纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其构建与应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其构建方法与应用。


背景技术：

2.木质纤维素类生物质作为地球上最为丰富的可再生资源之一，在新能源的开发过程中有着非常广阔的应用前景。然而，纤维素酶的高生产成本一直是限制这类生物质转化的主要障碍。丝状真菌里氏木霉是当前纤维素酶的主要工业生产菌株，其生产的纤维素酶广泛应用于能源、纺织等领域。然而，其产量仍然无法满足工业需求，因此亟需进一步提升里氏木霉的纤维素酶产量。
3.目前用来提升纤维素酶产量的方法主要有：菌株诱变、发酵工艺优化，以及利用基因工程技术构建工程菌株等；其中通过基因工程技术改造里氏木霉基因组从而实现纤维素酶的高水平表达和分泌是降低纤维素酶高生产成本的重要手段。作为里氏木霉主要的分泌蛋白，纤维素酶的生产受到基因转录、蛋白翻译、翻译后修饰到蛋白分泌等不同层次的复杂调控。里氏木霉具有复杂的纤维素酶转录调控网络，目前已发现了至少四个转录激活因子(xyr1、ace2、ace3和hap2/3/5复合体)以及三种转录抑制因子(ace1、cre1、rce1)，这些转录因子在纤维素酶基因的表达中发挥重要功能。此外，纤维素酶在分泌过程中需要经过在内质网中的一系列蛋白折叠与分选过程，包括蛋白转运(sec61、sec63等)、蛋白折叠(bip1、pdi1等)和糖基化过程(gls1、gls2)等。通过对控制里氏木霉纤维素酶转录表达和分泌的转录调控网络和分泌途径进行改造，有望能实现纤维素酶的高效生产。然而目前所应用的基因工程手段往往局限于单一方面，这限制了里氏木霉的纤维素酶生产潜能挖掘。经检索，有关在提升纤维素酶的工程方法中对于同时改造转录水平(如xyr1等转录激活因子)和分泌过程(如关键分泌元件sec63等)的文献或技术方案以及相关纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其构建方法与应用目前尚无报道。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其构建方法与应用。
5.本发明所述纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株，其特征在于：所述菌株命名为qcds，该菌株是以里氏木霉qeb4为出发菌株，在其基因组中构建了含有以组成型启动子pcdna1表达的xyr1基因即xyr1过表达盒，其核酸序列如seq id no.1所示，同时含有以纤维素诱导型启动子pegl2表达的sec63基因即sec63过表达盒，其核酸序列如seq id no.2所示；其中xyr1基因被整合到hph位点上，该xyr1基因的上游为启动子pcdna1，下游为xyr1本源的终止子，抗性基因ptra位于上游同源臂和启动子pcdna1之间；sec63基因上游为启动子pcdna1，下游为sec63本源的终止子。
6.上述纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株的构建方法，步骤是：
7.(1)以里氏木霉qeb4基因组为模板，利用引物对cdna1-f/cdna1-r扩增组成型启动子pcdna1的核苷酸序列；以里氏木霉qeb4基因组为模板扩增xyr1基因及其终止子区域，利用引物对hph-uf/hph-ur、hph-df/hph-dr分别扩增hph基因的上下游同源臂，然后将其上游同源臂、抗性基因prta、pcdna1、xyr1基因及其终止子、下游同源臂按顺序进行融合，制得表达盒，该表达盒命名为xyr1过表达盒，其核酸序列如seq id no.1所示；其中所述引物核苷酸序列如下：
8.cdna1-f：ttcgcctaaccagcataa；
9.cdna1-r：gatcaatccaacaacttctctc；
10.hph-uf：gctgttctccaaggcgtca；
11.hph-ur：aacaaagatgcaagagcggggagccgagagggtagtaatg；
12.hph-df：agaaaggcatttagcaagaagg；
13.hph-dr：ttcagggcgaagctgtcc；
14.(2)以里氏木霉qeb4为出发菌株，制备该里氏木霉qeb4原生质体，然后将步骤(1)构建的xyr1过表达盒转化进入里氏木霉qeb4的原生体中，经筛选、验证，验证正确的菌株命名为里氏木霉纤维素酶高表达菌株qcdx；
15.(3)以里氏木霉qeb4基因组为模板，利用引物对egl2-f/egl2-r扩增纤维素诱导型启动子pegl2的核苷酸序列，利用引物对sec63-f/sec63-r扩增sec63基因及其终止子区域，然后将抗性基因hph、pegl2、sec63基因及其终止按顺序进行融合，制得表达盒，该表达盒命名为sec63过表达盒，其核酸序列如seq id no.2所示；其中所述引物核苷酸序列如下：
16.egl2-f：aaacacctcgctccagtgc；
17.egl2-r：tgtcgatgacggggagatat；
18.sec63-f：ctccccgtcatcgacagccaagatgagctcagactactc；
19.sec63-r：ttctgctattgccaagttgaaagcagacgggctgtcattg；
20.(4)制备里氏木霉纤维素酶高表达菌株qcdx的原生质体，将步骤(3)构建的sec63过表达盒转化进入里氏木霉qcdx的原生质体，经筛选、验证，验证正确的菌株命名为纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds。
21.本发明所述纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株在发酵生产纤维素酶中的应用。
22.其中：所述发酵生产纤维素酶中的发酵条件为28
±
1℃、180
±
20r/min；其中，发酵培养基配方以g/l为单位是：微晶纤维素20-40，cacl
2 1-1.5，mgso4·
7h2o 0.5-0.8，na2hpo
4 2-5，kh2po
4 3-5，(nh4)2so
4 2-4，caco
3 0.5-1.0，尿素0.1-0.5，玉米浆10-20，feso4·
7h2o 0-0.02，mnso4·
h2o 0-0.005，znso4·
7h2o 0-0.01，cocl2·
2h2o 0-0.02，ph 5.0-6.0。
23.进一步优选的实施方式是：所述发酵生产纤维素酶中的发酵条件为28℃、180r/min；其中，发酵培养基配方以g/l为单位是：微晶纤维素35，cacl2 1.0，mgso4
·
7h2o 0.6，na2hpo44，kh2po43，(nh4)2so44，caco31，尿素0.3，玉米浆20，feso4·
7h2o 0.015，mnso4·
h2o 0.001，znso4·
7h2o 0.0015，cocl2·
2h2o 0.006，ph 5.5。
24.本发明所述纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株发酵产物纤
维素酶液在水解生物质材料提升糖化后葡萄糖释放量中的应用。
25.其中，所述生物质材料优选是玉米秸秆或甘蔗渣。
26.其中，上述玉米秸秆的成分(单位：g/100ml)是：纤维素62.6％，半纤维素2.4％，木质素17.7％，其他成分6.8％。
27.其中，上述甘蔗渣的成分(单位：g/100ml)是：纤维素70％，半纤维素4.4％，木质素5.1％，其他成分20.5％。
28.本发明公开了一种纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株及其构建方法与应用。本发明通过同步过表达转录激活因子xyr1和关键分泌元件sec63获得了纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds，实验证实该菌较出发菌株具有更强的纤维素酶表达和分泌能力，且其纤维素酶的表达和分泌能力显著提升。本发明的工程菌株qcds的纤维素酶活力为27iu/ml，与出发菌株相比提高了1.75倍，且显著高于采用单过表达策略构建的菌株(如qes3菌株)，从而实现1 1＞2的产酶效果；此外，利用本发明的里氏木霉工程菌qcds所生产的纤维素酶系处理生物质材料(玉米秸秆或甘蔗渣)时，与出发株相比，葡萄糖得率显著提升(葡萄糖得率分别提升了62.6％、44.6％。)。本发明提供的工程菌株的纤维素酶产量高，生产成本低，并且该酶系可以高效应用于玉米秸秆及其他木质纤维素材料的降解，具有良好的工业开发和应用价值。
附图说明
29.图1.里氏木霉纤维素酶高表达菌株qcdx的构建和验证。
30.其中：a是qcdx构建的示意图；b是qcdx的xyr1基因转录水平分析；qeb4为出发菌株。
31.图2.里氏木霉纤维素酶高表达菌株qcdx的纤维素酶基因表达水平分析。
32.图3.纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds的构建和验证。
33.其中：a是qcds构建的示意图；b是qcds的sec63基因转录水平分析；qcdx为出发菌株。
34.图4.纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds的纤维素酶活力测定结果。
35.图5.纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds的糖化测定结果。
36.其中：a是玉米秸秆为底物的糖化测定；b是甘蔗渣为底物的糖化测定。
具体实施方式
37.下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
38.本发明使用了基因工程和分子生物学领域常规的技术和方法。本领域的技术人员可以在本发明提供的实施方式的基础上采用本领域其它常规技术、方法和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
39.本发明实施例所使用的材料、菌株、质粒、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
40.下述实施例中，所涉及的菌株里氏木霉qeb4已在qian,y.,zhong,l.,gao,j.,sun,n.,wang,y.,sun,g.,qu,y.,&zhong,y.(2017).production of highly efficient cellulase mixtures by genetically exploiting the potentials of trichoderma reesei endogenous cellulases for hydrolysis of corncob residues.microbial cell factories,16(1),207.https://doi.org/10.1186/s12934-017-0825-3中公开，其构建方法详见该篇文献。
41.实施例1.xyr1过表达盒和sec63过表达盒的构建。
42.首先以里氏木霉qeb4的基因组dna为模板，使用引物对cdna1-f/cdna1-r扩增组成型启动子pcdna1，使用引物对xyr1-f/xyr1-r扩增xyr1基因及其终止子区域，使用引物对hph-uf/hph-ur和hph-df/hph-dr扩增hph基因的上下游同源臂；并且使用引物对ptra-f1/ptra-r1从t-ptra质粒中扩增ptra表达盒。然后将hph基因的上游同源臂、抗性基因prta、pcdna1、xyr1基因及终止子、hph基因的下游同源臂进行融合，融合pcr程序为：buffer酶25μl、dntp 1μl、phata酶1μl、片段共5μg并用ddh2o补足50μl；融合程序为：95℃预变性5min，94℃变性20s、60℃退火20s、72℃延伸5min进行10个循环，72℃延伸5min，得到表达盒，该表达盒命名为xyr1过表达盒，其核酸序列如seq id no.1所示；表达盒示意图见图1a所示。
43.以里氏木霉qeb4基因组为模板，利用引物对egl2-f/egl2-r扩增纤维素诱导型启动子pegl2，利用引物对sec63-f/sec63-r扩增sec63基因及其终止子区域，以t-hph质粒为模板，使用引物对hph-f1/hph-r1扩增hph表达盒，然后将抗性基因ptra、pegl2、sec63基因及其终止子按顺序进行融合，得到表达盒，该表达盒命名为sec63过表达盒，其核酸序列如seq id no.2所示；表达盒示意图见图3a所示。
44.上述引物对具体核苷酸序列如下：
45.cdna1-f：cagacaatgatggtagcagc
46.cdna1-r：gatcaatccaacaacttctctc
47.hph-uf：gctgttctccaaggcgtca
48.hph-ur：aacaaagatgcaagagcggggagccgagagggtagtaatg
49.hph-df：agaaaggcatttagcaagaagg
50.hph-dr：ttcagggcgaagctgtcc
51.xyr1-f：atatctccccgtcatcgacaatgttgtccaatcctctccgt
52.xyr1-r：ccttcttgctaaatgcctttctctgcacgcatcatagaatcg
53.ptra-f：ccgctcttgcatctttgtt
54.ptra-r：tgaaccgattgctgcgatccccaggctttacactttat
55.egl2-f：aaacacctcgctccagtgc
56.egl2-r：tgtcgatgacggggagatat
57.sec63-f：ctccccgtcatcgacagccaagatgagctcagactactc
58.sec63-r：ttctgctattgccaagttgaaagcagacgggctgtcattg
59.hph-f1：cgacgttaactgatattgaa
60.hph-r1：caacccagggctggtgacgg。
61.实施例2.里氏木霉qcdx和qcds菌株的构建
62.里氏木霉qeb4的遗传转化是利用peg/cacl2介导的原生质体转化方法，吡啶硫胺素抗性基因ptra为选择标记。
63.分别将纯化的xyr1过表达盒转化里氏木霉qeb4原生质体构建里氏木霉纤维素酶高表达菌株qcdx。其中所述peg/cacl2介导的原生质体转化的具体方法如下：
64.(1)里氏木霉qeb4原生质体的制备：
65.准备新鲜的里氏木霉qeb4孢子(2周之内)，涂布于4-8个铺有玻璃纸的pda平板上，每个平板涂布120μl浓度为108个/ml的孢子悬液。28℃培养13.5h，待菌丝生长到合适的长度后，将菌丝从玻璃纸上轻轻洗到细胞壁裂解液中(0.15g裂解酶溶解到15ml溶液i)，混匀后28℃静置裂解90min；将裂解物用四层擦镜纸过滤，50ml离心管收集滤液；将滤液4℃，2,500rpm离心15min，弃上清；用溶液ii将轻轻地重新悬浮沉淀，4℃,2,500rpm再次离心15min后弃上清；加入200-1000μl溶液ii重悬浮沉淀，其置于冰上以备后续实验。整个制备原生质体细胞的过程需在冰上进行，所用枪头应剪掉头部。
66.其中上述pda培养基组成为：土豆250g，加水煮沸2h，8层纱布过滤，滤液添加葡萄糖20g，并补足水分至1l，自然ph，2％琼脂粉，115℃灭菌30min；
67.上述溶液i：1.2m山梨醇，0.1m kh2po4，ph 5.6，115℃灭菌30min；
68.上述溶液ii：1m山梨醇，50mm cacl2.2h2o，10mm tris-hcl，ph 7.5，115℃灭菌30min。
69.(2)xyr1过表达盒转化里氏木霉qeb4菌株
70.将xyr1过表达盒、预冷的peg溶液、qeb4原生质体按体积比1:5:24的比例混合，冰浴20min，后在混合液中加2ml预热的peg溶液，37℃水浴3min，最后加4ml溶液ii，轻轻混匀；将上述溶液加入到含0.4μg/ml吡啶硫胺素氢溴酸盐(购自sigma公司)的50ml转化上层培养基中，混匀后倒入预先凝固的转化下层培养基平板，冷却凝固后，28℃培养4-6天，挑选转化株进行分子验证，将验证正确的菌株命名为里氏木霉纤维素酶高表达菌株qcdx。
71.(3)sec63过表达盒转化里氏木霉qcdx菌株获得纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds：
72.首先，参照步骤(1)方法制备好里氏木霉纤维素酶高表达菌株qcdx的原生质体，将sec63过表达盒、预冷的peg溶液、qcdx原生质体按1：5：24的比例混合，冰浴20min，后在混合液中加2ml预热的peg溶液，37℃水浴3min，最后加4ml溶液ii，轻轻混匀；然后，将上述溶液加入到含300μg/ml潮霉素b(购自roche公司)的50ml转化上层培养基中，混匀后倒入预先凝固的转化下层培养基平板，30℃培养3-5天，冷却凝固后，28℃培养4-6天，挑选转化株进行分子验证，将验证正确的菌株命名为纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds。
73.其中上述peg培养基为：25％peg 6000，50mm cacl2.2h2o，10mm tris-hcl，ph 7.48。
74.上述转化上层培养基(g/l)：葡萄糖10，mgso4·
7h2o 1，kh2po
4 8，(nh4)2so
4 4，c6h5na3o
7 3，山梨醇182.18，琼脂糖6；
75.上述转化下层培养基(g/l)：葡萄糖10，mgso4·
7h2o 1，kh2po
4 8，(nh4)2so
4 4，c6h5na3o
7 3，琼脂粉20；以上培养基均经115℃灭菌30min后使用。
76.对比例菌株里氏木霉纤维素酶高分泌菌株qes3的构建：
77.构建方法与实施例2中qcds的构建方法类同，不同之处在于：将构建好的sec63过表达盒转化到里氏木霉qeb4中，在0.4μg/ml吡啶硫胺素氢溴酸盐的条件下进行筛选，其他均一致。验证正确的菌株命名为里氏木霉纤维素酶高分泌菌株qes3。
78.实施例3.qcdx的xyr1基因和纤维素酶基因以及qcds的sec63基因转录水平分析
79.将实施例2获得的纤维素酶高表达菌株qcdx与其出发菌株qeb4按108个/ml分别接种到50ml(250ml的三角瓶)种子培养基中，摇瓶培养40小时后分别取10ml各自接种到发酵培养基中，28℃，180rpm摇瓶培养72h，抽滤收集菌丝体并提取rna，并进行rt-qpcr分析，actin基因作为内参基因。图1b显示qcdx中的xyr1的转录量显著提升，与出发菌株相比提高了47.2倍，这表明xyr1过表达盒成功整合到基因组中。图2显示qcdx中的纤维素酶基因(cbh1、egl1、bgl1)转录量显著提升，较出发菌株分别提升了60％、30％、140％。进一步表明，在qcdx中实现了纤维素酶的高表达。
80.将实施例2获得的纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds与纤维素酶高表达菌株qcdx按上述步骤进行发酵培养，在第72h抽滤收集菌丝体并提取rna，并进行rt-qpcr分析。结果如图3b所示，显示qcds中的sec63的转录量显著提升，与其出发菌qcdx相比提高了64倍，这表明，sec63过表达盒成功整合到基因组中。
81.将对比例菌株即纤维素酶高表达菌株qes3与其出发菌qeb4按上述步骤进行发酵培养，在第72h抽滤收集菌丝体并提取rna，并进行rt-qpcr分析。qes3中的sec63的转录量较出发菌株相比提高了62倍，这表明，sec63过表达盒成功整合到qes3菌株的基因组中。
82.其中，上述种子培养基为(g/l)：葡萄糖15，蛋白胨5，尿素0.3，cacl
2 1.4，mgso4·
7h2o0.6，kh2po
4 15，(nh4)2so
4 2，115℃灭菌30min。
83.其中，上述发酵培养基为(g/l)：微晶纤维素35，cacl2 1.0，mgso4
·
7h2o 0.6，na2hpo44，kh2po43，(nh4)2so44，caco31，尿素0.3，玉米浆20，feso4·
7h2o 0.015，mnso4·
h2o 0.001，znso4·
7h2o 0.0015，cocl2·
2h2o 0.006，ph 5.5。115℃灭菌30min。
84.其中，rt-qpcr所用引物如下：
85.actin-qf：cccaagtccaaccgtgaga
86.actin-qr：caatggcgtgaggaagagc
87.xyr1-qf：tcttctacggcgtctatctcc
88.xyr1-qr：gtgtgccctaacaatggtctc
89.cbh1-qf：gcggcatggttctggtca
90.cbh1-qr：tcgtttgtcgggtaggtgga
91.egl1-qf：cggctacaaaagctactacg
92.egl1-qr：ctggtacttgcgggtgat
93.bgl1-qf：agtgacagcttcagcgag
94.bgl1-qr：ggagaggcgtgagtagttg
95.sec63-qf：tcccgcctattgacgagc
96.sec63-qr：cgagacaggctttccatcag。
97.实施例4.纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds的纤维素酶活性测定
98.将实施例2获得的工程菌株qcds、qcdx、qes3以及出发菌株qeb4(108个/ml)分别接种到50ml(250ml的三角瓶)种子培养基中，28℃，180rpm培养40小时后，每株取10ml菌液分别转接到100ml发酵培养基中培养7d后取发酵液，离心，取上清，测定纤维素酶活力。
99.滤纸酶活力根据中华人民共和国轻工业标准qb 2583-2003测定。
100.滤纸酶活力测定方法：
101.将1
×
6cm(50
±
1mg)滤纸折叠放入试管底部，加入1.5ml ph 4.8的柠檬酸缓冲液和0.5ml适当稀释的粗酶液，混匀。50℃水浴60min后加入3ml dns，漩涡震荡混匀后煮沸10min，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，540nm测od值。空白对照是先加dns再加酶液。
102.结果如图4，显示qcdx的纤维素酶活力为17.8iu/ml，比出发菌株qeb4(9.8iu/ml)提高了81.6％，进一步表明，利用启动子pcdna1过表达xyr1基因能够通过增强纤维素酶基因的表达来提升里氏木霉的纤维素酶产量；qes3的纤维素酶活力为15.5iu/ml，比出发菌株提高了58.1％，进一步表明，利用启动子pegl2过表达关键分泌元件编码基因sec63能够提升里氏木霉的纤维素酶分泌能力；工程菌株qcds的纤维素酶活力为27iu/ml，较出发菌株qeb4提高了1.75倍，且较单改造菌株分别提升了51.7％、74.2％。表明相较于单独改造调控因子或分泌元件而言，本发明方法能够通过同时增强纤维素酶的表达和分泌能力来显著提高里氏木霉纤维素酶活力。
103.实施例5.纤维素酶表达和分泌能力同步提升的里氏木霉工程菌株qcds产生的纤维素酶系在水解生物质材料中的应用
104.将实施例4获得的工程菌株qcds与qcdx、qes3、qeb4所制备的纤维素酶液分别应用于实际玉米秸秆的糖化实验中。
105.反应体系为30ml，糖化底物分别为的酸处理玉米秸秆、甘蔗渣，底物浓度为10％，各种工程菌株qcds与qcdx、qes3、qeb4所制备的纤维素酶液(纤维素酶添加量为10fpu/g底物)，用0.1m ph 4.8的乙酸钠缓冲液补齐30ml，50℃、每分钟150rpm进行糖化，糖化结束后，取糖化液，离心，取上清，利用sba-40c生物传感仪进行葡萄糖测定。
106.其中，上述玉米秸秆的成分(单位：g/100ml)是：纤维素62.6％，半纤维素2.4％，木质素17.7％，其他成分6.8％。
107.其中，上述甘蔗渣的成分(单位：g/100ml)是：纤维素70％，半纤维素4.4％，木质素5.1％，其他成分20.5％。
108.结果如图5所示，qcdx的酶液对水解玉米秸秆和甘蔗渣的葡萄糖释放量较出发菌株qeb4的葡萄糖释放量(26.2mg/ml、21.4mg/ml)分别提升了14.5％、10.0％；qes3的酶液对水解玉米秸秆和甘蔗渣的葡萄糖释放量的提升效果并不显著；工程菌qcds的酶液水解后葡萄糖释放量(42.6mg/ml、30.9mg/ml)有着显著的提升，较出发菌株qeb4相比，葡萄糖得率分别提升了62.6％、44.6％。表明相比于单独改造调控因子或分泌元件，本方法通过同时增强纤维素酶的表达和分泌能力所产生的纤维素酶系能够高效应用于木质纤维素材料的降解，并且达到1 1＞2的效果。