一种禽类组织中六类兽药抗生素的碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒及其检测方法与流程

1.本发明涉及小分子待测物碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒及其检测方法，属于免疫检测技术领域。


背景技术：

2.在纳米技术的推动下，半导体量子点(qds)、上转换纳米材料(ucnps)以及长余辉纳米材料等荧光材料已应用于荧光淬灭免疫分析方法的建立以满足不同分析需求。但qds重金属毒性大以及ucnps荧光种类少等问题成为了二者关键性的限制因素。碳量子点(cds)作为一类具有优异光致发光性能的零维(od)纳米材料，是继半导体量子点成功合成以来被广泛研究的荧光纳米材料。于2004年被首次提出的cds的元素组成与传统的量子点不同，传统的量子点通常由重金属核组成。cds基本上不含金属元素，具有低毒性的优势。另外，其通常显示出与尺寸和激发波长相关的光致发光(pl)行为，并且可以达到与传统半导体量子点(qds)所达到的pl水平相近的pl水平。同时，因 cds表现出良好的水溶性和生物相容性，其在生物传感和生物成像领域被作为qd的绿色替代品而引起了广泛的关注。此外，cds还表现出优异的抗光漂白性能，廉价且易于制造。因此，cds被认为是生物荧光领域中的新型通用材料。mintz等人利用碳量子点 (cds)和金纳米颗粒(aunps)之间的能量转移，通过由于能量转移引起的c点荧光猝灭程度实现了对α
‑
岩藻糖苷酶3.4μnm的高灵敏检测；dong等人基于荧光內滤效应，通过辣根过氧化物酶/碱性磷酸酶的酶促产物淬灭cds荧光，将常规elisa的吸收信号转换为荧光信号实现了鸡肉样品中0.02ng/ml金刚烷胺的高灵敏检测分析。以上报道均表明，cds具有成为高灵敏度荧光供体探针及实现高灵敏快速检测分析的能力。
3.基于此，通过简单的方法在水溶液环境中制备了碳量子点，并建立了快速，高灵敏度的荧光免疫快速检测试剂盒。目前，基于禽类组织中六类兽药抗生素综合前处理的碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒还未见报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明提供了用于动物源性食品中待测物检测的碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒及其检测方法，为了实现上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
5.一种禽类组织中六类兽药抗生素综合前处理的碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒，包括盒体，设在盒体内的反应杯和设在盒体内的试剂；其中所述反应杯包括分别包被有呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、氯霉素和氟苯尼考包被抗原的反应杯各100 个，所述试剂包括：呋喃它酮辣根过氧化物酶标记抗体工作液、呋喃西林辣根过氧化物酶标记抗体工作液、呋喃妥因辣根过氧化物酶标记抗体工作液、呋喃唑酮辣根过氧化物酶标记抗体工作液、氯霉素辣根过氧化物酶标记抗体工作液和氟苯尼考辣根过氧化物酶标记抗体工作液；呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、氯霉素和氟苯尼考系列标准溶液；浓缩酸性样品提取液ⅰ；浓缩碱性样品提取液ⅱ；2
‑
硝基苯甲醛衍生化试剂； 20倍浓缩磷酸盐洗涤
液；10倍浓缩磷酸盐复溶液；碳量子点荧光反应液a及碳量子点荧光反应液b。
6.优选的，碳量子点荧光反应液a包含过氧化氢和碳量子点，碳量子点荧光反应液b 包含3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺和碳量子点。
7.碳量子点的制备包括如下步骤：
8.(1)碳量子点的合成：将3g柠檬酸和5g尿素添加到10ml超纯水中以形成透明溶液，然后将溶液在800w微波炉中加热5分钟，在此期间溶液从无色液体变为棕色，最后变为暗褐色的簇状固体，冷却至室温后，加入20ml水以溶解产物；
9.(2)碳量子点的纯化：将溶解后的产物于5000rpm离心10min后，装入3500da 透析袋，常温下用水透析过夜，得到棕色具有荧光的溶液，在365nm激发光激发下，在400nm
‑
600nm处有荧光。
10.所述反应杯为容积为300μl或500μl或其他容积的单孔或8联反应杯，所述呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、氯霉素和氟苯尼考系列标准溶液分别是从呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、氯霉素和氟苯尼考纯品中稀释得到。
11.一种禽类组织中六类兽药抗生素的碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测待测物的方法，其特征是，分别向呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、氯霉素和氟苯尼考反应杯中加入对应标准溶液或综合前处理后的样品复溶液和对应的酶标记抗体，37℃温育20min后洗涤，加入荧光反应液a和荧光反应液b，37℃温育10min后检测荧光值，以加入不同浓度待测物标准品的荧光值求抑制率，以抑制率为纵坐标，待测物标准品浓度的对数为横坐标作标准曲线，检测限、灵敏度即抑制率为50％时所对应的待测物浓度(ic
50
)能从标准曲线上读出，所述荧光值是在365nm激发波长下用荧光检测仪测定各反应杯在560nm处的荧光值。
12.优选的，所述综合前处理后的样品复溶液得到步骤如下：(1)称取2.0g样品至50ml 离心管中，加入5ml酸性样本提取液i，150μl2
‑
硝基苯甲醛衍生化试剂，涡旋震荡5min； (2)放置75
‑
80℃水浴锅中避光孵育15min，取出冷却至室温，加入5ml碱性提取液ii 和8ml乙酸乙酯，涡旋震荡5min，4000rpm，5min取离心后上清液2ml到5ml离心管中，60℃空气吹干(10
‑
15min)；(3)加入2ml正己烷和1ml磷酸盐复溶液，涡旋 10s，4000rpm，3min；(4)取下层待测。
13.所述试剂盒抑制率计算方法，抑制率(％)＝(f
x
‑
f0)/(f0‑
f
b
)
×
100％，其中f0为检测不含待测物的标准溶液时反应杯的检测荧光值，f
x
为检测含有待测物的标准溶液或待测样品溶液时反应杯的检测荧光值，f
b
为未添加待测物标准溶液或待测样品时反应杯的检测荧光值，以加入不同浓度待测物标准品的荧光值求抑制率，以抑制率为纵坐标，待测物标准品浓度的对数为横坐标作标准曲线，检测限以及灵敏度即抑制率为50％时所对应的待测物浓度(ic
50
)可以从标准曲线上读出；每一个样品的浓度可以通过样品测定荧光值计算抑制率，并根据抑制率从标准曲线上读出。
14.优选的，试剂盒对呋喃它酮检测灵敏度为0.12ng/ml；呋喃西林检测灵敏度为0.05 ng/ml；呋喃妥因检测灵敏度为0.35ng/ml；呋喃唑酮检测灵敏度为0.25ng/ml；氯霉素检测灵敏度为0.12ng/ml；氟苯尼考检测灵敏度为0.1ng/ml。
15.优选的，所述荧光值是在365nm激发波长下用荧光检测仪测定各反应杯在560nm 处的荧光值。
16.与现有国内外小分子物质免疫吸附检测技术相比，本发明具有以下突出的优点：
17.1、本发明利用碳量子点荧光信号代替酶联免疫分析的比色信号，实现待测物的高灵敏度荧光免疫检测分析；
18.2、本发明试剂盒统一了六种目标物的前处理过程，通过一个处理过程得到的待测物的溶液可以用于测定六种成分，不用单独处理，节约了检测时间，也降低了成本结约了人力。
19.3、本发明试剂盒内的反应杯的数量可以根据检测需要选择数量，可在1h内完成100 个样品中六种目标物的同时快速检测分析，适用于大量样品的快速筛选，可作为食品中小分子待测物快速检测的有效筛检手段。
附图说明
20.构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
21.图1为本发明碳量子点的荧光图谱。
22.图2为酶联免疫分析及碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测呋喃它酮结果图。
23.图3为酶联免疫分析及碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测呋喃西林结果图。
24.图4为酶联免疫分析及碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测呋喃妥因结果图。
25.图5为酶联免疫分析及碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测呋喃唑酮结果图。
26.图6为酶联免疫分析及碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测氯霉素结果图。
27.图7为酶联免疫分析及碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测氟苯尼考结果图。
具体实施方式
28.下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造，但所举实例不作为对本发明的限定。
29.实施例l(制备实施例)
30.碳量子点制备
31.(1)碳量子点的合成：将3g柠檬酸和5g尿素添加到10ml超纯水中以形成透明溶液。然后将溶液在800w微波炉中加热5分钟，在此期间溶液从无色液体变为棕色，最后变为暗褐色的簇状固体。冷却至室温后，加入20ml水以溶解产物。
32.(2)碳量子点的纯化：将溶解后的产物于5000rpm离心10min后，装入3500da透析袋，常温下用水透析过夜，得到棕色具有荧光的溶液，荧光光谱如图1所示，在365nm 激发光激发下，在400nm
‑
600nm处有荧光。
33.实施例2(制备实施例)
34.(1)包被抗原：用ph 9.6碳酸钠缓冲液将呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、氯霉素和氟苯尼考包被抗原稀释至0.25、0.25、0.25、0.25、0.5和0.5μg/ml，取100
‑
300 μl加入到相应的反应杯中，4℃孵育过夜。
35.(2)洗涤反应杯：次日弃掉反应液后加入200
‑
500μl磷酸盐洗涤液，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将反应杯在滤纸上拍干。
36.(3)封闭：向反应杯中加入200μl酪蛋白封闭液，37℃下孵育1.5h，弃掉酪蛋白封闭
液，真空密封后在4℃保存。
37.实施例3(应用实施例)
38.碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒的使用技术
39.(1)加标准品溶液和辣根过氧化物酶标记抗体工作液：将100μl含有一定浓度待测物的标准品稀释液加入包被有对应待测物包被抗原的反应杯后将100μl待测物对应的酶标记抗体混合物加入各反应杯，每个浓度两个平行，37℃下孵育20min，弃掉反应液后加入200
‑
500μl磷酸盐洗涤液，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将板在滤纸上拍干。
40.(2)显色：向各反应杯中加入碳量子点荧光反应液a和碳量子点荧光反应液b各50 μl，37℃下显色10min。
41.(3)荧光读数：在365nm激发波长下用荧光检测仪测定各反应杯在560nm处的荧光值。
42.2.结果判定
43.本发明所述碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒以待测物结合酶标记抗体抑制底物氧化从而导致荧光恢复，待测反应杯中溶液在365nm激发下，560nm处的荧光强度值随待测样品中待测物含量增加而增加。结果判断标准：抑制率的计算公式为：抑制率 (％)＝(f
x
‑
f0)/(f0‑
f
b
)
×
100％，f0为测定不含待测物的标准溶液时反应杯的检测荧光值，f
x
为检测含有待测物的标准溶液时反应杯的检测荧光值，f
b
为未添加待测物标准溶液时反应杯的检测荧光值，以抑制率为纵坐标，待测物浓度的对数为横坐标作标准曲线，灵敏度即抑制率为50％时所对应的待测物浓度(ic
50
)可以从标准曲线上读出。如图2
‑
图7 所示，本发明所述方法对呋喃它酮检测灵敏度为0.12ng/ml；呋喃西林检测灵敏度为0.18 ng/ml；呋喃妥因检测灵敏度为0.35ng/ml；呋喃唑酮检测灵敏度为0.25ng/ml；氯霉素检测灵敏度为0.12ng/ml；氟苯尼考检测灵敏度为0.032ng/ml。
44.实施例4(应用实施例)
45.酶联免疫检测方法的使用
46.1.检测步骤
47.(1)加标准品溶液和辣根过氧化物酶标记抗体工作液：将100μl含有一定浓度待测物的标准品稀释液加入包被有对应待测物包被抗原的反应杯后将100μl待测物对应的酶标记抗体混合物加入各反应杯，每个浓度两个平行，37℃下孵育20min，弃掉反应液后加入200
‑
500μl磷酸盐洗涤液，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将板在滤纸上拍干。
48.(2)显色：向各反应杯中加入过氧化脲溶液和3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺溶液各50μl，37℃下显色10min。
49.(3)终止：用50μl硫酸终止液终止显色反应后在10min内读数。
50.(4)读数：用酶标仪测定各反应杯在450nm处的吸光度值。
51.2.结果判定
52.本发明所述碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒以待测物结合酶标记抗体抑制底物氧化从而导致吸光度值降低，待测反应杯中溶液在450nm处的吸光度值随待测样品中待测物含量增加而降低。结果判断标准：抑制率的计算公式为：抑制率 (％)＝(a0‑
a
x
)/(a0‑
a
b
)
×
100％，a0为测定不含待测物的标准溶液时反应杯的检测吸光度值， a
x
为检测含有待测物的标准溶液时反应杯的吸光度值，a
b
为未添加待测物标准溶液时反应杯的检测吸光度值，以抑制率为纵坐标，待测物浓度的对数为横坐标作标准曲线，灵敏度即抑制率为50％时所对应的待测物浓度(ic
50
)可以从标准曲线上读出。如图2所示，本发明所述酶联免疫分析方法对呋喃它酮检测灵敏度为0.32ng/ml；呋喃西林检测灵敏度为0.26ng/ml；呋喃妥因检测灵敏度为0.68ng/ml；呋喃唑酮检测灵敏度为0.36ng/ml；氯霉素检测灵敏度为0.28ng/ml；氟苯尼考检测灵敏度为0.075ng/ml。
53.实施例5(应用实施例)
54.碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒的使用技术
55.1.禽类组织产品的预处理
56.(1)称取2.0g样品至50ml离心管中，加入5ml酸性样本提取液i，150μl2
‑
硝基苯甲醛衍生化试剂，涡旋震荡5min；、
57.(2)放置75
‑
80℃水浴锅中避光孵育15min，取出冷却至室温，加入5ml碱性样本提取液ii和8ml乙酸乙酯，涡旋震荡5min，4000rpm，5min取离心后上清液3ml到 5ml离心管中，60℃空气吹干；
58.(3)加入2ml正己烷和1.5ml样本复溶液，涡旋10s，4000rpm离心3min；
59.(4)取下层待测。
60.3.检测步骤
61.(1)加待测样本和辣根过氧化物酶标记抗体工作液：分别向包被有六种待测物包被原的反应杯中加入100μl样品提取液，而后将100μl与待测物对应的酶标记抗体混合物加入各反应杯，每个浓度两个平行，37℃下孵育20min，弃掉反应液后加入200
‑
500μl 磷酸盐洗涤液，震荡2min后，甩掉磷酸盐洗涤液，如此重复3次，最后将板在滤纸上拍干。
62.(2)显色：向各反应杯中加入碳量子点荧光反应液a和碳量子点荧光反应液b各50 μl，37℃下显色10min。
63.(3)荧光读数：在365nm激发波长下用荧光检测仪测定各反应杯在560nm处的荧光值。
64.4.结果判定
65.本发明所述碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒以待测物抑制底生成从而导致荧光回复，待测反应杯中溶液在365nm激发下，560nm处的荧光强度值随待测样品中待测物含量增加而增加。结果判断标准：抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(f
x
‑
f0)/(f0‑
f
b
)
×
100％，其中f0为检测待测物阴性样品反应杯的检测荧光值，f
x
为检测待测物阳性样品反应杯的检测荧光值，f
b
为检测无待测物样品孔反应杯的检测荧光值。以加入不同浓度待测物标准品的荧光值求抑制率，以抑制率为纵坐标，待测物标准品浓度的对数为横坐标作标准曲线，每一个样品的浓度可以通过样品测定荧光值计算抑制率，并根据抑制率从标准曲线上读出。本发明所述试剂盒用于禽类组织样品检测呋喃它酮检测灵敏度为0.64ng/ml；呋喃西林检测灵敏度为0.52ng/g；呋喃妥因检测灵敏度为1.36ng/g；呋喃唑酮检测灵敏度为0.72ng/g；氯霉素检测灵敏度为0.56ng/g；氟苯尼考检测灵敏度为0.15ng/g。
66.表1碳量子点荧光免疫快速检测试剂盒检测禽类样品中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮、氯霉素和氟苯尼考的回收率
[0067][0068]
如表1所示，本发明所述试剂盒检测水产品样品中待测物的检测值和添加值一致。