一种微针检测pH方法

一种微针检测ph方法
技术领域
1.本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种可用于智能可视化的ph检测的微针贴片的制备及其应用方法。


背景技术：

2.食品安全关系到人们身体健康和生命安全。世界卫生组织(who)估计，食源性污染每年在全世界造成约42万人死亡。提高食品供应链的效率也是避免目前全球粮食产量损失的优先举措。很多消费者出于对安全的担忧而误解了日期标签，并过早地将食物扔掉。预先确定的有效期还增加了公众对食品安全的不信任，并导致生产商更多地使用食品防腐剂来延长产品保质期。
3.为了确保食品安全和最大限度地减少食品损失，对食品质量进行实时的检测已经引发研究人员的关注。传统监测技术普遍基于聚合酶链反应(pcr)和细胞培养技术，涉及复杂的实验室设备和专业操作，并且具有破坏性、耗时长且昂贵等不足，因此仅适用于食品供应链的加工、储存和运输层面，以满足质量控制要求。而目前适用于食品供应链下游的监测技术，如比色传感器，通常被认为不太敏感，并且将比色传感器固定在包装材料内部或小袋中会限制对食品表面及内部的病原微生物的检测。
4.在加工和储存过程中，检测食品的ph值对于保障食品质量起着重要作用。ph值表示食品中氢离子的活性，氢离子是维持生化反应的一个因素，会影响加工、储存和分销过程中的微生物生长和活力，因此决定了食品的质量。传统上，食品的ph值是使用ph敏感玻璃电极和参比电极以电化学方式测量的，适合实验室的操作与检测，但并不适合消费者对食品进行快速检测。因此，需要开发新一代的食品ph值的快速检测手段，确定食品系统中的酸度水平，用于保证食品质量和安全，易于消费者的使用和读取，不破坏食品本身且不会对人体健康产生有害影响。


技术实现要素：

5.针对上述技术问题，本发明的目的是开发一种可定性或定量检测ph值的方法，该方法只需直接刺破包装与食品内部接触，即可快速检测其ph值(图1)。从而为消费者提供直观的食品质量和安全信息，操作简单，测试迅速。
6.本发明全部采用生物相容性的材料进行微针凝胶的制备。该微针凝胶中含有两种水凝胶成分：一种是光敏感性水凝胶，具有光固化成型特性；另一种是ph响应性水凝胶，具有ph响应性变形特性。其中，光敏感性水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶(gelma)，也可以是其它的光敏感性水凝胶，主要功能是有利于光固化交联，为微针提供足够穿刺的力学性能；ph响应水凝胶的缩写为cmc-phea，也可以是其它类型的ph响应性水凝胶，为了加快cmc-phea水凝胶对ph的响应性，将其超声破碎，形成cmc-phea纳米凝胶。
7.第一方面，本发明提供一种微针检测ph方法，其包括以下步骤：
8.(1)避光条件下，将光敏感性水凝胶溶液、光引发剂和ph响应功能水凝胶溶液混
合，浇筑到微针模板中，通过高速离心预成型；再在光照下固化成型形成微针阵列；所述敏感性水凝胶为甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液；所述ph响应功能水凝胶溶液由羧甲基纤维素和丙烯酸-2-羟乙基酯在过硫酸钾和聚乙二醇二丙烯酸酯的共同作用下制备而成；
9.(2)在微针阵列底面涂覆透明光固化树脂，经紫外光固化，形成微针阵列的基底；
10.(3)干燥、脱模形成水凝胶微针贴片；所述微针贴片为由尖锐锥形微针水凝胶阵列于基底形成的方阵结构；
11.(4)ph测试方法：
12.(4.1)定性测试：将步骤(3)的微针贴片穿刺入待测样品中，观察微针的变化情况以确定酸碱性；
13.(4.2)定量测试：将步骤(3)的微针贴片穿刺入待测样品中，利用微针膨胀率与ph值的关系膨胀曲线，计算出ph值。
14.如图3所示，由于制备的微针呈现出尖锐的倒三角形状，微针具有无创性或微创性，有利于快递穿刺例如食品包装袋、食品表面等，通过毛细作用从食物内部采样液体，并与其中的酸性物质快速响应。拔出微针后，观察微针的高度变化和膨胀率变化，来实时、定量检测其ph水平(图1)。当微针所处环境酸性较强时(低ph)，微针膨胀程度小；若置于中性环境中(高ph)，微针膨胀程度较大(图1)。微针的膨胀程度与环境ph值呈线性正相关特性，通过微针的尺寸变化可以精确分析待测物的ph值。
15.本发明所述智能微针贴片具有生物相容性和足够的机械性能，可以直接刺破包装与食品内部接触，包括肉类和蔬菜等，通过毛细作用从食物内部采样液体，对ph的变化响应敏感，可以通过微针尺寸分析得到精确的ph值。
16.进一步，所述微针阵列至少含有一根微针，可为单排或阵列结构；锥形微针的高度为100-800μm；单排或阵列中微针的间距为100-800μm。优选的，所述锥形微针的高度为600μm；所述微针阵列中微针的间距为400μm；所述方阵结构的尺寸为6.3
×
6.3mm，由11*11个针组成。
17.进一步，所述光引发剂为i2959紫外光引发剂或lap蓝光引发剂，所述光引发剂的质量百分数为水凝胶重质量的0.05％-0.1％。
18.进一步，所述透明光敏树脂为美国formlab公司生产的clear v4树脂。
19.进一步，所述甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶由甲基丙烯酸酐化明胶以质量百分比为8％-12％溶解在水中，得到甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶溶液。
20.进一步，所述ph响应功能水凝胶溶液的制备方法如下：
21.(a)在50-100℃和搅拌速度为300-500r/min下，将羧甲基纤维素溶于水中：
22.(b)惰性气体存在下，将过硫酸钾加入所述步骤(a)得到的溶液中混合并反应：
23.(c)向所述步骤(b)的溶液中加入丙烯酸-2-羟乙基酯，继续反应至溶液成乳白色：
24.(d)向所述步骤(c)的溶液总加入聚乙二醇二丙烯酸酯，继续反应至结束：
25.(e)将所述步骤(d)得到的反应产物透析，去除未反应的反应物，得到所述ph响应水凝胶；
26.所述羧甲基纤维素、丙烯酸-2-羟乙基酯、引发剂和交联剂的摩比为：1：((5.48-8.62)
×
103)：(2.65-3.60)：(28.77-86.33)。
27.进一步，所述步骤(1)中光照参数为蓝光、紫光或紫外光，光照时间3-60s；所述步
骤(2)中紫外固化时间为1-2h。优选的，所述步骤(1)中光照参数为405nm蓝紫光，光照时间3s；所述步骤(2)中紫外固化时间为2h。
28.进一步，所述步骤(4.1)中判断酸碱性的方法如下：若微针形状变化较小，针间隙较大，则酸性较强；若微针形状明显变大，针间隙变小且存在一定间隙，则为弱酸性；若微针形状显著变大，针与针之间紧贴，则为中性或碱性。
29.进一步，所述步骤(4.2)中计算ph值得方法如下：
30.将微针贴片对标准梯度ph的标准品进行穿刺，测定微针贴片的膨胀率，拟合出膨胀率随ph变化的曲线和计算公式；
31.穿刺样品测定膨胀率，根据计算公式推算出ph值。
32.更进一步，利用带微距功能的相机或者手机测定微针贴片尺寸变化以计算出膨胀率。
33.本发明有益效果：
34.本发明提供一种新型、无创的、可视化的ph快速检测方法。利用智能水凝胶的ph响应特性和光固化特性，结合微针的微创性，实现对食品质量的ph快速检测。微针体积小，简单便携，灵敏度高，操作简单，适合普通消费者和现场检测的相关人员等进行快速检测。
35.本发明提供的测试方法，可直接对食品尤其是固态或凝胶状的食品使用，取样便捷，测试简单迅速，可根据需求进行定性或者定量测试。
附图说明
36.图1为用于ph检测的微针贴片及其工作原理示意图；
37.图2为智能水凝胶双层微针的制备流程；
38.图3为微针表观和微观形貌图，其中(a)整体微针的图片；(b)微针的扫描电镜图片；(c)单排微针图片；
39.图4为微针接触不同ph溶液后的形状变化图；
40.图5为微针在琼脂糖凝胶中的ph响应性图；其中，(a)微针阵列在穿刺不同ph值的琼脂糖凝胶后的图片；(b)单根微针的放大图片；(c)微针在穿刺不同ph值琼脂糖凝胶后的高度；(d)微针在穿刺不同ph值的琼脂糖凝胶后的膨胀比；
41.图6为微针在穿刺不同类型猪肉后对应的高度。
具体实施方式
42.下面结合具体实施例对本发明进一步说明，本发明的内容完全不限于此。
43.实施例
44.1.ph响应水凝胶cmc-phea的制备
45.首先，将50ml蒸馏水和羧甲基纤维素(carboxymethy1 cellulose，cmc)(5.56
×
10mo1)放入250m1三颈圆底烧瓶中，以75℃(50-100℃，优选75℃)和400rpm(300-500rpm，优选400rpm)的速度在水浴中搅拌至cmc充分溶解。然后将氮气注入装有cmc溶液的分压瓶中持续20分钟，使溶液中氧的含量充分降低，然后将添加过疏酸钾(kps，1.85
×
105mo1)作为引发剂加到溶液中混合反应20分钟。接下来，添加3.92
×
10mo1的丙烯酸-2-羟乙基酯(2-hydroxyethy1 acrylate，2-hea)。当反应混合物变成了乳白色，加入0.32
×
10mo1交联剂聚
乙二醇二丙烯酸酯pegda，继续反应3h，反应结束后，室温下充分冷却。在合成过程中调整搅拌速度以诱导均相合成。用5l蒸馏水对该化合物进行3天以上的透析，去除未反应的交联剂和单体形成ph响应水凝胶cmc-phea。然后利用超声破碎仪将水凝胶破碎即得。
46.2.gelma光响应水凝胶的制备
47.将gelma原料以质量百分比10％(8％-12％，优选10％)溶解在去离子水中。lap蓝光引发剂以质量百分比0.05％-0.1％的比例溶解在10％的gelma溶液中。在避光条件下操作，防止gelma在自然光下交联。并且在避光条件下，在37℃(28-45℃，优选37℃)超声5分钟，使之充分混合：然后在37℃热水中浸泡半小时，使之充分溶解。在405m光源下照射混合溶液，瞬间(大约1-2s)固化，即得光固化的gelma光敏感性水凝胶。
48.3.双网络水凝胶体系的制备
49.将步骤1和2中制备的两种水凝胶按照1:3的体积比例混合，放置在50℃烘箱中保温，直至气泡消失，水凝胶变得澄清。利用cmc-phea纳米凝胶的ph响应特性和gelma水凝胶的光固化成型特性，采用405nm的紫外光照射，进行光固化，得到ph响应的双网络水凝胶。
50.4.水凝胶微针阵列的制备
51.如图2所示，将在50℃保温的水凝胶预聚物滴加到微针模具表面，通过高速离心机(40℃，3800rpm，10min)离心三次，使水凝胶填充进模具空腔中。用小刀刮掉表面多余的水凝胶，利用波长为405nm的蓝紫光对其进行固化，光强为20％，照射时间约3s。再在模具表面滴加一定量的光固化树脂，待树脂表面平整后，再次照射紫外光进行固化，光强为20％，照射时间约2h。经过干燥、脱模，制得基底为坚硬的透明树脂，针尖为具有ph响应性的水凝胶微针阵列。
52.如图3所示，制备得到的微针贴片外形完整，含有11x11根微针，每根微针呈现出尖锐的圆锥形结构。
53.利用接触角测试仪及其所带的ccd相机记录并分析不同条件下单根微针的大小和体积变化。
54.5.微针阵列的ph响应性测试
55.通过磷酸(20％)将纯水分别调节至ph分别为3、5、7。
56.将微针放置在接触角仪器的载物台上，固定位置后，滴加不同ph的水溶液。在完全浸润微针3s后，用无尘纸吸干样品表面水分，观察微针的形态变化。
57.结果如图4所示：在低ph(ph＝3)的水溶液作用下，微针的形状变化很小，几乎保持原本的圆锥形的微针形态；在ph＝5的水溶液作用下，微针明显变大，针与针之间的间隙变小；在高ph(ph＝7)的水溶液作用下，微针显著变大，针与针紧贴，甚至由于过度溶胀其形状略有倾倒。说明微针具有快速灵敏的ph响应能力。根据微针的膨胀比，可推知未知溶液的酸碱性。
58.6.不同ph水平的琼脂糖凝胶的制备
59.为了模拟微针在实物上的穿刺应用，以及准确测量出微针在不同ph下的大小变化，我们采用制备琼脂糖凝胶来模拟食品。
60.分别取0.5g琼脂糖溶于10ml水中，ph值调至1.7、2.5、3.5、4.5、5.0、7.0，分别制得6组样品。在不断搅拌下加热至70℃，直到琼脂糖完全溶解。将琼脂糖溶液倒入小号细胞培养皿中，冷却至室温，并加盖保持30min，得到ph值不同的琼脂糖凝胶，其高度为3mm，用于接
下来的微针穿刺实验。
61.7.琼脂糖凝胶中ph值的检测
62.类似的，利用接触角测试仪及其自带的ccd相机来测量微针的高度变化。
63.将微针贴片固定在接触角样品平台上，调整接触角针的位置，使其针尖靠近微针针尖，并且与微针阵列最前排的微针处于一个水平面，调焦使两种针尖同时清晰。用接触角测试仪的ccd相机，记录下此时接触角针的直径和微针阵列单根针的高度(图5a)。
64.取下微针贴片，并用手指将微针阵列按压至琼脂糖凝胶中，保持5s后拔出，利用接触角仪，再次测量微针的高度(图5a)。更换微针和凝胶，并重复试验，记录微针穿刺不同ph值的琼脂糖凝胶后的高度变化情况。
65.结果和分析：
66.在穿刺不同ph值的琼脂糖凝胶后，微针尺寸随着ph值的变化而呈现出正线性相关变化(图5b-d)。ph为1.7时，微针的高度变化较小，其膨胀率仅为0.92％；随着ph值的升高，微针的高度变高，膨胀变大，ph7.0时，作用后的微针的膨胀率高达28.8％(图5c-d)。
67.基于体外琼脂糖凝胶中的结果，拟合膨胀比与ph值的变换曲线和计算公式，可以计算出未知的带水分的食品中的ph值。
68.8.不同肉类的ph检测
69.由于微生物污染，肉类很容易变质。微生物腐败会产生高水平的挥发性盐基氮(tvb-n)，并改变肉的ph值。
70.结合智能微针的ph敏感性和响应性，因此，可以将该ph响应性微针广泛应用于不同食品系统的ph值检测和评估中。例如，利用微针的大小变形，来监测不同肉类的ph值，从而反映它们不同的新鲜/腐败程度，以及验证微针在食品系统检测中的兼容性。
71.使用智能微针在不同时间点，对不同新鲜/腐烂程度的猪肉进行穿刺。微针穿刺猪肉样品后，保持5s，拔出微针，并观察微针的尺寸变化(图6)。
72.实验结果：
73.新鲜猪肉在25℃下储存48小时后，利用ph试纸测得其ph值到7.4；微针穿刺该新鲜猪肉后，微针的高度较高，为636微米。
74.在夏天的自然环境中放置猪肉48小时，模拟变质猪肉，利用ph试纸测得其ph值为6.0；微针穿刺该变质猪肉后，微针的高度较低，为628微米。
75.与上述琼脂糖水凝胶中的结果相似，不同新鲜/腐烂程度的猪肉中的ph酸度与穿刺后微针的高度具有正线性相关性。
76.通过对肉类进行ph值的评估，发现本发明提供的方法对肉类新鲜度的监测具有非常好的灵敏度，能够通过微针的尺寸反推食品的ph值，因此可以作为一种低成本的、操作简便的ph检测方法。
77.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明保护的范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在发明的保护范围之内。