一种KIR基因分型检测引物组和试剂盒的制作方法

一种kir基因分型检测引物组和试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种kir基因分型检测引物组和试剂盒。


背景技术：

2.表达于自然杀伤(natural killer,nk)细胞和部分活化的t细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer immunoglobulin-like receptor,kir)，属于免疫球蛋白超家族。基于胞外结构域的数量，可分为2个亚家族：具有2个胞外结构域的kir2d及具有3个胞外结构域kir3d；根据胞浆区的长短和免疫受体酪氨酸抑制性基序(itim)的有无，kir功能上可分为抑制型kir、激活型kir。kir识别并结合靶细胞表面的人类白细胞抗原(hla)ⅰ类分子，传递激活/抑制信号，共同调节nk细胞的活性，在移植免疫、肿瘤免疫和机体抗感染中均发挥重要作用。
3.编码kir分子的kir基因家族，定位于人类第19号染色体上，呈共显性表达，包括14种功能性kir基因(2dl1、2dl2、2dl3、2dl4、2dl5、2ds1、2ds2、2ds3、2ds4、2ds5、3dl1、3dl2、3dl3、3ds1)和2种假基因(2dp1、3dp1)。2ds4基因可细分为2ds4-deleted、2ds4-normal两种亚型
1.，其中2ds4-deleted存在22bp的缺失，引起阅读框移位，编码截短的多肽不能正常表达于细胞表面，也不能传递激活信号；而2ds4-normal不存在22bp的缺失，能表达完整的2ds4分子并传递激活信号；由于2ds4-deleted、2ds4-normal亚型的表达和功能上的差异，区分这两种不同亚型十分必要。
4.kir基因不仅存在等位基因水平的多态性，还存在单倍体组成的多态性，即每一种单倍体所携带的kir基因的种类和数量均不同。当前，国际上普遍采用序列特异性引物-pcr(sequence specific primers-pcr,pcr-ssp)、流式磁珠-序列特异性寡核苷酸探针杂交(flow-reverse sequence specific oligonucleotide probe,flow-rsso)等分子生物学方法检测kir基因的有无(presence or absence)。kir基因的pcr-ssp检测方法，无需大型贵重设备，实验操作简单，结果判读直观。flow-rsso方法检测kir基因，具有dna用量少、适合于高通量化等特点。当前，kir基因有无的检测在临床骨髓移植组织配型中正逐步开展，但尚未开展kir基因的检测试剂或方法的室间质控及能力验证。申请人曾对不同厂家的pcr-ssp、flow-rsso商品化试剂盒的检测结果进行平行对比，在77例样本的flow-rsso试剂盒检测结果中，两例样本的2dl2检测结果存在假阳性(磁珠荧光校准值略高于临界值)
2.；厂家调整了检测2dl2基因的磁珠杂交荧光信号峰的临界值后进行复检，则与pcr-ssp方法的检测结果一致。
5.基于低分辨水平kir基因有无的多态性，汉族健康无关个体的kir群体遗传学数据还存在较大的差异。以kiraa单倍体组合型的检出频率为例，有研究报道kiraa的检出频率为58.7％
3.，而有的研究报道为33％
4.。即使同一地域的人群，不同研究者采用不同方法得到的结果也存在较大差异，这可能与采用的kir基因检测试剂的质量或检测方法有关。
6.尽管当前国际上已有文献报道了pcr-ssp kir基因检测的方法
[5，6]
，如martin等
[5]
针对每种kir基因，采用2对kir基因特异性pcr引物分别进行扩增；但kir基因扩增过程中并
未就如何防止假阴性检测结果给出有效措施。
[0007]
在ipd(immuno polymorphism database)-kir数据库
[7]
(https://www.ebi.ac.uk/ipd/kir/)中，收录的kir基因的基因组全长序列为4～16kb，包含4～9个外显子。kir基因结构复杂，功能性kir3d基因中除了kir3dl3缺失第6外显子外，其余的功能性kir3d基因(3dl1、3dl2和3ds1)均含有9个外显子、8个内含子以及5
’‑
启动子区和3
’‑
utr区。在kir2d基因中，2dl1～3、2ds1～5等8种kir基因的第3外显子为假外显子(pseudoexon)；2dl4、2dl5均缺失第4外显子。
[0008]
截止2021年12月，国际ipd-kir database(release 2.11)公布的kir等位基因总数已达1535个，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,snps)广泛存在于kir基因各个外显子中。以往的研究表明：pcr引物与目的基因序列不匹配，可导致基因扩增丢失(pcr-dropout)及等位基因的漏检
[8]
，大大影响kir基因检测结果的准确性。
[0009]
参考文献：
[0010]
[1]甄建新,张国彬,喻琼,等.中国南方汉族人群kir2ds4基因的多态性.中华医学遗传学杂志.2017,34(1):21-25.
[0011]
[2]金士正,甄建新,何柳梅,等.两种不同的kir基因分型方法的对比研究.国际输血及血液学杂志,2012,35(5):385-388.
[0012]
[3]jiang k,zhu fm,lv qf,et al.distribution of killer cell immunoglobulin-like receptor genes in the chinese han population.tissue antigens.2005,65(6):556-563.
[0013]
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[0014]
[5]martin mp,carrington m.kir locus polymorphisms:genotyping and disease association analysis.methods mol biol.2008,415(1):49-64.
[0015]
[6]uhrberg m,valiante nm,shum bp,et al.human diversity in killer cell inhibitory receptorgenes.immunity.1997,7(6):753-63.
[0016]
[7]robinson j,mistry k,mcwilliam h,et al.ipd-the immuno polymorphism database.nucleic acids res.2010,38:d863-869.
[0017]
[8]曾健强,徐筠娉,王大明,等.5例样本hla-cw基因测序分型结果中等位基因丢失及其原因分析.中华医学遗传学杂志,2009,26(5):562-566.


技术实现要素：

[0018]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种kir基因分型检测引物组和试剂盒，能够快速、准确地对中国人群kir基因进行分型。
[0019]
本发明提供了一种kir基因分型检测引物组，包括19对特异性pcr引物，分别为扩增16种kir基因、2种2ds4亚型和hgh基因的引物组；
[0020]
所述引物组包括核苷酸序列如seq id no:1～seq id no:38所示的引物。
[0021]
本发明提供了所述kir基因分型检测引物组在制备kir基因分型检测试剂盒中的应用。
[0022]
本发明提供了一种kir基因分型检测试剂盒，包括所述kir基因分型检测引物组和检测试剂。
[0023]
优选的，所述检测试剂包括：10
×
pcr buffer、dntp、镁离子和taq dna聚合酶。
[0024]
优选的，所述kir基因分型的方法，包括以下步骤：
[0025]
1)将所述引物组中扩增16种kir基因和2种2ds4亚型的引物分别与hgh基因引物、其他pcr组分和ddh2o混合配制检测反应体系；将hgh基因引物、ddh2o和其他pcr组分混合配制阴性对照反应体系；
[0026]
2)将所述检测反应体系和阴性对照反应体系进行pcr扩增，得到pcr产物；
[0027]
3)检测所述pcr产物中是否含有目标片段，根据各基因扩增结果判断待测样本的kir基因型。
[0028]
优选的，所述检测反应体系为10.0μl，包括以下成分：10
×
pcr buffer 1.0μl、2.5mm dntp 0.8μl、15.0mm mgcl21.0μl、5u/μltaq dna聚合酶0.15μl、10μm kir基因上下游引物各0.5μl、10μm hgh基因上下游引物各0.1μl、基因组dna 2.0μl和ddh2o 3.85μl。
[0029]
优选的，所述阴性对照反应体系为10.0μl，包含以下成分：10
×
pcr buffer 1.0μl、2.5mm dntp 0.8μl、15.0mm mgcl21.0μl、5u/μl taq dna聚合酶0.15μl、10μmhgh基因上下游引物各0.1μl和ddh2o 6.85μl。
[0030]
优选的，所述pcr扩增的反应程序如下：95℃3min；95℃15sec，68℃15sec，72℃45sec，30个循环；72℃10min。
[0031]
优选的，所述检测pcr产物是否含有目标片段的方法包括琼脂糖凝胶电泳法。
[0032]
本发明提供的kir基因分型检测引物组，包括19对特异性pcr引物，分别为扩增16种kir基因、2种2ds4亚型和hgh基因的引物组；所述引物组包括核苷酸序列如seq id no:1～seq id no:38所示的引物。本发明在前期业已测定中国人群精细水平kir等位基因的多态性并获得了kir等位基因序列单核苷酸多态性(snps)的基础上，同时参考国际ipd-kir数据库收录的kir基因全长序列，针对kir基因家族中的16种kir基因及2种2ds4亚型，设计了具有相近退火温度的kir基因和2ds4亚型特异性pcr引物18对，每种kir基因及2ds4亚型仅用一对特异性pcr扩增引物进行扩增，简化了实验操作，并可有效防止采用的pcr引物与受检者dna不匹配出现kir基因扩增漏检和丢失(pcr-dropout)。同时针对pcr扩增假阴性结果，本发明设计了一对pcr引物，特异性扩增人体生长激素基因(hgh)片段作为内对照(长度637bp)，可有效防止pcr扩增假阴性结果。在pcr扩增时还设置了一孔阴性对照，内含hgh特异性pcr引物、taq酶等pcr组分，pcr加样时加入ddh2o代替受检者dna，可有效防止pcr污染及假阳性结果。本发明还提供了一种kir基因检测试剂盒，包含所述引物组。所述试剂盒质控措施完善，具有实验操作简单、特异性扩增产物电泳条带清晰、结果判读简单直观、实验成本低、无需大型贵重设备、实验所需时间短(可在2.0小时内完成)等技术特征，在kir群体遗传学、疾病关联、造血干细胞移植等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
[0033]
图1是实施例2中1例基因型已知为kiraa1的样本采用本发明试剂盒的鉴定效果图；
[0034]
图2是实施例3中1例基因型已知为kir bb70的样本采用本发明试剂盒的鉴定效果
图；
[0035]
图3是实施例5中编号为1800126号样本的flow-rsso检测结果；
[0036]
图4是实施例5中编号为1800126号样本测序分型的结果；
[0037]
图5是实施例5中采用本发明建立的pcr-ssp法检测编号为1800166号样本的结果。
具体实施方式
[0038]
本发明提供了一种kir基因分型检测引物组，包括19对特异性pcr引物，分别为扩增16种kir基因、2种2ds4亚型和hgh基因的引物组，具体见表1所示。
[0039]
表1 16种kir基因、2种2ds4亚型及hgh基因的扩增引物信息
[0040]
[0041][0042]
所述引物组具有相近退火温度，扩增产物片段长度介于100～300bp。所述16种kir基因及2种2ds4亚型的扩增引物均掺入hgh基因扩增引物在同一体系、同一扩增条件下进行pcr复合扩增，起内对照的作用。在本发明实施例中，所述引物委托引物合成公司完成。
[0043]
本发明提供了所述kir基因分型检测引物组在制备kir基因分型检测试剂盒中的使用。
[0044]
在本发明实施例中，所述引物组是以中国人群kir基因序列以及国际ipd-kir数据库收录的kir基因全长序列snps的基础上设计得到的，适合于中国人群、质控措施完善的鉴定kir基因有无的检测试剂盒。
[0045]
本发明提供了一种kir基因分型检测试剂盒，包括所述kir基因分型检测引物组和检测试剂。
[0046]
在本发明中，所述检测试剂优选包括：10
×
pcr buffer、dntp、镁离子和taq dna聚合酶。本发明提供了一种kir基因分型的方法，优选包括以下步骤：
[0047]
1)将所述引物组中扩增16种kir基因和2种2ds4亚型的引物分别与hgh基因引物、其他pcr组分和ddh2o混合配制检测反应体系；将hgh基因引物、ddh2o和其他pcr组分混合配制阴性对照反应体系；
[0048]
2)将所述检测反应体系和阴性对照反应体系进行pcr扩增，得到pcr产物；
[0049]
3)检测所述pcr产物中是否含有目标片段，根据各基因扩增结果判断待测样本的kir基因型。
[0050]
在本发明实施例中，pcr扩增过程中通过探索最佳的pcr扩增反应体系和扩增条件
实现高效、准确检测。所述检测反应体系为10.0μl，包括以下成分：10
×
pcrbuffer 1.0μl、2.5mm dntp 0.8μl、15.0mm mgcl21.0μl、5u/μltaq dna聚合酶0.15μl、10μmkir基因正反向引物各0.5μl、10μmhgh基因正反向引物各0.1μl、基因组dna2.0μl和ddh2o 3.85μl。阴性对照不含kir基因/2ds4亚型特异性pcr引物，pcr加样时加入ddh2o代替受检者dna，其余的pcr组分及其使用浓度相同。所述阴性对照反应体系为10.0μl，包含以下成分：10
×
pcr buffer 1.0μl、2.5mm dntp 0.8μl、15.0mm mgcl21.0μl、5u/μltaq dna聚合酶0.15μl、10μmhgh基因上下游引物各0.1μl和ddh2o 6.85μl。本发明提供的19对引物均可以在相同的反应程序下完成。所述pcr扩增的反应程序优选如下：95℃3min；95℃15sec，68℃15sec，72℃45sec，30个循环；72℃10min。
[0051]
在本发明中，所述检测pcr产物是否含有目标片段的方法优选包括琼脂糖凝胶电泳法。所述琼脂糖凝胶电泳的方法优包括以下步骤：取8μl pcr扩增产物，经核酸染料染色，于2％琼脂糖凝胶中电泳。在进行琼脂糖凝胶电泳法检测pcr产物时，上样电泳格局以及阳性扩增产物的片段大小见表2。
[0052]
表2 kir pcr-ssp扩增产物上样电泳格局及阳性扩增产物的片段大小
[0053][0054]
阴性对照应无任何pcr扩增产物条带，其余pcr反应孔应出现hgh特异性扩增产物条带。根据16种kir基因或2ds4亚型的特异性扩增产物条带的有无，直观地判定受检者所携带的kir基因或亚型。
[0055]
在本发明中，根据各基因扩增结果确定kir基因型的方法，优选包括以下步骤：
[0056]
根据rajalingam等
[9]
判定kir单倍体组合型的方法，携带kira单倍体上9种固定的kir基因(3dl1、2dl1、2dl3、2ds4、2dl4、3dl2、3dl3、2dp1和3dp1)的个体认为是kiraa单倍体组合型，缺少3dl1、2dl1、2dl3和2ds4中的一种或两种以上的个体则认为是kir bb单倍体组合型，其它的个体则认为是kirab单倍体组合型。根据14种功能性kir基因和2种kir假基因有无的实验结果，在国际数据库allele frequencynet database(网址：www.allelefrequencies.net)“genotype reference list”功能区录入检出的kir基因(有特异性检测条带的kir基因输入“1”，无特异性检测条带的kir基因输入“0”)，经查询kir单倍体组合型(hapl group)和基因组合型id号(genotype id)，可得到kir基因组合型的命名。
[0057]
参考文献
[0058]
[9]rajalingam r,du z,meenagh a,et al.distinct diversity ofkir genes in three southern indianpopulations:comparison with worldpopulations revealed a link between kir gene content and pre-historic human migrations[j].immunogenetics,2008,60(5):207-217.
[0059]
下面结合实施例对本发明提供的一种基于pcr-ssp法kir基因分型检测引物组和试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0060]
实施例1
[0061]
一种适合中国人群的kir基因分型检测引物设计及试剂盒的制备方法
[0062]
在前期工作中，采用自主创新建立的“14个功能性杀伤细胞免疫球蛋白样受体kirs基因同步测序分型的方法”(中国发明专利授权专利号：zl201710284545.3，美国发明专利授权专利号：us 10266877 b2)
[10。11]
，业已测定了中国人群(n＝306)14种功能性kir基因全部编码区的序列，检出了116种kir等位基因
[12，13。14]
(详见表4)，其中世界卫生组织(who)认可的新等位基因有48种
[12～17]
(kir新等位基因相关信息详见表5)，同时参考国际ipd-kir数据库收录的kir基因全长序列，针对kir基因家族中的16种kir基因(2dl1、2dl2、2dl3、2dl4、2dl5、2ds1、2ds2、2ds3、2ds4、2ds5、3dl1、3dl2、3dl3、3ds1、2dp1、3dp1)及2种2ds4亚型(2ds4-deleted、2ds4-normal)，设计具有相近退火温度的kir基因特异性pcr引物18对，特异性扩增每一种kir基因或亚型，扩增产物片段长度介于100～300bp。为防止pcr扩增出现假阴性结果，设计一对pcr引物，特异性扩增人体生长激素基因(hgh)片段作为内对照(长度637bp)。每条pcr引物的序列、位置以及扩增目的片段的长度等特征，如表1。
[0063]
表4中国人群14种功能性kir测序分型中检出的116种kir等位基因及其检出频率(n＝306人份)
[0064]
kir3dl3nfreq.kir2ds2nfreq.kir2dl2/3nfreq.kir2dl1nfreq.*001240.078*00101650.2122*00101110.036*00110.003*00230.010*00930.0102*00301580.190*00201760.248*00330.010neg2390.7812*01310.003*003022850.931*00450.016
ꢀꢀꢀ
3*001012840.928*0030410.003*006280.092kir2dl5bnfreq.3*0010940.013*0030510.003*008980.320*002100.0333*0011010.003*00401190.062*009850.278*006240.0783*00201740.242*03010.003*0102120.693*00810.0033*01520.007*03110.003*0100310.003*010140.0463*01910.003*03310.003*01310.003neg2590.8463*02110.003*03410.003*015200.065
ꢀꢀꢀ
3*02220.007neg30.010*0260260.020kir2ds3nfreq.3*023130.042
ꢀꢀꢀ
*028100.033*001190.0623*02510.003
ꢀꢀꢀ
*04860.020*00201320.1053*02620.007
ꢀꢀꢀ
*04802120.039neg2570.8403*02710.003
ꢀꢀꢀ
*06230.010
ꢀꢀꢀ
3*02810.003
ꢀꢀꢀ
*06320.007kir2ds5nfreq.3*02910.003
ꢀꢀꢀ
*06430.010*00201760.2483*03110.003
ꢀꢀꢀ
*06520.007neg2300.752
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
[0065]
续表4
[0066][0067][0068]
表5发明人在中国人群中发现和鉴定的48种who认可的kir新等位基因及其特征
[0069]
[0070]
[0071][0072]
检测试剂盒的组成：上述设计的19对引物(包括16种kir基因及2种2ds4亚型的特异性pcr引物18对、内对照hgh基因pcr引物1对)，不含mgcl2的10
×
pcrbuffer、dntp、taq dna聚合酶、mgcl2。
[0073]
所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
[0074]
1)在16种kir基因及2种2ds4亚型的pcr扩增反应中均掺入hgh特异性pcr引物，与每种kir基因/2ds4亚型特异性pcr引物在同一扩增条件下进行复合扩增。在pcr扩增时，设置一孔阴性对照，内含hgh特异性pcr引物、taq酶等pcr组分，pcr加样时加入ddh2o代替受检者dna，以防止pcr产物污染及假阳性结果，如表2所示。
[0075]
除阴性对照外，所述pcr扩增反应的体系见表6。
[0076]
表6实验组pcr扩增反应体系
20.
[0087]
[11]deng z,zhen j,zhang g.method for simultaneous sequence-based typing of 14functional killer cell immunoglobulin-like receptor(kir)genes.patentus 10266877 b2.date ofpatent:april 23,2019.
[0088]
[12]deng z,zhen j,harrison gf,et al.adaptiveadmixture ofhla class iallotypes enhanced genetically determined strength ofnatural killer cells in eastasians.mol biol evol.2021,38(6):2582-2596.
[0089]
[13]deng z,zhen j,zhu b,zhang g,yu q,wang d,xu y,he l,lu l.allelic diversity of kir3dl1/3ds1 in a southern chinese population.hum immunol.2015,76(9):663-666.
[0090]
[14]zhen j,he l,xu y,et al.allelic polymorphism ofkir2dl2/2dl3 in a southern chinese population.tissueantigens.2015,86(5):362-367.
[0091]
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[0094]
实施例2
[0095]
选择一例基因型已知为kiraa1的样本，采用本发明专利的pcr-ssp法的鉴定效果
[0096]
其中所述样本业已采用lifecodes kir flow-rsso试剂盒(批号lot#3008238，美国immucor公司)检测，基因型为kiraa1(携带2dl1、2dl3、2dl4、2ds4、3dl1、3dl2、3dl3、2dp1及3dp1基因)；同时该样本还经测序分型，14种功能性kir基因测序分型结果已知。
[0097]
按照实施例1记载的方法，采用所述试剂盒对基因型kiraa1的样本进行检测，最终判断kir基因型。
[0098]
电泳结果见图1。pcr扩增产物电泳结果清晰显示：阴性对照(nc)无任何扩增产物条带，其余pcr扩增反应孔中均检出了特异性内对照条带；2dl1、2dl3、2dl4、2ds4-all(2ds4-normal、2ds4-deleted亚型)、3dl1、3dl2、3dl3、2dp1及3dp1基因的扩增产物中均检出了kir基因/2ds4亚型特异性pcr扩增产物条带(详见图1)，判定结果为kiraa1基因型，与已知的结果相符。这说明本发明提供的试剂盒检测结果准确可靠。
[0099]
实施例3
[0100]
选择一例基因型已知为kir bb 70的样本，采用本发明专利的pcr-ssp法的鉴定效果。
[0101]
此样本业已采用lifecodes kir flow-rsso试剂盒(批号lot#3008238，美国immucor公司)检测，基因型为kir bb70(携带2dl1、2dl2、2dl3、2dl4、2dl5、2ds1、2ds2、2ds3、2ds5、3dl2、3dl3、3ds1、2dp1及3dp1等14种kir基因)；同时该样本还经测序分型，14种功能性kir基因测序分型结果已知。
[0102]
按照实施例1记载的方法，采用所述试剂盒对基因型为kir bb 70的样本进行检
测，最终判断kir基因型。
[0103]
电泳结果见图2。pcr扩增产物电泳结果清晰显示：阴性对照(nc)无任何扩增产物条带，其余pcr扩增反应孔中均检出了hgh特异性内对照条带；2dl1、2dl2、2dl3、2dl4、2dl5、2ds1、2ds2、2ds3、2ds5、3dl2、3dl3、3ds1、2dp1及3dp1等14种kir基因的扩增产物中均检出了kir基因特异性pcr扩增产物条带(详见图2)，判定结果为kir bb70基因型，与已知的结果完全相符。这说明本发明提供的试剂盒检测结果准确可靠。
[0104]
实施例4
[0105]
采用实施例1所述试剂盒对132例中国人群汉族健康无关个体的dna样本进行kir基因分型，具体检测方法同实施例1记载。
[0106]
同时，对相同的132例dna样本分别采用测序分型和lifecodes kir flow-rsso试剂盒(批号lot#3008238，美国immucor公司)检测。
[0107]
pcr扩增产物电泳结果条带清晰、特异，均可判定每例样本的kir基因型。本发明试剂盒检测结果和测序分型结果见表8，本发明试剂盒检测结果与测序结果的kir基因分型结果完全相符，这说明本发明提供的检测试剂盒可准确鉴定受检者kir基因的有无及2ds4亚型，有效防止kir等位基因的漏检，保证了kir基因检测结果的准确性，为系统测定中国人群kir等位基因的多态性提供了技术保障。
[0108]
实施例5
[0109]
采用本发明试剂盒检测一例“疑难”样本的kir基因型
[0110]
在研究kir基因多态性的健康个体样本中，编号为1800126号样本首先采用lifecodes kir flow-rsso试剂盒(批号lot#3008238，美国immucor公司)按照说明书进行检测。结果表明，该试剂盒共检出了8种kir基因(2dl1、2dl3、2ds4、2dl4、3dl2、3dl3、2dp1、3dp1)，其中此样本中特异性检测3dl1的第128号磁珠杂交荧光信号峰值略低于cut-off值，结果为3dl1阴性(如图3中箭头所示)，基因组合型判定为罕见型的kir aa156。
[0111]
考虑到kiraa156基因组合型较为罕见，进一步采用被誉为国际金标准的测序分型技术(pcr-sbt)对1800126号样本再次检测，以鉴定3dl1基因的有无。
[0112]
测序分型结果见图4。由图4可知，所获的序列无背景和杂峰，测序分型结果为3dl1*00101,00501。
[0113]
同时还采用本发明建立的pcr-ssp法kir基因检测技术，对编号为1800166号样本进行了检测，检测方法同实施例1记载。
[0114]
结果见图5。由图5可知，1800126号样本检出了清晰的3dl1特异性扩增产物条带，表明该样本携带了3dl1基因；检出的9种kir基因为：2dl1、2dl3、2dl4、2ds4(仅存在2ds4-deleted亚型)、3dl1、3dl2、3dl3、2dp1和3dp1，kir基因组合型为常见型的kiraa 1(aa 1与初检结果aa156的差异在于3dl1)，kiraa 1在503份南方汉族人群检出频率为54.7％。
[0115]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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