一种治疗癌症的维生素C与溶瘤病毒联合用药物

一种治疗癌症的维生素c与溶瘤病毒联合用药物
技术领域
1.本发明属于肿瘤生物治疗领域，具体涉及一种治疗癌症的维生素c与溶瘤病毒联合用药物。


背景技术：

2.癌症(恶性肿瘤)是目前威胁人类生命健康的重大疾病之一，是继心血管疾病的世界第二大死因。近年来癌症的发病率、死亡率均呈上升趋势，防控形势非常严峻。目前，针对癌症的治疗主要包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、中医中药治疗、生物免疫疗法等手段，其中生物免疫疗法逐渐展现出治疗优势，获得了越来越多的关注。溶瘤病毒疗法是一种典型的生物免疫疗法，得益于腺病毒相比于其他类型的病毒，具有致病性低、染色体稳定性高、核酸负载量大的优势，通过生物学的方法人为改造腺病毒基因结构，以肿瘤特异性启动子替代病毒启动子制得基因工程改造病毒即溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus,ov)，可以使得病毒可选择性在肿瘤细胞内大量复制而不影响正常细胞。
3.腺病毒是首次从人腺体细胞发现并分离到的一种无包膜的双链dna病毒，根据病毒颗粒表面表位的不同分为6个亚属，57个血清型，其中溶瘤病毒最常用的是c亚属的2型和5型人腺病毒，研究人员在此基础上进行了诸多的研究。例如kawashima等人在5型腺病毒基础上，敲除e3基因，在e1基因上游插入htert启动子，改造得到溶瘤腺病毒，表现出强烈的溶瘤效应(kawashima,t.,et al.(2004).telomerase-specific replication-selective virotherapy for human cancer.clin.cancer res.10,285
–
292.)。不过，ov对肿瘤细胞的杀伤效果仍有不足，临床上往往作为化疗、放疗、免疫及靶向治疗的增敏剂，即需要与化疗、放疗等方式结合才可有效杀伤肿瘤细胞，导致放化疗的毒副作用依然无法避免，因此，提高ov对肿瘤细胞的杀伤效果，减少放化疗，充分利用ov毒副作用小的优势，显得尤为重要。
4.除溶瘤腺病毒外，研究人员发现高剂量维生素c(vitamin c,vc)是一种肿瘤细胞的促氧化剂，对正常细胞的影响小。不同于生理剂量vc(微摩尔级别)，高剂量vc(毫摩尔级别)仅在肿瘤细胞内激活的通路或机制产生大量活性氧，可利用肿瘤细胞代谢方面的“弱点”，发挥抗肿瘤重用。
5.不过，尽管ov、高剂量vc均具有一定的选择性杀伤肿瘤细胞的特性，但高剂量vc与ov共同作用于肿瘤细胞的效果尚不明晰。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种特定用量比例的维生素c和溶瘤病毒的联合用抗肿瘤药物。
7.本发明首先提供了维生素c在制备增强溶瘤腺病毒的溶瘤能力的药物中的用途。
8.优选地，上述药物中维生素c的浓度不低于2mm。
9.进一步地，上述药物是增强肿瘤细胞对溶瘤腺病毒敏感性的药物；优选为提升溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的感染能力和/或提升溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的复制能力的药物。
10.本发明提供了一种联合用药物，它含有同时或分别给药的溶瘤腺病毒和维生素c，所述维生素c的质量与溶瘤病毒的空斑形成单位的比值为：(70.4～80)mg:[(2～5)
×
108]pfu。
[0011]
进一步地，上述维生素c的质量与溶瘤病毒的空斑形成单位的比值为70.4mg:(2
×
108)pfu。
[0012]
进一步地，上述维生素c的质量与溶瘤病毒的空斑形成单位的比值为80mg:(5
×
108)pfu
[0013]
更进一步地，上述溶瘤腺病毒是：e3基因缺失且e1基因上游插入htert启动子的5型腺病毒。
[0014]
更进一步地，上述联合用药物还含有药学上可接受的辅料或辅助性成分。
[0015]
更进一步地，上述联合用药物是液体制剂。
[0016]
更进一步地，上述液体制剂中维生素c的浓度不低于2mm。
[0017]
本发明还提供了上述的联合用药物在制备治疗癌症的药物中的用途。
[0018]
进一步地，上述治疗癌症的药物是治疗结肠癌和/或乳腺癌的药物。
[0019]
本发明的有益效果：本发明本发明采用特定用量比例的高剂量vc联合特定的ov治疗肿瘤，可以系统增强抗肿瘤效应，减小荷瘤小鼠肿瘤体积，延长生存期，且对心、肝、脾、肺、肾重要脏器无明显毒副反应，具有很好的应用前景。
[0020]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0021]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0022]
图1筛选诱发肿瘤细胞死亡的最低vc浓度和最低ov的moi值。(a,d)随着vc浓度升高，ct26结肠癌细胞、4t1乳腺癌细胞的活力下降。红色箭头所示为vc开始杀伤ct26、4t1细胞时的浓度为2mm；(b,e)随着溶瘤病毒的moi值增高，ct26、4t1细胞活力下降。红色箭头表示溶瘤病毒杀伤ct26、4t1细胞时最低moi值分别为250、100；(c,f)ov联合vc(2mm)后，ov杀伤ct26、4t1细胞的最低moi将至10。
[0023]
图2高剂量vc增强ov的溶瘤效果。(a)显微镜下(100
×
)观察，ct26、4t1肿瘤细胞生理盐水(ns)组、维生素c(vc)组、溶瘤病毒(ov)组，联合组(vc ov)处理组的溶瘤效果。(b,c)以ns、vc、ov、vc ov处理ct26细胞后12h、24h、48h、72h的流式细胞凋亡图及对应的统计图。(d,e)以ns、vc、ov、vc ov处理4t1细胞后12h、24h、48h、72h的流式细胞凋亡图及对应的统计图。
[0024]
图3高剂量vc促进病毒复制，增强ov促进肿瘤细胞凋亡的表型。(a)以ov、ov vc处理ct26细胞后，各时间点(12h、24h、48h、72h)凋亡细胞数(左)、感染病毒细胞数(右)流式细胞统计图。(b)以ov、ov vc处理4t1细胞后各时间点(12h、24h、48h、72h)凋亡细胞数(左)、感染病毒细胞数(右)流式细胞统计图。(c)adeno-x rapid titer kit检测各处理组感染病毒的细胞，dab染色后高倍镜(200
×
)视野图。(d,e)adeno-x rapid titer kit检测各处理组
ct26、4t1细胞中病毒滴度统计图。
[0025]
图4动物实验中，高剂量vc增强ov的抗肿瘤效应。(a)ct26细胞皮下移植瘤小鼠模型，分别给予ns、vc、ov、vc ov，各治疗组瘤体生长曲线图(左)；各治疗组肿瘤完全消失小鼠所占比例(右)。(b,d)ct26细胞、4t细胞荷瘤小鼠生存曲线图。(c)4t1细胞皮下移植瘤小鼠模型，分别接受ns、vc、ov、vc ov治疗，各治疗组瘤体生长曲线图(左)；各治疗组完全缓解的小鼠所占比例(右)。(e)ct26移植瘤模型中，4只小鼠肿瘤消退，达到完全缓解，此时再接种肿瘤，再挑战组以vc ov治疗，对照组以ns治疗，ns组、vc ov组瘤体生存曲线图，其中3只小鼠肿瘤完全消失。(f)再挑战组、ns组小鼠生存曲线图。
[0026]
图5高剂量维生素c联合ov对正常组织无毒副作用。采用ns、vc、ov、vc ov治疗ct26荷瘤小鼠，心、肝、脾、肺、肾组织h&e染色图。
具体实施方式
[0027]
本发明所用的溶瘤腺病毒是kawashima等人公开的htertp驱动的溶瘤腺病毒(kawashima,t.,et al.(2004).telomerase-specific replication-selective virotherapy for human cancer.clin.cancer res.10,285
–
292.)简单来讲是将由htertp驱动的e1a-ires-e1b转基因的基因表达框插入到pdc316质粒中。然后，将带有或不带有egfp基因的穿梭质粒和腺病毒5-bhgloxde1,3cre型骨架质粒共转染到hek293细胞中以包装溶瘤腺病毒。腺病毒5型e3区的所有基因均被敲除。得到的溶瘤腺病毒在hek293细胞中扩增并通过离子交换色谱法纯化。
[0028]
除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0029]
实施例1、本发明联合用药物
[0030]
准备浓度100mm的vc水溶液40μl，以及pfu为2
×
106的ov，作为同时或分别给药的联合用药物。
[0031]
实施例2、本发明联合用药物
[0032]
准备浓度400g/l的vc水溶液200μl，以及pfu为5
×
108的ov，作为同时或分别给药的联合用药物。
[0033]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0034]
实验例1、不同处理方式对体外培养肿瘤细胞增殖、凋亡的影响
[0035]
1.1筛选引起肿瘤细胞死亡的最低vc浓度和最低ov的moi值
[0036]
取对数生长期ct26、4t1细胞，按1
×
105/孔铺于12孔板。细胞贴壁后，分别以终浓度为0.5mm、1.0mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3.0mm、4.0mm、5.0mm的vc处理ct26和4t1细胞。结果显示，当终浓度达到2mm时，vc可以杀伤ct26和4t1细胞。细胞计数，ov分别按moi值为10、25、50、75、100、250、500、1000，处理ct26和4t1细胞，结果显示，当moi达到100时，可以杀伤4t1细胞，当moi达到250时，可以杀伤ct26细胞。
[0037]
采用高剂量vc(2mm)联合ov处理ct26、4t1细胞，ov开始杀伤ct26细胞的moi值从250降至10，开始杀伤4t1细胞的moi值从100降至10，说明vc可增强肿瘤细胞对ov的敏感性(图1)。
[0038]
1.2不同处理组对肿瘤细胞增殖的影响
[0039]
取对数生长期ct26、4t1细胞，按2
×
105/孔铺于6孔板。细胞贴壁后，分别加生理盐
水(ns)、40μl浓度为100mm的vc水溶液(vc终浓度2mm)、2
×
106pfu的ov(moi＝10)、40μl浓度为100mm的vc水溶液(vc终浓度2mm) 2
×
106pfu的ov(moi＝10)(即实施例1)处理细胞。72h后，显微镜下观察各治疗组细胞增殖状态，之后收集细胞，7-aad染色，流式细胞仪检测凋亡细胞比例。结果显示，与nc组相比，vc、ov对ct26、4t1细胞均表现出明显的细胞毒性。与单纯vc、ov组相比，vc ov组溶解细胞的比例显著增高。流式细胞检测结果显示，ov单独或联合vc组均具有促进ct26、4t1细胞发生凋亡的作用，且呈时间依赖性。72h后，与ov组相比，ov联合vc组凋亡细胞(ct26、4t1)比例显著增加(图2)。
[0040]
1.3vc促进ov复制、诱发肿瘤细胞凋亡
[0041]
以携带egfp基因的ov(ov
egfp
)、vc ov
egfp
处理ct26、4t1细胞，72h后，收集细胞，7-aad染色，流式细胞仪检测。此外，采用adeno-x快速滴度试剂盒，检测各治疗组细胞内病毒的滴度。流式检测结果显示，随着ct26、4t1细胞中ov增多，凋亡细胞数量也逐渐增高。与ov组相比，vc ov联合组，无论凋亡细胞数目或病毒感染细胞数目均显著升高。滴度检测结果显示，与ov组相比，vc ov联合组细胞内溶瘤病毒滴度显著升高(图3)。
[0042]
实验例2：不同处理方式对荷瘤小鼠的影响
[0043]
以100μl ct26(5
×
105)或4t1细胞(5
×
105)接种于balb/c小鼠皮下，建立荷瘤小鼠模型。当瘤体体积达到50-100cm3时，分组实验：ns组、vc组(只注射vc水溶液)、ov组(只注射ov)、vc ov组(注射vc水溶液和ov，即使用实施例2的联合用药物给药)，10只/组，每只小鼠体重20g。
[0044]
vc水溶液和ov的给药方式如下：采用腹腔内注射vc(200μl，4g/kg/只)，1次/天，共10天；采用瘤内注射ov(50μl，5
×
108pfu)，3天/次，共3次，测量瘤体(3天/次)，观察生存期。
[0045]
结果显示，于ov组相比，联合vc治疗组，无论ct26或4t1细胞成瘤，荷瘤小鼠瘤体体积均显著缩小，生存期显著延长。而且，ct26肿瘤组有4只瘤体完全消退，4t1肿瘤组有3只瘤体完全消退。此时，ct26肿瘤完全消退的4只小鼠再次接瘤，结果显示，其中3只小鼠的肿瘤再次消退(图4)。
[0046]
实验例3、不同处理方式对荷瘤小鼠重要脏器的毒性
[0047]
处死小鼠后，切除心、肝、脾、肺、肾，制作福尔马林固定-石蜡包埋(ffpe)切片(5μm)，h&e染色，显微镜下观察ns、vc、ov、vc ov组细胞形态的变化。结果显示，不同治疗组处理后，心、肝、脾、肺、肾脏器细胞形态无明显变化，说明vc ov治疗不会增加重要脏器的毒副作用(图5)。
[0048]
综上，本发明提供了一种维生素c(vc)和溶瘤病毒(ov)的联合用药物，采用特定用量比例的高剂量vc联合特定的ov治疗肿瘤，可以系统增强抗肿瘤效应，减小荷瘤小鼠肿瘤体积，延长生存期，且对心、肝、脾、肺、肾重要脏器无明显毒副反应，具有很好的应用前景。