一种基于lncRNA测序的玉米耐盐基因发现方法及其应用

一种基于lncrna测序的玉米耐盐基因发现方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及植物遗传技术领域，尤其涉及一种基于lncrna测序的玉米耐盐基因发现方法及其应用。


背景技术：

2.玉米是全球最重要的粮食作物，提供了超过一半的卡路里消耗，然而未来玉米的供应遭受多方面的威胁，至2050年玉米产量需要加倍才能满足人们日益增长的需求，粮食安全问题日趋紧张。此外，多种环境因素也在威胁未来玉米的供应，盐胁迫是其中一种影响玉米生长和产量的重要因素。全球有大约4.15
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108公顷土地受盐胁迫影响，我国也有将近1亿公顷土地为盐碱地，约占全国土地面积的10％，是重要的后备土地资源。培育耐盐玉米种质能够充分利用这部分土地，也是保障未来粮食安全的重要举措。而培育耐盐玉米种质的成效取决于对玉米耐盐基因资源的挖掘和玉米耐盐遗传机制的充分了解。
3.长链非编码rna(long non-coding rna,lncrna)是一类在不同物种中具有低序列保守性的转录物，长度超过200个核苷酸，并且没有蛋白质编码能力。已发现植物lncrna可作为转录调节因子或是具有功能的lncrna直接或间接参与到植物的春化作用、逆境胁迫、生殖发育、开花时间调控、木材形成、果实成熟及光形态建成等生物学过程，对植物生长发育起到重要作用；lncrna能调控很多抗盐基因，如：和离子运输相关的hkt1和nhx基因，而且具有很高的组织特异性。因此，本技术拟对玉米盐胁迫下的lncrna及其靶基因开展鉴定，并对其进行功能分析，发掘玉米耐盐基因。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于lncrna测序的玉米耐盐基因发现方法及其应用。
5.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
6.一种玉米耐盐基因，所述玉米耐盐基因为玉米耐盐基因zm00001d010406，且玉米耐盐基因zm00001d010406位于8号染色体。
7.优选地，所述玉米耐盐基因zm00001d010406的cdna序列信息如下：
8.》zm00001d010406_t001 zm00001d010406_t001 cdna length:5684bp atggggatggggcgatttgtaagcccaatcttttatttattcaggtttgaaccgtacttgaggaatgcatgcaagaggtttgcgttggagcaccgggctggcgagaaccgtgccccgctcatctcagatgatagccccaacaaagatatcaacattgctttctataacatcccgatgctgaaaaaactgagagagcttgggacagccgaaattggtaagctcacatcagtaatgggtgttgtgacacggacaagtgaagtgcggcctgaactattgcaaggaaccttcaaatgtctcgactgtgggaatgttgtgaagaatgtggagcagcagttcaagtacactgagccgataatatgcgttaatgcaacatgccagaacagaacaaaatgggcccttcttcgtcaggaaagcaaattcacagattggcagcgggtcagaatgcaggagacatcaaaagagatacccgctgggtcacttcctcgttcccttgatgtcattctgcggcatgagattgttgagaaggccagagctggggacacggttatatttactggaactgttgttgcagttcctgatgttatggcactaacttcacctggcgaacgagcagagt
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9.本发明还提供了一种获得基于lncrna测序的玉米耐盐基因的发现方法，包括以下步骤：
10.步骤1、链特异性转录组测序
11.挑选整齐一致、颗粒饱满的lh196种子培养；将长势一致的去胚乳幼苗分成两组，一组为空白对照，一组为250mm nacl营养液培养组，持续处理10天；上述同样条件下培养玉米自交系lh196，然后分别用250mmol/l的盐处理和空白对照处理12h后，采取玉米的叶片，在液氮中冷冻然后保存在-80℃备用；利用试剂盒提取6个样品叶片中的rna，分别开展链特异性转录组测序；
12.使用链特异性建库方式开展lncrna测序，与普通的转录组建库方式相比，链特异性测序可以确定两条链的转录方向性，减少比对过程中的错误；其次，lncrna建库测序能得到更丰富的信息；lncrna建库属于mrna lncrna，只需要一次建库，就能同时获得mrna的数
据以及lncrna的数据；
13.步骤2、差异表达基因鉴定和lncrna分析
14.鉴定差异表达基因：差异表达基因筛选；差异表达基因聚类分析；差异表达基因的功能注释；差异表达基因的go和kegg富集分析；差异表达基因蛋白互作网络；
15.lncrna分析：lncrna表达定量分析；lncrna差异表达分析；样品间lncrna相关性分析；cis作用差异lncrna靶基因注释富集分析；cis作用差异lncrna靶基因ppi分析；trans作用差异lncrna靶基因注释富集分析；trans作用差异lncrna靶基因ppi分析；
16.联合差异表达基因和lncrna靶基因预测，发掘共性基因作为玉米耐盐候选基因；
17.步骤3、耐盐基因的表达模式验证
18.步骤3.1、对于上述耐盐候选基因，利用primer5进行引物的设计并合成，将rna反转录为cdna，利用实时定量pcr进行表达模式验证；
19.步骤3.2、在拟南芥中开展候选基因的过表达验证，制备农杆菌感受态以及过表达载体，构建重组质粒并导入农杆菌，将农杆菌导入拟南芥中，经过培养后筛选拟南芥转基因纯合系盐处理后进行表型鉴定。
20.优选地，本发明还提供了一种基于lncrna测序的玉米耐盐基因在分子标记辅助选育耐盐玉米品种中的应用。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.本发明以玉米耐盐自交系lh196为材料，对其开展盐胁迫及对照下的链特异性转录组测序、lncrna测序及靶基因预测，通过二者联合分析初步确定耐盐候选基因，并对耐盐差异基因进行rt-qpcr表达分析，最后在拟南芥中开展功能验证，最终得到的玉米耐盐基因zm00001d010406位于8号染色体上113202370-113208725bp的位置区间；该基因可通过分子辅助育种转移到农艺性状优良的玉米材料，进而创制耐盐且农艺性状优良的玉米材料或品种。
附图说明
23.图1为本发明中盐胁迫下差异表达lncrna靶基因的rt-qpcr表达验证结果图；
24.图2为本发明中盐胁迫下两组拟南芥的表型差异对比图；
25.其中，wt为野生型拟南芥，oe为过表达基因zm00001d010406拟南芥株系，ck为对照组，salt为250mmol盐水处理组。
具体实施方式
26.下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.一种玉米耐盐基因，所述玉米耐盐基因为玉米耐盐基因zm00001d010406，且玉米耐盐基因zm00001d010406位于8号染色体。
28.其中，所述玉米耐盐基因zm00001d010406的cdna序列信息如下：
29.》zm00001d010406_t001 zm00001d010406_t001 cdna length:5684bp
30.atggggatggggcgatttgtaagcccaatcttttatttattcaggtttgaaccgtacttgaggaatgcatgcaagaggtttgcgttggagcaccgggctggcgagaaccgtgccccgctcatctcagatgatagccccaacaaagatatcaacattgctttctataacatcccgatgctgaaaaaactgagagagcttgggacagccgaaattggtaagctcacatcagtaatgggtgttgtgacacggacaagtgaagtgcggcctgaactattgcaaggaaccttcaaatgtctcgactgtgggaatgttgtgaagaatgtggagcagcagttcaagtacactgagccgataatatgcgttaatgcaacatgccagaacagaacaaaatgggcccttcttcgtcaggaaagcaaattcacagattggcagcgggtcagaatgcaggagacatcaaaagagatacccgctgggtcacttcctcgttcccttgatgtcattctgcggcatgagattgttgagaaggccagagctggggacacggttatatttactggaactgttgttgcagttcctgatgttatggcactaacttcacctggcgaacgagcagagtgtcgcagggaagctcctcagcgaaaaaacggaggtgttcaagaaggtgtaaagggcttgaagtcccttggagttagggatctgtcttatcgccttgcctttgtagcaaattcagtgcaggtcgcagatggtaggagagaagtggacatcagggaacgggacacagatggtgatgacagtgagagacagaaattcacagaagaagaggaagatgaagttgttaggatgaggaacactcctgatttctttaataagatagttgatagcatatgtcctaccgtatttggtcatcaagaaattaagagggccgtgcttcttatgcttttgggtggtgttcataagataacacatgaagggatcaaccttagaggtgacatcaatgtctgtattgttggtgacccaagctgtgcaaagtctcagttcctaaaatatactgctggtattgttccaagatctgtttacacgtcagggaagtcatcatcagctgctggtctgacagcaactgttgctaaagaaccagagactggtgaattctgtattgaggctggtgccctgatgctagctgataatggtgtttgttgtatcgatgaatttgataaaatggacattaaggatcaggtcgctatacatgaagcaatggaacagcaaacaattagcattaccaaagcaggaatacaggcaactttgaatgcacgaacatcaattttagctgcagcaaatccgaccggaggccgttatgacaagtcaaaaccacttaagtacaatgttgcattgcccccagctattctttcaagatttgatctggtctacatcatgatcgatgaacctgatgaaaacactgactaccacattgctcatcacattgtaagagtccatcagaaacgtgaagaagcacttgcccctgcatttagcaccgcacaactgaagcgttatatttcttttgcaaaatctttgaaacctcagcttagttcagaagcaaagaaagttctggtggagtcgtatgttacgcttcgtaggggggacagtactcctggaactagggttgcttataggatgacagttcggcaattggaagcattgattcggctgtcagaagctattgctcgaagccatttagaaagagttgtaagtatattaattcactttatcgtggatcatgttctcccagctcatgtccgcctggcagttaaattgctcaagacatccatcatcagtgttgagtcaagtgaagttgatctctctgacttccaagatgctgaagatggaacaaatgtaccttctgagagtgacgccggacagccagctgaagaagatgctgctcctcagcagcagggtgcagaaaatgaccaagcagcggataatggtaagaagaaattggtaataactgaagaacacttccagagagttactcaagctttggttatgagactaaggcagcatgaagagtcagtcaagaaagatggagatggtttagctggcatgaagcaaggggatcttatcatctggtatgttgagcagcagaatgccaaaggggcatatagttctactgcagaggtgaaggaagaagtgaagtgtatcaaggccattatagagagacttatacagcgggaaggccatcttatagtcattgacgaaggtactgcagccgcagccgaagatggcagtggcgcaaggagaacatcagagagtagaatactggcagttaacccgaactatgttattgattagcaacggcatcttaacatgctgttaacccaagccagttgatgtggttagctaactgaagctatgattctggtgatgtgtccgttgtgctctagagttgttgtaccatctccgtcactggtgtgctcgttccaagggagcacatgatctccaaaactacatactacgtttagtgatgcaggataattagcatctgtagtcttactaattttgacccgtgtttccctagtgaattttcgtagcaacagctttgatttatcagtcactgagtgctgcaattttctatttgctttctcaagttcaccctttgttgatccatctagatgggatcagagaatagctgtgctaatttatgttacaatgtcgcagaacccatttatttatttgattgctttgtg。
31.具体的，本发明以玉米耐盐自交系lh196为材料，对其开展盐胁迫及对照下的链特
异性转录组测序、lncrna测序及靶基因预测，通过二者联合分析初步确定耐盐候选基因，并对耐盐差异基因进行rt-qpcr表达分析，最后在拟南芥中开展功能验证。具体步骤如下：
32.参照图1-2，一种获得基于lncrna测序的玉米耐盐基因的发现方法，包括以下步骤：
33.步骤1、链特异性转录组测序
34.挑选整齐一致、颗粒饱满的lh196种子培养；将长势一致的去胚乳幼苗分成两组，一组为空白对照，一组为250mm nacl营养液培养组，持续处理10天；上述同样条件下培养玉米自交系lh196，然后分别用250mmol/l的盐处理和空白对照处理12h后，采取玉米的叶片，在液氮中冷冻然后保存在-80℃备用；利用试剂盒提取6个样品叶片中的rna，分别开展链特异性转录组测序；
35.使用链特异性建库方式开展lncrna测序，与普通的转录组建库方式相比，链特异性测序可以确定两条链的转录方向性，减少比对过程中的错误；其次，lncrna建库测序能得到更丰富的信息；lncrna建库属于mrna lncrna，只需要一次建库，就能同时获得mrna的数据以及lncrna的数据；
36.步骤2、差异表达基因鉴定和lncrna分析
37.鉴定差异表达基因：差异表达基因筛选；差异表达基因聚类分析；差异表达基因的功能注释；差异表达基因的go和kegg富集分析；差异表达基因蛋白互作网络；
38.lncrna分析：lncrna表达定量分析；lncrna差异表达分析；样品间lncrna相关性分析；cis作用差异lncrna靶基因注释富集分析；cis作用差异lncrna靶基因ppi分析；trans作用差异lncrna靶基因注释富集分析；trans作用差异lncrna靶基因ppi分析；
39.联合差异表达基因和lncrna靶基因预测，发掘共性基因作为玉米耐盐候选基因；
40.步骤3、耐盐基因的表达模式验证
41.步骤3.1、对于上述耐盐候选基因，利用primer5进行引物的设计并合成，将rna反转录为cdna，利用实时定量pcr进行表达模式验证；
42.步骤3.2、在拟南芥中开展候选基因的过表达验证，制备农杆菌感受态以及过表达载体，构建重组质粒并导入农杆菌，将农杆菌导入拟南芥中，经过培养后筛选拟南芥转基因纯合系盐处理后进行表型鉴定。
43.通过上述差异基因表达筛选，本技术共得到271个差异表达基因(deg)，其中有209个基因上调，62个基因下调。为了解这271个差异表达基因在玉米盐胁迫响应中的作用和参与的调控途径，本技术对其进行了go和kegg功能注释。本技术使用deseq2差异表达分析，通过筛选最终得到28个差异表达的lncrna。利用lnctar靶基因预测工具对本技术的lncrna进行靶基因预测。最终，得到基因zm00001d044416既是转录组测序结果的差异表达基因，也是lncrna(xloc_012826)的靶基因。该基因经过rt-qpcr表达分析(图1)和转拟南芥功能验证(图2)，表明其过表达能提高耐盐性。
44.综上所述，根据本发明获得的玉米耐盐基因zm00001d010406位于8号染色体上113202370-113208725bp的位置区间。该基因可通过分子辅助育种转移到农艺性状优良的玉米材料，进而创制耐盐且农艺性状优良的玉米材料或品种。
45.本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏
离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。