测定呕吐毒素浓度的方法及其应用与流程

1.本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种测定呕吐毒素浓度的方法及其应用。


背景技术：

2.呕吐毒素(vomitoxin)，又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，don)，是一种无色针状结晶，熔点为151-152℃，具有较强的热抗力，121℃高压加热25min仅少量破坏。呕吐毒素是由镰刀菌属(fusarium)产生的毒性代谢产物，属于单端孢霉烯族化合物。镰刀菌属通常在作物生长期间就感染，其最适生长温度为5-25℃，最适生存环境为长江以北大部分地区。呕吐毒素多分布于小麦、大麦、玉米等谷物籽实中，在谷物和饲料中检出率极高，是在黄曲霉毒素之后污染最严重的霉菌毒素。因此开发有效检测呕吐毒素的方法对于谷物和饲料尤其重要。
3.呕吐毒素等真菌毒素检测方法目前主要以快速、半定量的胶体金试纸条、酶联免疫试剂盒法，以及精确度更高的免疫亲和柱-高效液相色谱法、液质联用法为主，其中前者操作便捷且检测成本较低，但无法实现真菌毒素的精准定量检测，而后者虽然可以对真菌毒素进行精确定量，但因为其操作复杂、成本较高的特点，无法应用于高通量检测及一线生产单位的检测工作。因此，开发一种快速、操作简单的低成本的高通量检测方法，对于下游菌株筛选及真菌毒素脱除技术开发具有重要的意义。
4.综上所述，现有的don检测方法均有各自的缺陷，因此有必要寻找一种准确性较低、高效、操作简单的测定呕吐毒素浓度的方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服呕吐毒素检测及生物降解过程中存在的上述缺陷，提供一种呕吐毒素浓度的测定方法及其应用。
6.为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种呕吐毒素浓度的测定方法，该方法包括：将待测样品进行质谱检测，再根据m/z＝319.1附近的峰值计算待测样品中呕吐毒素的浓度。
7.本发明第二方面提供一种呕吐毒素降解酶的酶活力的测定方法，该方法包括以下步骤：
8.将呕吐毒素降解酶与已知量的呕吐毒素接触进行反应，所得反应产物按照第一方面所述的方法测定呕吐毒素的浓度，从而计算呕吐毒素的降解率。
9.本发明第三方面提供一种呕吐毒素降解菌的筛选方法，该方法包括以下步骤：
10.(a)诱导呕吐毒素降解菌表达呕吐毒素降解酶，获得发酵产物；
11.(b)分离发酵产物中的菌体，并使菌体裂解，得到含有呕吐毒素降解酶的粗酶液；
12.(c)将所述粗酶液与已知量的呕吐毒素接触进行反应，所得反应产物按照第一方面所述的方法测定呕吐毒素的浓度，从而获得粗酶液对呕吐毒素的降解率；
13.(d)根据步骤(c)得到的降解率筛选得到酶活力较高的呕吐毒素降解菌。
14.通过上述技术方案，本发明能够简单、准确、高效的检测呕吐毒素。基于本发明的检测方法，可以进一步定向的、高通量的、快速的、原料简单的筛选出具有不同性能(比如耐高温性、耐酸性和耐碱性等)的呕吐毒素降解酶和呕吐毒素降解菌，从而有利于通过合适的微生物针对性的解决don的污染问题，有效脱除don。
附图说明
15.图1是呕吐毒素浓度测定过程中绘制的标准曲线；
16.图2是呕吐毒素降解酶的酶活力测定过程中绘制的标准曲线；
17.图3是同位素内标质谱检测信号峰图谱。
具体实施方式
18.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
19.在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的ppm浓度(parts per million)是用溶质质量占全部溶液质量的百万分比来表示的浓度，也称百万分比浓度。dhb为2,5-二羟基苯甲酸，又称龙胆酸。
20.本发明的发明人发现，质谱检测所得的m/z＝319.1附近的峰值与呕吐毒素的浓度呈正相关，因此，本发明第一方面提供一种呕吐毒素浓度的测定方法，其中，该方法包括：将待测样品进行质谱检测，再根据m/z＝319.1附近的峰值计算待测样品中呕吐毒素的浓度。本发明中，“m/z＝319.1附近的峰值”是指质荷比(mass-to-charge ratio)≈319.1(319.1
±
0.02)处的峰强度(绝对丰度)。
21.根据本发明的方法，所述质谱检测使用的基质优选为dhb、叠氮化钠、金刚石粉末和肼中的至少一种。
22.根据本发明的方法，质谱检测使用的基质溶液中的溶剂可以为本领域常见的各种溶剂，但优选情况下，质谱检测使用的基质溶液中的溶剂选自甲醇、乙腈和乙酸乙酯中的至少一种，更优选为色谱级乙腈。
23.根据本发明更优选的实施方式，所述质谱检测使用的基质溶液优选为叠氮化钠终浓度为1-20mg/ml(如1、3、5、7、9、11、13、15、17、19mg/ml或上述数值之间的任意值)的叠氮化钠乙腈溶液。采用该优选实施方式中的基质溶液能够检测到更大的峰值，以便更准确地测定呕吐毒素的浓度。
24.根据本发明，可以采用回归方程的方式计算呕吐毒素的浓度，优选情况下，所述方法包括以下步骤：
25.(1)使用第一有机溶剂将呕吐毒素标准样品配制成不同浓度梯度的呕吐毒素第一标准溶液；
26.(2)将第二有机溶剂(即质谱检测使用的基质溶液中的溶剂)与基质混合配制基质溶液；
27.(3)在靶板上滴加呕吐毒素第一标准溶液和基质溶液，上机进行质谱检测，以质谱
检测所得的m/z＝319.1附近的峰值作为纵坐标，呕吐毒素第一标准溶液中呕吐毒素的浓度作为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程；
28.(4)在靶板上滴加待测样品和基质溶液，上机进行质谱检测获得m/z＝319.1附近的峰值y，将y值代入线性方程计算得到待测样品中呕吐毒素的浓度。根据本发明的方法，所述的呕吐毒素标准样品优选为don。以重量计，所述不同浓度梯度的呕吐毒素第一标准溶液中呕吐毒素的重量浓度范围为0.01-100ppm，优选为0.1-20ppm。
29.根据本发明的方法，所述第一有机溶剂可以为本领域常见的溶剂，所述第一有机溶剂可以为甲醇、乙腈和乙酸乙酯中的至少一种，优选为色谱纯的甲醇。
30.根据本发明的方法，为了使测定结果更准确，所述呕吐毒素第一标准溶液和待测样品中还可以含有(同位素)内标，内标优选为is-don。优选地，内标(在呕吐毒素第一标准溶液或待测样品中)的重量浓度范围为0.1-100ppm，更优选为2-10ppm。
31.根据本发明的方法，以质谱法测定时，每个靶板空位上基质和样品(呕吐毒素第一标准溶液、待测样品和基质溶液)的添加量可以各自独立地为0.1-10μl，优选为0.1-5μl。所述点样方式可以为：先将基质溶液点到靶板上，干燥后形成薄层，再将标准溶液和基质预混合，点靶，干燥后形成薄层，再点一层基质溶液。
32.根据本发明的方法，所述质谱检测的条件包括：
33.正离子模式，采样点移动方式选择随机部分样本(random-partial sample)，极限直径(limit diameter)选择2000μm，基质抑制(matrix suppression)选择160m/z，质量范围(mass range)选择200-400m/z。
34.根据本发明的方法，所述质谱法为maldi-tof/tof质谱检测法。
35.根据本发明的方法，所述质谱检测优选在基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱仪进行。所述质谱仪可以通过商购获得，优选为购自bruker公司的rapiflex maldi-tof/tof。
36.本发明第二方面提供一种测定呕吐毒素降解酶的酶活力的方法，该方法包括以下步骤：
37.将呕吐毒素降解酶与已知量的呕吐毒素接触进行反应，所得反应产物按照第一方面中所述的方法测定呕吐毒素的浓度，从而计算呕吐毒素的降解率。根据降解率即可获知呕吐毒素降解酶的酶活力。
38.本发明中，所述接触的条件包括：ph为3-8，温度为37-50℃，反应时间2-24h。
39.本发明中，为了便于控制接触体系的ph，所述接触体系还可以含有缓冲剂，所述缓冲剂可以为本领域常见的用于稳定ph的各种缓冲剂，例如柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液和乙酸缓冲液等。
40.所述接触体系中缓冲剂的浓度可以为10-100mm，可以根据需要进行调整。
41.本发明中，呕吐毒素降解酶的酶活力以呕吐毒素的降解率来表示。以don(％)表征呕吐毒素降解酶的酶活力，并按照下式计算：don的降解率(％)＝(处理前样品中don的质量-处理后样品中don的质量)/处理前样品中don的质量
×
100％。
42.本发明中，所述呕吐毒素可以以呕吐毒素溶液的形式与呕吐毒素降解酶接触，以重量计，所述呕吐毒素溶液中呕吐毒素的含量可以为0.01-100ppm，更优选为0.1-10ppm。
43.本发明中，可以理解的是，所述呕吐毒素降解酶可以为固态或液态的酶制剂，例如
粗酶液，如果是固态的酶制剂，可以使用ph缓冲液将其配制为待测液的形式与呕吐毒素接触进行反应。
44.在本发明的优选实施方式中，采用回归过程的方式测定呕吐毒素的浓度。
45.本发明第三方面提供一种呕吐毒素降解菌的筛选方法，该方法包括以下步骤：
46.(a)诱导呕吐毒素降解菌表达呕吐毒素降解酶，获得发酵产物；
47.(b)分离发酵产物中的菌体，并使菌体裂解，得到含有呕吐毒素降解酶的粗酶液；
48.(c)将所述粗酶液与已知量的呕吐毒素接触进行反应，所得反应产物按照第一方面所述的方法测定呕吐毒素的浓度，从而获得粗酶液对呕吐毒素的降解率；
49.(d)根据步骤(c)得到的降解率筛选得到酶活力较高的呕吐毒素降解菌。
50.根据本发明，步骤(a)中，可以采用常规的方法诱导呕吐毒素降解菌表达呕吐毒素降解酶，在此不再赘述。
51.根据本发明的方法，分离菌体的方法为：通过离心、超滤和硫酸铵沉淀法中的至少一种。
52.本发明中，对菌体进行裂解，得到粗酶液。所述裂解的方式通过超声破碎和、或添加溶菌酶(溶菌酶的浓度可以为1-10mg/ml发酵产物)的至少一种方法进行处理。
53.以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，don标准品和don同位素内标(c13)购自sigma；质谱检测使用的质谱仪为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(bruker公司的rapiflex maldi-tof/tof)；所述质谱检测的条件包括：
54.以正离子模式采集，用don标准品校准，采样点移动方式选择随机部分样本，极限直径选择2000μm，基质抑制选择160m/z，质量范围选择200-400m/z。
55.实施例1
56.使用50体积％的乙腈水溶液和50体积％的甲醇水溶液分别溶解基质dhb(终浓度为20mg/ml)和叠氮化钠(终浓度为10mg/ml)作为基质溶液，对200ppm的don标准品进行质谱检测。点样方法为：先将1μl基质溶液点到靶板上，干燥后形成薄层，再将1μl待测样品和基质预混合，点靶，干燥后形成薄层，再点一层基质溶液(1μl)，自然晾干后，上机检测。结果如下表1所示：
57.表1
[0058][0059][0060]
根据结果，选用叠氮化钠为基质，50体积％乙腈水溶液为基质溶剂。为了增加don检测的响应，对基质的配方进行了优化。分别使用50体积％，70体积％，90体积％和100％的
乙腈作为基质溶剂，叠氮化钠终浓度为10mg/ml。点样及检测方法同上。结果如表2所示：
[0061]
表2
[0062]
基质溶液m/z＝319.1附近的峰值a：叠氮化钠 50体积％乙腈水溶液9568b：叠氮化钠 70体积％乙腈水溶液12685c：叠氮化钠 90体积％乙腈水溶液14493d：叠氮化钠 100％乙腈15027
[0063]
实施例2
[0064]
本实施例用于说明don浓度的测定方法
[0065]
取2.5μl 10mg/ml的叠氮化钠溶液(溶剂为100％乙腈)作为基质。取2.5μl呕吐毒素标准品进行质谱检测(点样方法同实施例1)，每组三个平行，制作标准曲线。呕吐毒素标准品由don母液用色谱级甲醇分别稀释至1ppm、2ppm、2.5ppm、5ppm、10ppm和20ppm。
[0066]
绘制的标准曲线见图1，y＝8.8088x 2.8115。其中，x为don浓度(单位ppm)，y为m/z＝319.1附近的峰值，r2值达0.9958。
[0067]
本发明所述的方法获得的标准曲线显示don浓度与质谱检测峰值有着良好的相关性，r2值达0.9958。因此，采用本发明的方法能够用于测定don的浓度。
[0068]
实施例3
[0069]
本实施例用于说明don降解酶的酶活力的测定方式
[0070]
(1)标准曲线的绘制
[0071]
全基因合成来源于镰刀菌的tri201基因(fusarium fujikuroi strain f4n17,genbank登录号hq149742.1)，构建质粒pet30a-tri201，转化至大肠杆菌bl21，构建重组菌株bl21/pet30-tri201，记为出发菌株。
[0072]
取甘油保存的重组菌株bl21/pet30-tri201在lb培养基中，37℃过夜活化，接种至预先分装lb培养基的24孔深孔板中，封透气膜后于37℃、200rpm摇床培养4h培养，加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至终浓度1mm，降温至25℃诱导18h。取菌液400rpm离心20min去上清后，加入500μl裂解液(含溶菌酶5mg/ml)，重悬后于30℃、1000rpm裂解2h获得粗酶液。
[0073]
取5μl粗酶液及100μl色谱级甲醇与90μl柠檬酸缓冲液(ph5.5)混合。然后，加入5μl不同浓度的don母液，使体系中don终浓度分别为0.1ppm、0.5ppm、1ppm、2.5ppm、5ppm和10ppm，40℃过夜反应，质谱检测m/z＝319.1附近的峰值并制作标准曲线。绘制的标准曲线见图2，y＝4.2438x-0.8631，其中，x为don浓度(单位ppm)，y为峰值，r2值达0.9902。本发明所述的方法获得的标准曲线显示don浓度与质谱峰值有着良好的相关性，r2值达0.9902。因此，采用本发明的方法能够用于测定don降解酶的酶活力。
[0074]
(2)重组菌株bl21/pet30-tri201中呕吐毒素降解酶活力的测定
[0075]
取20μl粗酶液及1μl 100ppm don母液加入到每孔装有79μl柠檬酸缓冲液(ph5.5)的反应体系中，于40℃过夜反应后终止反应，得到待测液，对待测液进行质谱检测，点样及检测方法同实施例2。计算得到don的降解率为50.58
±
2.33％，而通过hplc检测得到降解率为51.47
±
3.07％，说明本发明的质谱方法具有较高的准确性。
[0076]
实施例4
[0077]
选取5ppm浓度的don标准品，并在其中分别添加5ppm、4ppm、3ppm、2ppm、1ppm的don同位素内标，按照实施例2的方式进行质谱检测。结果如图3(从上往下don:is浓度依次增加为：0ppm，1ppm，2ppm，3ppm，4ppm，5ppm)所示。
[0078]
通过表1和表2的结果可以看出，基质10mg/ml叠氮化钠(基质溶剂为100体积％乙腈)可以对200ppm的标准品检测到较高峰值，而峰值越大，峰信号强度越强，越便于检测不同浓度(更低浓度)的范围。因此，采用本发明优选的基质溶液能够更准确地测定呕吐毒素的浓度。
[0079]
通过图1的结果可以看出，采用本发明第一方面所述方法的实施例2获得的标准曲线显示don浓度与质谱检测峰值(m/z＝319.1附近的峰值)有着良好的相关性。说明，本发明所述的方法能够用于检测呕吐毒素。
[0080]
通过图3的结果可以看出，随着同位素内标添加量的降低，don和内标的峰高比例呈增大的趋势，在标准品体系中，2ppm的同位素内标可以检测到很好的峰。但由于酶解体系中存在更多的背景干扰，因此建议后续实验添加终浓度为10ppm内标进行实验，is-don出峰信号稳定可以使don定量更准确，更有利于质控。
[0081]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。