±
2.2根据表4中结果可以看出，处理组（peb23）的辣椒植株比对照组长势更要茂盛，处理50d后辣椒的结果数、产量、株高、展幅与空白组相比，各指标均存在显著的优势（p＜0.05），其中株高增加了10.3%，展幅增加了14.8%，产量增加24.7%。表明产铁载体内生菌peb23对辣椒具有明显的促生长效果，具有开发为微生物肥料的潜力。