一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂及其制备方法

1.本发明属于微生物领域，涉及一种水产养殖用复合微生态菌剂，特别涉及一种用于提高水产动物免疫力的微生态菌剂。


背景技术：

2.我国是世界上的渔业大国，水产养殖产量雄居世界首位，我们不仅要保证水产品的生产量，更要注重水产品的质量。据不完全统计，全国水产养殖因病害损失达15-20％，损失量高达450-600万吨。因此，水产养殖病原菌拮抗微生物的筛选及益生菌剂生产应用，对于水生动物疾病防治和减少或不用抗生素具有关键的作用。益生菌剂的研制为水产养殖业朝着绿色健康养殖的方向发展提供了重要手段，为解决当前水产养殖生产中病害大量传播、抗生素肆意滥用、养殖环境恶化、病原耐药性加强、水产养殖动物药物残留、食品安全等系列问题具有重要意义，充分显示了利用微生态防治技术的优越性。
3.为解决好水产养殖业绿色发展面临的突出问题，有效控制由病原细菌引起的疾病的发生与流行，复合益生菌剂的研发对我国水产养殖业绿色发展具有重大而深远的意义。因此，开发研制水产养殖用复合微生态菌剂，从通过调节养殖水体的微生态平衡，实现通过微生物生态环境调节，控制环境中病原生物量，降低宿主应激反应及增强宿主抵抗力，同时净化水质，提高水产动物免疫力与抗病能力等技术手段，控制病害发生，降低发病率，减少死亡率，保护水环境，保障水产品质量安全，为水产养殖业健康可持续发展具有重要的应用前景。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种提高水产动物抗病力、降低水产养殖生产中由病原细菌所造成的危害、以满足水产养殖生产上的抗病需求的复合微生态菌剂。
5.本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的：
6.一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂，所述菌剂包括贝莱斯芽孢杆菌cpa1-1、乳酸乳球菌jmd3-5、中草药浸出液和β-环糊精。
7.进一步的，贝莱斯芽孢杆菌和乳酸乳球菌的比例为2:1。
8.进一步的，所述中草药包括五倍子、女贞子和甘草。
9.进一步的，五倍子、女贞子和甘草的比例为3:1:1。
10.进一步的，所述中草药浸出液的制备方法为：将中草药加入蒸馏水，置水浴煮沸30min后固液分离；再于中草药中加入蒸馏水，二次同样水浴30min后固液分离，将两次分离的液体混合。
11.本发明还提供上述提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂的制备方法，分别将贝莱斯芽孢杆菌和乳酸乳球菌种子菌液接种在lb液体培养基中，在37℃、120r/min条件下进行扩大培养并调节至贝莱斯芽孢杆菌、乳酸乳球菌的浓度为10
13
cfu/ml，将经过扩大培养的
贝莱斯芽孢杆菌和乳酸乳球菌菌液按照体积比2:1混合制成混合菌液，离心获得菌体；菌体用中草药浸出液稀释2倍，以5～8％的比例加入β-环糊精，喷雾干燥制得中草药与复合益生菌喷雾干粉。
12.进一步的，喷雾干燥时喷口温度设置为140℃。
13.本发明还提供上述菌剂在水体中抗非o1霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌中的应用。
14.本发明还提供上述菌剂在水产动物饲料添加剂中的应用，按5～10％的比例添加在水产动物饲料中。
15.进一步的，所述水产动物为河蟹和青虾。
16.本发明是一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂，其特点是：它由以下四种成分组成，
17.(1)具高抗菌活性的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)cpa1-1；
18.(2)具高抗菌活性的乳酸乳球菌(lactococcus lactis)jmd3-5；
19.(3)3味中草药浸出液；
20.(4)β-环糊精；
21.根据权利要求1所述的具高抗菌活性的贝莱斯芽孢杆菌cpa1-1，其特征在于，其具体制备步骤如下：
22.采集健康青虾，用无菌生理盐水冲洗多次，再用75％的酒精擦拭虾体表面，在无菌条件下，取青虾的肝胰腺、肌肉横切面划线于普通的营养琼脂平板上，28℃培养24h，肉眼观察菌落形态、大小、颜色等，挑取不同形态单菌落，采用点种法对分离菌进行初筛，以非01霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌作为指示菌进行复筛，筛选出抑菌圈大、抑菌普广、对多种病原细菌具有较强拮抗效果的菌株cpa1-1，通过形态学、生理生化特征以及16srrna和gyrb序列分析，筛选出功能菌株贝莱斯芽孢杆菌cpa1-1。用lb液体培养基发酵获得菌体。
23.根据权利要求1所述的具高抗菌活性的乳酸乳球菌jmd3-5，其特征在于，其具体制备步骤如下：
24.采集养殖青虾，用无菌生理盐水冲洗多次，无菌操作研磨制备成虾体组织悬液，灭菌生理盐水稀释，取虾体组织悬液及养殖池水样于mrs平板上划线分离；通过对非o1霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌等6种指示菌拮抗作用测定、形态学、生理生化特征以及16srrna序列分析，筛选出功能菌株乳酸乳球菌jmd3-5。用mrs液体培养基发酵获得菌体。
25.根据权利要求1所述的3味中草药浸出液，其特征在于，其具体制备步骤如下：对病原非o1霍乱弧菌xl1(最小杀菌浓度为2.0mg/ml)、嗜水气单胞菌g3、类志贺邻单胞菌sn1、弗氏柠檬酸杆菌lj1、维氏气单胞菌gyc1、副溶血弧菌jgb080708-1具有抑菌作用的五倍子，具有增强免疫作用的女贞子，具有解毒作用的甘草。3味中草药比例为3:1:1，加入蒸馏水，置水浴煮沸30min，取出(挤压)上清液存放。再于中草药中加入蒸馏水，二次同样水浴30min后取出(挤压)上清液。两次的上清液混合、并补足蒸馏水，3味中草药终浓度为0.2g/ml，作为3味中草药浸出液。
26.本发明还提供了提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂的制备方法，其特征在
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtcccgagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggtggt ttattaagtc tggtgtaaaa ggcagtggct caaccattgt atgcattgga aactggtaga cttgagtgca ggagaggaga gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaggaacacc ggtggcgaaa gcggctctct ggcctgtaac tgacactgag gctcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaga tgtagggagc tataagttct ctgtatcgca gctaacgcaa taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact cgtgctattc ctagagatag gaagttcctt cgggacacgg gatacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccctattg ttagttgcca tcattaagtt gggcactcta acgagactgc cggtgataaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagtcgcga gacagtgatg tttagctaat ctcttaaaac cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag cacgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgggagtt gggagtaccc gaagttggtt gcctaaccgc aaggagggcg ctacctaagg tagaccgatc gc
32.表1菌株genebank中登录号
[0033][0034]
菌株cpa1-1、jmd3-5、xl1、g3、sn1、lj1、gyc1、jgb080708-1为公知公用材料，现保存在扬州大学动物科学与技术学院水产动物病害实验室，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，扬州大学动物科学与技术学院水产动物病害实验室可对外发放。
[0035]
本发明的一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂的使用方法如下：可按5％-10％的比例添加在饲料中投喂使用。提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂，不仅具有良好的抗病作用，而且使用方便。
[0036]
有益效果
[0037]
贝莱斯芽孢杆菌和乳酸乳球菌均对非o1霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌具有较强拮抗效果；3味中草药浸出液中的五倍子对多种病原细菌具有较好的抑制效果，具有使水产养殖动物降低或免受病原细菌感染的作用，女贞子具有增强免疫力的作用，干草具有解毒作用；β-环糊精主要是使贝莱斯芽孢杆菌、乳酸乳球菌和中草药浸出液混合物起到粘合及缓释作用。该复合微生态菌剂将所
获得的浓度为10
13
cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌、乳酸乳球菌，离心获得菌体，菌体用上述权利3所述3味中草药浸出液稀释2倍，含量在80％以上的β-环糊精5～8％，喷口温度设置为140℃，喷雾干燥制得复合微生态菌剂喷雾干粉，该添加剂按5～10％与市售配合饲料混合，能预防与治疗多种病原细菌引起的水产养殖动物疾病，提高养殖动物抗病能力，增加水产养殖产量，减少抗生素的使用，显著地提高水产养殖生产的经济效益。
[0038]
本发明一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂，能增强水产养殖动物对非o1霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、维氏气单胞菌及副溶血弧菌等多种病原细菌的抵抗力，提高养殖的成活率，增加水产养殖生产的经济效益，以解决目前水产养殖生产过程中易发生由细菌引起的病害问题。
具体实施方式
[0039]
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
[0040]
实施例1
[0041]
一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂，其特点是：它由以下四种成分组成，
[0042]
(1)具高抗菌活性的贝莱斯芽孢杆菌cpa1-1；
[0043]
(2)具高抗菌活性的乳酸乳球菌jmd3-5；
[0044]
(3)3味中草药浸出液；
[0045]
(4)β-环糊精；
[0046]
具高抗菌活性的贝莱斯芽孢杆菌cpa1-1，其特征在于，其具体制备步骤如下：
[0047]
采集健康青虾，用无菌生理盐水冲洗多次，再用75％的酒精擦拭虾体表面，在无菌条件下，取青虾的肝胰腺、肌肉横切面划线于普通的营养琼脂平板上，28℃培养24h，肉眼观察菌落形态、大小、颜色等，挑取不同形态单菌落，采用点种法对分离菌进行初筛，以非o1霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌作为指示菌进行复筛，筛选出抑菌圈大、抑菌普广、对多种病原细菌具有较强拮抗效果的菌株cpa1-1，通过形态学、生理生化特征以及16srrna和gyrb序列分析，筛选出功能菌株贝莱斯芽孢杆菌cpa1-1。用lb液体培养基发酵获得菌体。
[0048]
高抗菌活性的乳酸乳球菌jmd3-5，其特征在于，其具体制备步骤如下：
[0049]
采集养殖青虾，用无菌生理盐水冲洗多次，无菌操作研磨制备成虾体组织悬液，灭菌生理盐水稀释，取虾体组织悬液及养殖池水样于mrs平板上划线分离；通过对非o1霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、维氏气单胞菌、副溶血弧菌等6种指示菌拮抗作用测定、形态学、生理生化特征以及16srrna序列分析，筛选出功能菌株乳酸乳球菌jmd3-5。用mrs液体培养基发酵获得菌体。
[0050]
3味中草药浸出液，其特征在于，其具体制备步骤如下：对病原非o1霍乱弧菌xl1(最小杀菌浓度为2.0mg/ml)、嗜水气单胞菌g3、类志贺邻单胞菌sn1、弗氏柠檬酸杆菌lj1、维氏气单胞菌gyc1、副溶血弧菌jgb080708-1具有抑菌作用的五倍子，具有增强免疫作用的女贞子，具有解毒作用的干草。3味中草药比例为3:1:1，加入蒸馏水，置水浴煮沸30min，取出(挤压)上清液存放。再于中草药中加入蒸馏水，二次同样水浴30min后取出(挤压)上清液。两次的上清液混合、并补足蒸馏水，3味中草药终浓度为0.2g/ml，作为3味中草药浸出
液。
[0051]
实施例2
[0052]
一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂的制备方法，其特征在于，其制备步骤如下：分别将贝莱斯芽孢杆菌和乳酸乳球菌种子菌液接种在lb液体培养基中，在37℃、120r/min条件下进行扩大培养并调节至贝莱斯芽孢杆菌、乳酸乳球菌的浓度为10
13
cfu/ml，将经过扩大培养的贝莱斯芽孢杆菌和乳酸乳球菌菌液按照体积比2:1混合制成混合菌液，离心获得菌体；菌体用上述权利3所述3味中草药浸出液稀释2倍，含量在80％以上的β-环糊精5～8％，喷口温度设置为140℃，喷雾干燥制得中草药与复合益生菌喷雾干粉。
[0053]
实施例3
[0054]
一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂投喂方法，其特征在于，其使用步骤如下：
[0055]
鱼及虾蟹等水生动物投喂本发明提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂，按5％至10％的比例添加在配合饲料中。
[0056]
实施例4
[0057]
实施例2制得的一种提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂的应用实验及其结果。
[0058]
实验时间：2019年5月。
[0059]
实验地点：江苏省扬州大学水产动物病害实验室与养殖温室。
[0060]
实验动物：河蟹与青虾。
[0061]
(1)使用提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂。使用时以所获得的浓度为10
13
cfu/ml的贝莱斯芽孢杆菌、乳酸乳球菌，离心获得菌体，菌体用上述权利3所述3味中草药浸出液稀释2倍，含量在80％以上的β-环糊精5～8％，喷口温度设置为140℃，喷雾干燥制得复合微生态菌剂喷雾干粉。
[0062]
(2)实验组青虾(3个平行组，各100尾)投喂本发明提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂按8％混合到市售配合饲料；对照组青虾(100尾)投喂市售配合饲料。
[0063]
(3)实验组河蟹(3个平行组，各50只)投喂本发明提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂按8％混合到市售配合饲料；对照组河蟹(50只)投喂市售配合饲料。
[0064]
(4)投喂2d后，分别对实验组与对照组的青虾及河蟹进行保护力检验。用非o1霍乱弧菌xl1分别对实验组和对照组的青虾进行浸浴感染，水体中细菌终浓度达到5.8
×
107cfu/ml；用弗氏柠檬酸杆菌lj1分别对实验组和对照组的河蟹进行浸浴感染，水体中菌体终浓度达到3.4
×
107cfu/ml。试验期间继续按上述(2)进行投喂，试验期为一周。
[0065]
(5)实验结果：实验组青虾投喂实验例2所述的本发明提高水产动物免疫力的复合微生态菌剂，按8％混合到市售配合饲料，实验青虾用非o1霍乱弧菌xl1菌液进行浸浴感染，感染一周后存活率达82％，投喂市售配合饲料对照组青虾存活率为34％，并且投喂复合微生态菌剂试验组青虾血淋巴和肝胰腺中碱性磷酸酶、酸性磷酸酶以及超氧化物歧化酶活性显著提高；实验河蟹用用弗氏柠檬酸杆菌lj1进行浸浴感染，感染一周后存活率达86％，投喂市售配合饲料对照组青虾存活率为38％，并且投喂复合微生态菌剂试验组河蟹肝胰腺、血淋巴以及鳃组织中抗菌肽crustin1、crustin2、转录因子relish、relish、丝裂原活化蛋白激酶p38以及血蓝蛋白hemocyanin免疫相关基因表达量显著上调表达。实验结果表明提
高水产动物免疫力的复合微生态菌剂可使青虾与河蟹获得较高的抗病原细菌感染的能力。