一种氟化纳米胶囊及其制备方法和应用

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其是指一种氟化纳米胶囊及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着生物技术的迅猛发展，许多极具优势核酸类药物已经广泛运用于肿瘤、炎症、心血管疾病等重大疾病中。与常规药物相比，这类药物特异性高、不良反应少，但也同时面临诸多局限性。核酸类药物在体内循环稳定性差，易受体内酸碱、酶促的影响而失活，故临床多以注射为主。长期频繁的给药让病人带来巨大的机体损伤及精神折磨，故探究其非注射的的给药方式具有深远意义。临床经验中，口服给药因为其操作简单、病人顺应性好，成为了最为推崇的给药方式。在口服递送中，小肠上丰富的黏液以及小肠上皮细胞是药物吸收必须通过的两大生理屏障，而大多数核酸类药物脂溶性低、分子量大，很难通过小肠上皮细胞进入血液循环中，严重的制约了该类药物的临床发展。
3.壳聚糖(advanced healthcare materials,2018:1800285)、水凝胶(biomacromolecules,2015,16(3):962-72)、脂质体(nature reviews.drug discovery,2007,6(3):231-48)等纳米载体已经被证实能提升核酸等大分子药物的口服吸收效率，在这些载体中，人们利用配体间的相互作用(science translational medicine,2013,5(213):213-167)、阳离子与细胞膜间的静电相互作用力(chemical society reviews,2011,40(1):233-45)等方式增强小肠上皮细胞对药物的内吞能力。但对于口服递送体系而言，位于肠道细胞上方的黏液层屏障也应该作为重要的考量因素，由于带正电的载体容易吸附黏液层中带负电的黏蛋白造成团聚，从而导致药物不能顺利接触小肠上皮细胞。利用聚二醇修饰增强载体亲水性已经成为提升黏液层渗透的重要手段(acs nano,2015,9(9):9217-27)。专利申请cn 107335059公布了名为dspe-peg的聚合物作为口服吸收促进剂，该聚合物中所含聚乙二醇高分子链能够有效避免黏蛋白吸附，促进载体的黏液层渗透。尽管如此，聚乙二醇的加入会阻碍载体与细胞膜间的相互作用，降低小肠上皮细胞的内吞能力。


技术实现要素：

4.为解决不能同时兼顾促进黏液层渗透与小肠上皮细胞吸收的性能技术问题，本发明提供了一种用于核酸药物的口服氟化纳米胶囊及其制备方法和应用。本发明提出利用在生物大分子药物(核酸)表面引发自由聚合的方式构建用于口服递送的含氟纳米胶囊，所得纳米凝胶能够为核酸的口服递送提供良好的胃肠道稳定性，且具有优良的跨黏液层与促进小肠上皮细胞吸收的功效。
5.本发明的第一个目的在于提供一种氟化纳米胶囊，所述氟化纳米胶囊为核壳结构，其中，核壳结构中的内核为核酸类药物，核壳结构中的外壳为具有交联结构且含氟烷烃链嵌段的丙烯酸脂/丙烯酰胺高分子聚合物。
6.本发明的第二个目的在于提供所述的氟化纳米胶囊的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)将核酸类药物、聚合反应单体和全氟丙烯酸充分混合，使聚合反应单体与核酸类药物产生聚集；
8.(2)向步骤(1)中加入过硫酸铵和n，n，n'，n'-四甲基乙二胺引发自由基聚合，得到所述氟化纳米胶囊。
9.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述核酸类药物可包括sirna、mirna或dna中的一种或多种。
10.在本发明的一个实施例中，所述核酸类药物选自sirna。
11.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述核酸类药物的浓度为1～30μmol/l。
12.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述聚合反应单体选自n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺、n,n'-双(丙稀酰)胱胺和全氟丙烯酸中的一种或多种。
13.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述全氟丙烯酸脂选自如下所示化合物之一或多种组合：
[0014][0015]
在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述核酸药物与交联剂的摩尔比为1：(100～3000)；所述n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺与全氟丙烯酸摩尔数之比为(1～4)：(2～8)。
[0016]
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述过硫酸铵浓度为0.1～10mg/ml；所述n，n，n'，n'-四甲基乙二胺浓度为0.1～10mg/ml。
[0017]
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，混合反应时间为0.5～3小时，反应温度为0～10℃。
[0018]
在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，反应混合溶液的ph为8～10。
[0019]
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0020]
1、本发明所述的药物表面聚集单体后通过原位聚合的方式制备纳米囊，其表面形成的高分子壳状结构可以让药物在通过胃肠道时维持稳定。
[0021]
2、纳米囊比常规聚合所得凝胶体系具有更小的粒径，更容易穿过黏液层中的黏蛋白网状结构，其表面的全氟碳链同时可以减少载体与黏蛋白间非特异吸附，在小粒径、不吸附的优势下极大提升了载体穿透黏液层的能力。
[0022]
3、该纳米囊表面具有一定密度的正电性，以及修饰有能够帮助穿透细胞膜的全氟碳链，因此具有良好的细胞内吞能力，有效地提升了药物在小肠上皮的转运效果；纳米囊的可逆交联结构具有良好的生物响应性，能够使药物在细胞内顺利释放，使其成功作用于目标细胞。
[0023]
4、总体制备过程简单、高效，具有广泛的应用前景。
附图说明
[0024]
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合
附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0025]
图1为本发明实施例与对比例中纳米囊的粒径与电位图。
[0026]
图2为本发明实施例与对比例中纳米囊的电镜图。
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图3为本发明试验例1中纳米囊在raw264.7细胞中的转染实验图。
[0028]
图4为本发明试验例2中纳米囊在黏液中的多粒子追踪实验图。
[0029]
图5为本发明试验例2中纳米囊与不同质量分数黏蛋白吸附百分比图。
[0030]
图6为本发明试验例2中纳米囊在caco-2细胞单层转运实验的结果图。
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图7为本发明试验例3小鼠肝损伤模型中治疗结束后肝组织内tnf-αmrna表达水平的实验结果图。
[0032]
图8为本发明试验例3小鼠肝损伤模型治疗结束后血清内谷草转氨酶含量的实验结果图。
[0033]
图9为本发明试验例3小鼠肝损伤模型治疗结束后血清内谷丙转氨酶含量的实验结果图。
[0034]
图10为本发明试验例3小鼠肝损伤模型治疗结束后的存活率。
具体实施方式
[0035]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0036]
实施例
[0037]
用depc水(125μl)将1od的tnf-αsirna(正义链：5
’‑
gucucagccucuucucauuccugct-3’，反义链：5
’‑
agcaggaamugmaamgaggmcugamgacmamu-3’)冻干粉溶解成20μmol/l，随后转入两口烧瓶，并将烧瓶置于冰水浴中。然后加入n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(3.56μl，4μmol)水溶液。混匀后，用rnase灭活的去离子水将溶液中sirna浓度调整为5μmol/l，并向瓶内抽真空。15分钟过后，1h，1h，2h，2h-全氟丙烯酸辛酯(25μl，2μmol)的四氢呋喃溶液以及n，n'-双(丙烯酰基)胱胺(6.5μl，2.5μmol)二甲基亚砜溶液加入其中，充分混匀。在氮气保护下，向瓶内加入5μl质量分数为1％的过硫酸铵溶液和2μl质量分数为5％的n，n，n'，n'-四甲基乙二胺溶液引发自由基聚合。磁力搅拌2小时后将所得溶液置于10-kda的透析袋中，4℃条件下在磷酸盐缓冲溶液中透析24小时，除去未反应的单体，得到含氟修饰的sirna纳米囊。所得实施例纳米囊的粒径和电位如图1所示，电镜图如图2所示。
[0038]
对比例
[0039]
用depc水(125μl)将1od的tnf-αsirna(正义链：5
’‑
gucucagccucuucucauuccugct-3’，反义链：5
’‑
agcaggaamugmaamgaggmcugamgacmamu-3’)冻干粉溶解成20μmol/l，随后转入两口烧瓶，并将烧瓶置于冰水浴中。然后加入n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺(8.9μl，4μmol)水溶液。混匀后，用rnase灭活的去离子水将溶液中sirna浓度调整为5μmol/l，并向瓶内抽真空。15分钟过后，将n，n'-双(丙烯酰基)胱胺(6.5μl，2.5μmol)二甲基亚砜溶液加入其中，充分混匀。在氮气保护下，向瓶内加入5μl质量分数为1％的过硫酸铵溶液和2μl质量分数为5％的n，n，n'，n'-四甲基乙二胺溶液引发自由基聚合。磁力搅拌2小时后将所得溶液置于10-kda的透析袋中，4℃条件下在磷酸盐缓冲溶液中透析24小时，除去未反应的单体，得到不含氟修饰的sirna纳米囊。所得对比例纳米囊的粒径和电位如图1所示，电镜图如图2
pcr试剂盒说明书操作，检测组织细胞内的tnf-αmrna水平。肝组织中tnf-αmrna相对水平分别见图7，可见实施例对tnf-α基因的沉默水平高于对比例；图8和图9能看出，实施例对谷草转氨酶和谷丙转氨酶的下降效果优于对比例。
[0048]
将实施例与对比例所述含有tnf-αsirna的纳米胶囊，以200μg/kg sirna(每组10只小鼠)的剂量对雄性c57bl/6小鼠进行口服灌胃，口服磷酸盐的小鼠作为对照组。向小鼠腹腔注射脂多糖(12.5μg/kg)和氨基半乳糖(1.25g/kg)诱导小鼠急性肝损伤，不诱导的组别作为空白组。随后实时监测24小时内四组小鼠的存活状况。图10可以看出，在24小时观测期内，对照组小鼠全部死亡，口服实施例纳米囊的组别24小时内小鼠生存率为30％，高于口服对比例纳米囊的组别。由上可以看出，实施例比对比例更能抑制小鼠急性肝损伤模型中炎症因子tnf-α的表达，并能更有效提升小鼠生存率，对急性肝损伤有更好的治疗功效。
[0049]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。