用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法和装置
现有技术
1.本发明基于根据独立权利要求的种类的用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法和装置。本发明的主题还是计算机程序。
2.靶标特异性dna碱基序列的扩增尤其在患者样品的分子诊断分析中起着重要作用。自从研发所谓的聚合酶链式反应(pcr)，已经为核酸建立了大量不同的检测方案和扩增反应。
3.发明公开在此背景下，通过在此提出的方式，提出了改进的方法、还有使用该方法的改进的控制装置，以及最后根据主权利要求的相应计算机程序。通过从属权利要求中列出的措施，独立权利要求中给出的装置的有利扩展和改进是可能的。
4.例如，在此提出的方式使得能够对样品中包含的dna序列的拷贝数进行绝对定量，即使在使用灵敏性低的检测反应时也是如此。此外，通过在此提出的方式，产生了有利地使用具有低特异性和/或已知假阳性率的检测反应以确定有效测试结果的可能性。
5.通过在此提出的方式，提出了用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法，其中该方法包括将至少一部分的流体分配到至少两个隔区(其也可被称为隔室、反应隔室或等分试样)中的步骤。此外，该方法包括为分配到所述至少两个隔区/隔室中的流体设定反应条件以在所述至少两个隔区/隔室中实现反应并获得各一个反应结果的步骤。此外，该方法包括识别信号，例如光学信号的强度的步骤，该信号代表隔区/隔室中可能进行的反应的反应结果。最后，该方法还包括评估信号，例如光学信号以在考虑反应特异性的检测概率函数的情况下确定拷贝数的步骤，该函数根据最初存在于隔区/隔室中的拷贝数给出隔区/隔室中进行扩增反应的概率。
6.在识别步骤中，在此例如可以通过空间分辨率识别光学信号，以使得光学信号包含或描绘来自多个隔区/隔室的信息。
7.因此，例如提出了用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法，该dna序列在下文中也被称为dna靶标或基因靶标，该方法包括分配步骤、设定步骤，识别步骤和评估步骤。
8.在分配步骤中，将样品液体(也被称为流体)例如使用至少一个接收单元分布到至少两个隔区/隔室中。在设定步骤中，为分配到所述至少两个隔区/隔室中的流体设定反应条件，以在所述流体的至少两个隔区/隔室中实现和任选引起反应并因此获得(例如阳性或阴性)反应结果。在识别步骤中，识别信号，特别是光学信号，其代表在隔室中可能进行的反应的反应结果。在评估步骤中，评估信号，特别是光学信号，即至少两个隔室的反应结果，以确定流体中的拷贝数(在统计不确定性的范畴内)。
9.在设定步骤中，也可以区分用于原则性进行检测反应的必要条件，例如可从外部设定的物理条件与充分反应条件，例如dna靶分子以足够的拷贝数存在并被检测，其中在设定步骤中创造尤其可从外部设定的对于可能进行检测反应而言所需的物理环境条件，并尤其在分配步骤中将dna靶分子分布到隔室中。
10.例如，该方法可以用于检查例如患者样品的医学领域。使用该方法检查的样品液体例如是水溶液，其例如从生物物质，例如人体来源的生物物质，例如体液、涂片、分泌物、痰、组织样品或附带样品材料的装置获得。所述样品液体中存在例如与医学、临床、诊断或治疗相关的物类，例如细菌、病毒、细胞、循环肿瘤细胞、无细胞dna或其它生物标志物和/或特别是来自所提及对象的成分。特别地，所述样品液体中存在已从上述物类的至少一种中提取或获得的dna分子。特别地，所述样品液体是预混物或其成分，其例如用于在例如至少一个接收单元的所述至少两个隔室中进行至少两个(彼此独立的)扩增反应，特别是用于在分子水平上例如通过等温扩增反应或聚合酶链式反应用于dna检测。例如，这种样品液体在此被称为流体。必要反应条件代表例如在流体中进行特定反应所需的外部影响。所述隔室可以例如在腔、微腔内或作为不可混溶的第二相中的液滴的形式提供。有利地，通过大量隔室，可以同时进行多于一种反应。从隔室发出并且尤其指示至少一种在隔室中任选进行的特定反应正在进行的信号，特别是光学信号，例如荧光信号可以例如通过识别装置，例如具有空间分辨率和用于光学激发荧光探针的光源的传感器来检测。有利地，通过该方法可以在广泛的测量范围内进行定量，和/或通过使用灵敏性降低的，特别是检测限真正地大于每隔室1个拷贝的检测反应进行定量，该检测限不允许在根据现有技术进行的数字pcr中进行定量样品分析(为此，检测限需要为每反应隔室1个拷贝)。
11.根据一个实施方案，在分配步骤中，可以将至少一部分的样品液体/流体分布到至少两个反应隔室中，以使得流体的隔区/等分试样作为反应隔室的形式存在，其中可以进行彼此独立的检测反应。有利地，这可以通过自动化过程实现。例如，流体的隔区可以存在于腔或微腔中或作为第二相(例如油)中的液滴/液滴的形式实现，其中通过使用稳定液滴界面并对抗液滴/反应隔室的不希望的合并的表面活性剂。
12.根据一个实施方案，在分配步骤中，可以将至少一部分的样品液体/流体分布到用于制造反应隔室的微腔中，其中在该微腔中可以预存(尤其)靶标特异性引物和/或探针，其可用于检测至少一种特定dna靶标。通过以特定方式将不同的靶标特异性引物和/或探针预存在装置的预定微腔中，可以因此例如通过使用紧凑型接收单元来检查样品的不同dna靶标。特别地，为此还可以使用具有有限多重性能的检测反应。
13.根据一个实施方案，在分配步骤中，可以将至少一部分的样品液体/流体分布到用于制造反应隔室的微腔中，其中微腔和特别是存在于微腔中的反应隔室具有至少两种不同体积。通过这种方式，例如可以进一步增大定量范围，因为在样品液体中的dna靶标现有浓度下，存在于反应隔室中的拷贝数的绝对数与反应隔室的体积成比例。因此，例如——在隔室中反应的特定检测限例如为每个隔室x个拷贝的情况下——也可以通过另外使用较小的反应隔室来定量地确定样品液体中的较大dna靶标浓度。
14.根据一个实施方案，在设定步骤中，必要反应条件可以代表可能引起检测反应的物理条件。所述物理条件可以是例如温度、温度分布、或添加另外流体或物质，通过其可以有利地实现和任选触发特别在隔室中存在的流体隔区中的反应。
15.根据一个实施方案，在识别步骤中，例如从至少两个反应隔室发出的信号，特别是光学信号可以通过至少一种类型的荧光探针产生并且通过检测单元识别。所述至少一种类型的荧光探针可以例如形成为添加到流体中并且例如与流体中存在的成分结合的物质。通过结合，例如使得可识别光学信号。例如，荧光探针可以为此最初由荧光团和猝灭剂构成，
其中由于福斯特共振能量转移，荧光探针首先不产生可识别的光学荧光信号。通过荧光探针与dna分子结合，可以例如通过聚合酶的核酸外切酶活性来裂解荧光探针，以使得荧光团和猝灭剂(空间上)彼此分离存在并且由荧光团产生可识别的荧光信号。有利地，由此可以例如与进行扩增反应相组合，通过光学方式检测特定dna序列的存在。
16.根据一个实施方案，识别步骤可以重新执行至少再一次，以能够识别另外的信号，特别是另外的光学信号，其代表至少两个隔室中可能进行的反应的反应结果。有利地，可以执行识别步骤多次，以使得例如可以评估多个测量值，特别是以能够借助光学信号来跟踪(阳性或阴性)检测反应的时间进程。
17.根据一个实施方案，执行识别步骤多次，以检测不同的信号，特别是不同的光学信号，特别是不同波长的光学信号。例如，可以通过这种方式使用不同的荧光探针。特别地，也可以在反应隔室中使用具有不同吸收和发射光谱的至少两种不同荧光探针，其尤其可以推断隔室中不同dna靶标的存在。通过这种方式，例如实现光谱多路复用，从而可以在反应室中检查样品液体中至少两种不同dna靶标的存在。
18.根据一个实施方案，在识别步骤之间，时间间隔改变或可变，特别是其中在评估步骤中可以确定光学信号的值、光学信号值的增加和额外或替代地光学信号的增加值的变化率可变为最大时的循环和额外或替代地时间间隔。在此，例如可以改变时间间隔、温度或循环，以使得获得光学信号的最大值，例如亮度、强度等。有利地，由此可以在使用循环检测反应，例如聚合酶链式反应时确定c
t
值，其与最初包含在样品中的拷贝数相关联并可任选有利地用于验证反应结果。
19.此外，当重复执行该方法的步骤时，识别步骤和评估步骤可以至少部分地在时间上彼此并行地执行。有利地，由此可以确定反应进程和/或缩短用于确定隔室中的反应结果和由此确定拷贝数所需的时间。
20.根据一个实施方案，在评估步骤中，最初包含在流体中的绝对拷贝数可以通过使用所述至少两个隔区/隔室的反应结果基于二项式分布和/或通过包括考虑反应的定量检测特性(例如反应特异性的检测概率函数的形式)来计算。所述二项式分布在此作为一般分布函数包括泊松分布和高斯分布作为极限情况。反应的定量检测特性在此特别描述了反应开始的概率，这取决于最初预先存在于反应隔室中的拷贝数(和在尤其分配步骤和/或设定步骤中产生的特定边界条件下)。有利地，因此可以通过使用已知的反应特异性的检测概率函数以统计显著性来确定最初预先存在于样品液体中的至少一种基因靶标的拷贝数。
21.该方法可以例如在控制装置中例如以软件或硬件的形式或以软件和硬件的混合形式实现。
22.在此提出的方式还产生控制装置，其被设计为在相应的单元中进行、控制或实施在此提出的方法的变体的步骤。通过控制装置形式的本发明的实施变体，也可以快速且有效地实现本发明所基于的目的。
23.为此，控制装置可以具有至少一个用于处理信号或数据的计算单元、至少一个用于存储信号或数据的存储单元、用于从传感器读入传感器信号或用于向致动器输出控制信号的至少一个与传感器或致动器的接口、和/或至少一个用于读入或输出嵌入在通信协议中的数据的通信接口。计算单元例如可以是信号处理器、微控制器等，其中存储单元可以是闪存、eeprom或磁存储单元。通信接口可以被设计成无线和/或有线地读入或输出数据，其
中可以读入或输出有线数据的通信接口可以例如从相应的数据传输线以电学或光学方式读入该数据或输出到相应的数据传输线。
24.在本情况下，控制装置可以理解为是指处理传感器信号并且根据其输出控制信号和/或数据信号的电装置。控制装置可以具有可在硬件和/或软件方面设计的接口。在硬件方面设计的情况下，接口可以是例如所谓的系统asic的一部分，其包含控制装置的各种功能。然而，接口也可以是单独的集成电路或至少部分地由分立元件组成。在软件方面设计的情况下，接口可以是软件模块，其例如与其它软件模块一起存在于微控制器上。
25.在一个有利的实施方式中，通过控制装置控制用于确定流体中包含的至少一种dna序列的拷贝数的方法。为此，控制装置可以例如访问传感器信号，例如用于设定反应条件的设定信号和代表隔室中可能进行的反应的反应结果的光学信号。所述控制通过致动器，例如被设计用于输出设定信号的设定单元和被设计用于识别光学信号的识别单元来进行。
26.也有利的是具有程序代码的计算机程序产品或计算机程序，该程序代码可以存储在机器可读载体或存储介质，例如半导体存储器、硬盘存储器或光学存储器上并用于进行、实施和/或控制根据上述实施方案任一项的方法的步骤，尤其是当该程序产品或程序在计算机或装置上执行时。
27.在此提出的方式的实施例在附图中示出并且在以下描述中更详细地解释。其中显示了：图1用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法的一个实施例的流程图；图2用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法的一个实施例的流程图；图3根据一个实施例的用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法的评估步骤的流程图；图4根据一个实施例的借助用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法进行的测量系列的示意图；和图5控制装置的一个实施例的框图。
28.在本发明的有利实施例的以下描述中，相同或相似的附图标记用于各个图中示出并且具有相似作用的元件，其中省略了对这些元件的重复描述。
29.图1显示了根据一个实施方案的用于确定流体中包含的至少一种dna序列的拷贝数的方法100的流程图。方法100可用于例如分子实验室诊断领域。方法100可以例如由如以下附图之一中所述的控制装置控制。
30.在方法100的步骤102中，将至少一部分的流体分配到至少两个隔区/隔室中。方法100包括进一步的设定步骤105，其为分配到所述至少两个隔区/隔室中的流体设定必要反应条件，以在所述至少两个隔区/隔室中实现反应并获得各一个反应结果。在识别步骤110中，识别信号，例如光学信号的强度，该信号代表隔室中可能进行的反应的反应结果。在信号评估步骤115中，评估信号。所述评估在考虑拷贝在隔室中的统计分布并通过使用反应特异性的检测概率函数的情况下进行，该函数根据最初存在于隔室中的拷贝数给出隔室中进行扩增反应的概率。通过这种方式，可以基于隔室中实现的反应结果以统计准确度来确定最初预先存在于流体中的至少一种靶标/dna序列的拷贝数。
31.因此在此基于至少两个(彼此独立的)的检测反应的统计评估来确定定量反应结
果。为了在大的测量范围内实现尽可能准确地定量，通常有利的是大量的隔室，通常超过10个，优选50至1000，或甚至10000至100000个。隔室的数量与定量范围成比例，取决于该定量范围应为多大，需要相应大量的彼此独立的反应隔室。
32.根据该实施例，分配步骤102在设定步骤105之前进行。流体/样品液体的分布/隔区/等分的第一步骤在此是后续评估的基础。在本文中，“隔室”或“反应隔室”被理解为是指可能可以发生检测反应的有限/限定的液体体积。例如，可以在微腔内或也可以通过产生不可混溶的第二液体中的液滴来制造隔室。为了在微腔中产生反应隔室，所述微腔尤其可以首先通过相邻的通道用样品液体填充，然后用与样品液体不可混溶的第二液体，例如油密封，其中从与微腔相邻的区域(完全)置换样品液体。
33.流体的隔区或分配是在此提出的方法的特性，定量特别是通过对隔室中的阳性/阴性反应计数来进行。
34.根据该实施例，反应条件例如代表物理条件，例如温度或温度分布，由其例如可以实现隔区/隔室中的反应。在此应注意，特异性检测反应通常特别地仅在至少一种可通过该反应检测的分子存在于隔室中时发生。否则在隔室中存在假阳性反应结果。
35.例如，通过光学信号，例如通过荧光探针，确定反应隔室中的反应结果。荧光探针例如作为能够例如与流体中的其它物质结合并由此使得可识别反应结果的物质来实现。根据该实施例，重新识别通过箭头125表示。根据该实施例此外任选的是，在识别步骤110之间，时间间隔改变或可变。此外，在评估步骤115中，可以确定光学信号的值、值的增加和/或值的变化率变为最大时的循环和/或时间间隔。当使用具有温度依赖性荧光的荧光染料时，可以通过这种方式例如实现温度循环(其例如与进行聚合酶链式反应有关)的跟踪。通过这种方式，除了隔室中的反应检测功能外，光学信号还可以用于控制隔室中的温度分布，因此特别是用于控制必要反应条件的设定。
36.根据该实施例，在评估步骤115中，通过使用各个隔室中可能进行的反应的反应结果通常基于二项式分布来计算最初包含于流体中的至少一种dna序列的绝对拷贝数(拷贝数的预计值)。二项式分布在此作为一般分布函数包括泊松分布和高斯分布作为极限情况。由此——通过使用灵敏性降低的，特别是检测限，即检测限(lod)真正地大于1的检测反应——能够计算至少一种dna序列的拷贝数，即使在检测隔室中最初存在该dna序列的多个拷贝时也是如此。
37.换言之，产生了基于检测反应特异性的扩增特性来定量dna分析的可能性。
38.迄今使用的变体是数字pcr。在数字pcr中，包含至少一种荧光探针和待分析的样品材料的pcr预混物首先分配到大量在空间上分离的，即彼此独立的反应隔室中。在反应隔室的热循环之后，通过荧光信号来确定在哪些反应隔室中进行了扩增。通过对阳性(和阴性)反应的纯粹计数，随后可以基于泊松统计来对最初存在于样品中的靶标特异性dna的数量进行绝对定量。
39.数字pcr中基于泊松统计的定量在此基于高度灵敏的pcr检测反应，其已可以可靠地检测反应隔室中单个dna靶分子的存在。然而，检测反应的灵敏性(所谓的检测限，lod)可能较低，并且通常与特异性，即可用于可靠地检测特定靶标的准确度存在竞争。如果检测反应的特异性太低，这可能导致假阳性结果。通常，在设计检测反应(例如引物设计)时，因此必须在反应的灵敏性和特异性之间找到合适的折衷。检测反应的极高特异性的规定可能与
单拷贝范围内的极高灵敏性不可兼具。
40.与迄今使用的方式相比，新提出的方式中可以在反应隔室中存在dna序列的多个拷贝，并且基于“检测反应的定量扩增特性”可以统计方式推断最初存在于液体中的 dna序列的拷贝数。“检测反应的定量扩增特性”在此描述了用于检测dna序列的扩增反应进行的概率，这取决于最初存在于反应隔室中的通过反应扩增的dna序列的拷贝数。统计计算尤其可以通过二项式分布来进行。
41.根据该实施例，为此提出了方法100，其使得能够对样品(其在此被称为流体或样品液体)中的dna序列/靶标dna进行绝对定量，即使在降低的灵敏性的情况下，即检测反应的所谓的检测限 (lod) 》 1时也是如此。此外，通过根据该实施例的方法100，考虑了扩增反应在灵敏性和特异性方面的一般检测特性(即特别是还任选包括考虑了假阳性率)，特别是扩增反应的开始行为，以由其确定有效的测试结果。
42.因此，提出了方法100，其在引入步骤102中能够将其中包含有样品材料的液体(其在此被称为流体)分配到大量的反应隔室中，这些反应隔室也被称为隔室并且可以例如以微腔形式存在。根据该实施例，方法100包括用于在隔室中制造合适的物理条件，例如温度或温度分布的设定步骤105，所述隔室使得能够在其中进行扩增反应。在识别步骤110中，例如通过由荧光探针引起的光学信号来检测各个隔室中的反应结果。为此还注意到，从各个单独的隔室中发出光学信号，其指示隔室中的反应结果。在此提到的“光学信号”此时包括从各个隔室中发出的多个光学信号。在评估步骤115中，基于作为具有泊松分布和高斯分布的极限情况的一般分布函数的二项式分布，对多个隔室中的反应结果进行统计评估，其中例如包括考虑了定量检测反应特性，特别是使用检测反应的开始行为的定量描述，即特别是考虑了检测反应的灵敏性和特异性(即特别是也任选包括考虑了假阳性率)。此外，导出统计验证的测试结果，并任选地以统计显著性计算最初预先存在于流体中的例如至少一种dna序列的绝对拷贝数。
43.有利地，由此大量给定的检测反应可以用于对最初存在于样品液体中的至少一种基因靶标的dna拷贝进行绝对定量。特别地，检测反应的较低灵敏性，即真正地大于1的检测限就足够。特别地，以较高的特异性和较低的灵敏性为特征的检测反应可用于定量。与例如受限于由泊松统计描述的范围的现有技术数字pcr相比，通过在此描述的基于更一般的二项式统计的方法100，可以任选通过使用相同的等分装置实现另一测量范围内的定量。然而，根据该实施例，这取决于扩增反应的灵敏性特性。通过对于基因靶标具有不同灵敏性和/或特异性的不同配置的检测反应的组合，可以有利地在更大的测量范围内进行定量。同样，根据该实施例，也可以基于在此提出的方法100使用具有低特异性和已知显著假阳性率的检测反应来确定有效的测试结果。在此，通过将样品液体等分到大量隔室并进行彼此(几乎)独立的扩增反应，可以基于实验确定的阳性反应比例并在包括考虑已知的反应特异性的假阳性率的情况下以统计显著性推断样品的实际性质。
44.在该基本实施方案中，在此提出的方法100包括步骤102、105、110、115。在方法100的步骤102中，将其中包含有样品材料的流体分配到多个反应隔室中。特别地，流体包含核酸。根据该实施例，所述隔室特别是都具有相同体积。在方法100的步骤105中，在隔室中制造合适的物理条件，例如温度或温度分布，其使得能够在其中进行扩增反应。这特别是基于核酸的方法，例如聚合酶链式反应或等温扩增法。在方法100的步骤110中，例如基于由至少
一种荧光探针引起的光学信号，检测各个隔室中的反应结果。例如，定量聚合酶链式反应可用作检测反应，其中使用包含指示特异性pcr产物存在的靶标特异性荧光探针的预混物。通过这种方式，可以通过荧光信号(的增加)来实时跟踪反应动力学。在方法100的步骤115中，对多个隔室中的反应结果进行统计评估。特别地，基于作为具有泊松分布和高斯分布的极限情况的一般分布函数的二项式分布并通过包括考虑检测反应的定量特性来进行所述评估。这尤其意味着通过使用该反应在灵敏性和特异性方面的开始行为。由此导出统计验证的阳性或阴性测试结果，任选地计算以统计概率最初预先存在于样品液体中的至少一种dna序列/基因靶标的绝对拷贝数。当例如使用定量聚合酶链式反应作为检测反应时，也可以额外地通过任选将各个隔室中的反应动力学与标准反应(其通过特定的最初存在的拷贝数进行)进行比较来推断最初存在于样品中的dna量，并与基于反应隔室的统计确定的测试结果相组合。
45.图2显示了根据一个实施例的用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法100的流程图。在此示出的方法100可以对应于或类似于图1中描述的方法100。仅不同地示出了步骤105、110，因为根据该实施例，它们可以并行地进行。这意味着，根据该实施例，在重复执行方法100的步骤时，设定步骤105和识别步骤110可以至少部分地在时间上彼此并行地执行。根据该实施例，步骤102、115仍然可以不变地执行。
46.根据该实施例还提出了方法100，其使得能够确定存在于流体中的至少一种dna序列的绝对拷贝数，其中为此可以使用灵敏性降低的，即检测限(lod)真正地大于1的检测反应。此外，由此允许导出有效的、任选定量的测试结果，即使在使用具有有限的灵敏性和特异性的检测反应(这些反应本身不得出有效的测试结果)时也是如此。
47.换言之，根据该实施例，步骤105和步骤110并行地执行，这意味着在进行扩增反应的过程中在多个时间点检测荧光信号。由此可以额外地确定反应进程，这可以实现阳性和阴性检测反应的还更可靠的识别。特别地，根据该实施例，可以例如在定量聚合酶链式反应中额外地确定荧光信号的增加或荧光信号增加的变化率变为最大时的循环(“c
t
值”)。由于该值同时与最初包含于流体中的拷贝数相关联，它可以任选地此外用于验证测试结果。
48.图3显示了根据一个实施例的用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法的评估步骤115的流程图。评估步骤115可以对应于图1或2之一中描述的评估步骤115。
49.在步骤115中，特别是基于来自该方法的识别步骤的反应结果，即例如测得的阳性率并通过使用考虑到检测反应的开始行为的定量特性以及样品dna在隔室中的统计分布的预定函数，计算最初存在于流体中的绝对拷贝数。
50.在下文中，更详细地描述了函数的确定，其使得能够基于在特定边界条件下特定检测反应的测得的阳性率以统计显著性计算最初预先存在于样品中的基因靶标的dna量。特别地，为了提供函数，给定微流体隔室中的检测反应的定量特性首先(近似)通过函数描述(至少在相关测量范围内)，该函数例如也可以被称为检测概率函数、检测概率(pod)函数或“检测反应的灵敏性特性”，其指示在隔室中存在刚好c个拷贝时在该隔室中进行扩增反应的概率。在此，例如赫维赛德函数可用于(简化)近似描述，因此
其中指示检测反应的检测限(lod)。通常，更复杂的函数，例如多项式也适用于定量表征扩增反应的开始行为，所述函数已基于大量实验数据集得以确定并因此还更准确地反映所用测试设置中的测定特性。进一步的(近似)描述例如通过上述赫维赛德函数与宽度的高斯函数的卷积得到以使得根据最初存在于隔室中的拷贝数的扩增反应的连续开始可以通过下列函数反映在隔室数量为和每个隔室的平均最初拷贝数为的情况下，得到下列二项式分布，其描述了最初存在刚好c个拷贝的隔室的比例：通过上面列出的用于定量描述扩增特性的函数，然后得到进行阳性检测反应的隔室的比例的隔室的比例通过扩增反应的开始的近似赫维赛德描述，公式如下以使得。相应地，对于高斯描述得到。根据对反应特性的这些(近似的、经验的)描述，发生扩增反应的隔室比例与每个隔室的最初拷贝平均数和检测反应的例如根据经验已知的检测限以及任选开始宽度直接相关。因此，可以在未知样品的情况下通过测得的阳性率和在已知(和任选已知)的情况下推断每个隔室的最初平均拷贝数并且因此确定样品中的绝对拷贝数，只要至少在一个子范围/区
间中存在函数关于变化的单调性。
51.在上一段中选择的通过积分项进行连续描述的情况下，可以使用β函数来描述二项式系数。除了连续表示之外，还可以始终使用离散描述，以得到和与其类似的其它公式。
52.图4显示了根据一个实施例的借助用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法进行的测量系列400的示意图。在此尤其通过曲线图所示的测量系列400的反应结果例如可通过如在前面描述的图1至3之一中解释的方法产生。
53.换言之，根据该实施例尤其由识别步骤中产生的荧光显微图像的示意图显示了示例性实验测量系列400。在此，使用pcr检测反应，其中使用针对诊断相关基因靶标的靶标特异性引物和荧光探针。在批次中各自存在特定量的含有基因靶标的模板 dna。每个隔室的平均拷贝数为每个隔室2、5、10和20个拷贝(cpc)。在热循环后产生的图4(a)-(d)中的荧光显微图像的示意图中，进行扩增的反应隔室呈现亮色，相反，其它部分呈现暗色。相关的定量pcr扩增曲线也以示意方式显示在图4(e)-(h)中。检测反应的阳性率从= 每个隔室2个最初拷贝(cpc)时的42%经由5 cpc时的 77%和10 cpc时的93%延伸到20 cpc时的100% (见图4 (a)-(d))。在包括考虑了最初存在的平均拷贝数和二项式统计(参见图 4 (i)，用于说明在使用96个隔室和每个隔室1、2、5、10和20个拷贝cpc的平均拷贝数时的分布函数)的情况下，可以基于测量系列400通过实验确定的阳性率来推断检测反应的灵敏性特性。
54.图 4 (j)此外显示了针对每个隔室的平均拷贝数绘制的实验确定的阳性率(测量点)和计算的阳性率(曲线)的图，所述计算的阳性率由使用赫维赛德描述(插图，细线)和高斯描述(插图，粗线)对扩增反应的开始行为建模来得到，其中使用对于扩增反应而言特性的合适参数。图 4 (j)中反映的曲线显示了计算的阳性率，其对于参数 = 2.6 (赫维赛德应用，细线)和 = 2.5， = 2.95(高斯应用，粗线)得到。特别是当使用高斯描述时，可以实现与实验确定的阳性率的良好一致性。因此，可以定量地反映每个隔室的平均最初拷贝数为2至20 的范围内的扩增反应的开始。相反，现在可以通过使用获得的扩增反应的开始行为的定量描述由实验确定的阳性率来确定最初存在于样品液体中的拷贝数。
55.图5显示了根据一个实施例的控制装置500的框图。根据该实施例，控制装置500具有设定单元505、识别单元510和评估单元515。设定单元505在此被设计为将设定信号520提供到例如设定单元525，该设定单元被形成为例如加热单元和/或冷却单元，以实现至少两个隔区/隔室中的反应并获得反应结果。识别单元510被设计为识别光学信号530，该光学信号代表隔区/隔室中可能进行的反应的反应结果532。光学信号530在此例如可由传感器单元535识别。评估单元515被设计为评估光学信号530和/或反应结果532并由此确定拷贝数。
拷贝数例如作为评估结果540可在图中图形化表示。例如，所确定的拷贝数与医学、临床、诊断或治疗相关，因此可以根据所确定的拷贝数和任选通过包括考虑进一步的信息来治疗患者。
56.如果一个实施例包括第一特征和第二特征之间的“和/或”连接词，则这应该被理解为是指该实施例根据一个实施方案既具有第一特征又具有第二特征，根据另一个实施方案只具有第一特征或只具有第二特征。
57.下面提到了关于根据本发明的方法的示例性规格：反应隔室的数量：2至1000000，优选10至30000个反应隔室的体积：5 pl至100 μl，优选500 pl至1 μl检测反应：等温扩增反应或(定量)聚合酶链式反应。
现有技术
1.本发明基于根据独立权利要求的种类的用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法和装置。本发明的主题还是计算机程序。
2.靶标特异性dna碱基序列的扩增尤其在患者样品的分子诊断分析中起着重要作用。自从研发所谓的聚合酶链式反应(pcr)，已经为核酸建立了大量不同的检测方案和扩增反应。
3.发明公开在此背景下，通过在此提出的方式，提出了改进的方法、还有使用该方法的改进的控制装置，以及最后根据主权利要求的相应计算机程序。通过从属权利要求中列出的措施，独立权利要求中给出的装置的有利扩展和改进是可能的。
4.例如，在此提出的方式使得能够对样品中包含的dna序列的拷贝数进行绝对定量，即使在使用灵敏性低的检测反应时也是如此。此外，通过在此提出的方式，产生了有利地使用具有低特异性和/或已知假阳性率的检测反应以确定有效测试结果的可能性。
5.通过在此提出的方式，提出了用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法，其中该方法包括将至少一部分的流体分配到至少两个隔区(其也可被称为隔室、反应隔室或等分试样)中的步骤。此外，该方法包括为分配到所述至少两个隔区/隔室中的流体设定反应条件以在所述至少两个隔区/隔室中实现反应并获得各一个反应结果的步骤。此外，该方法包括识别信号，例如光学信号的强度的步骤，该信号代表隔区/隔室中可能进行的反应的反应结果。最后，该方法还包括评估信号，例如光学信号以在考虑反应特异性的检测概率函数的情况下确定拷贝数的步骤，该函数根据最初存在于隔区/隔室中的拷贝数给出隔区/隔室中进行扩增反应的概率。
6.在识别步骤中，在此例如可以通过空间分辨率识别光学信号，以使得光学信号包含或描绘来自多个隔区/隔室的信息。
7.因此，例如提出了用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法，该dna序列在下文中也被称为dna靶标或基因靶标，该方法包括分配步骤、设定步骤，识别步骤和评估步骤。
8.在分配步骤中，将样品液体(也被称为流体)例如使用至少一个接收单元分布到至少两个隔区/隔室中。在设定步骤中，为分配到所述至少两个隔区/隔室中的流体设定反应条件，以在所述流体的至少两个隔区/隔室中实现和任选引起反应并因此获得(例如阳性或阴性)反应结果。在识别步骤中，识别信号，特别是光学信号，其代表在隔室中可能进行的反应的反应结果。在评估步骤中，评估信号，特别是光学信号，即至少两个隔室的反应结果，以确定流体中的拷贝数(在统计不确定性的范畴内)。
9.在设定步骤中，也可以区分用于原则性进行检测反应的必要条件，例如可从外部设定的物理条件与充分反应条件，例如dna靶分子以足够的拷贝数存在并被检测，其中在设定步骤中创造尤其可从外部设定的对于可能进行检测反应而言所需的物理环境条件，并尤其在分配步骤中将dna靶分子分布到隔室中。
10.例如，该方法可以用于检查例如患者样品的医学领域。使用该方法检查的样品液体例如是水溶液，其例如从生物物质，例如人体来源的生物物质，例如体液、涂片、分泌物、痰、组织样品或附带样品材料的装置获得。所述样品液体中存在例如与医学、临床、诊断或治疗相关的物类，例如细菌、病毒、细胞、循环肿瘤细胞、无细胞dna或其它生物标志物和/或特别是来自所提及对象的成分。特别地，所述样品液体中存在已从上述物类的至少一种中提取或获得的dna分子。特别地，所述样品液体是预混物或其成分，其例如用于在例如至少一个接收单元的所述至少两个隔室中进行至少两个(彼此独立的)扩增反应，特别是用于在分子水平上例如通过等温扩增反应或聚合酶链式反应用于dna检测。例如，这种样品液体在此被称为流体。必要反应条件代表例如在流体中进行特定反应所需的外部影响。所述隔室可以例如在腔、微腔内或作为不可混溶的第二相中的液滴的形式提供。有利地，通过大量隔室，可以同时进行多于一种反应。从隔室发出并且尤其指示至少一种在隔室中任选进行的特定反应正在进行的信号，特别是光学信号，例如荧光信号可以例如通过识别装置，例如具有空间分辨率和用于光学激发荧光探针的光源的传感器来检测。有利地，通过该方法可以在广泛的测量范围内进行定量，和/或通过使用灵敏性降低的，特别是检测限真正地大于每隔室1个拷贝的检测反应进行定量，该检测限不允许在根据现有技术进行的数字pcr中进行定量样品分析(为此，检测限需要为每反应隔室1个拷贝)。
11.根据一个实施方案，在分配步骤中，可以将至少一部分的样品液体/流体分布到至少两个反应隔室中，以使得流体的隔区/等分试样作为反应隔室的形式存在，其中可以进行彼此独立的检测反应。有利地，这可以通过自动化过程实现。例如，流体的隔区可以存在于腔或微腔中或作为第二相(例如油)中的液滴/液滴的形式实现，其中通过使用稳定液滴界面并对抗液滴/反应隔室的不希望的合并的表面活性剂。
12.根据一个实施方案，在分配步骤中，可以将至少一部分的样品液体/流体分布到用于制造反应隔室的微腔中，其中在该微腔中可以预存(尤其)靶标特异性引物和/或探针，其可用于检测至少一种特定dna靶标。通过以特定方式将不同的靶标特异性引物和/或探针预存在装置的预定微腔中，可以因此例如通过使用紧凑型接收单元来检查样品的不同dna靶标。特别地，为此还可以使用具有有限多重性能的检测反应。
13.根据一个实施方案，在分配步骤中，可以将至少一部分的样品液体/流体分布到用于制造反应隔室的微腔中，其中微腔和特别是存在于微腔中的反应隔室具有至少两种不同体积。通过这种方式，例如可以进一步增大定量范围，因为在样品液体中的dna靶标现有浓度下，存在于反应隔室中的拷贝数的绝对数与反应隔室的体积成比例。因此，例如——在隔室中反应的特定检测限例如为每个隔室x个拷贝的情况下——也可以通过另外使用较小的反应隔室来定量地确定样品液体中的较大dna靶标浓度。
14.根据一个实施方案，在设定步骤中，必要反应条件可以代表可能引起检测反应的物理条件。所述物理条件可以是例如温度、温度分布、或添加另外流体或物质，通过其可以有利地实现和任选触发特别在隔室中存在的流体隔区中的反应。
15.根据一个实施方案，在识别步骤中，例如从至少两个反应隔室发出的信号，特别是光学信号可以通过至少一种类型的荧光探针产生并且通过检测单元识别。所述至少一种类型的荧光探针可以例如形成为添加到流体中并且例如与流体中存在的成分结合的物质。通过结合，例如使得可识别光学信号。例如，荧光探针可以为此最初由荧光团和猝灭剂构成，
其中由于福斯特共振能量转移，荧光探针首先不产生可识别的光学荧光信号。通过荧光探针与dna分子结合，可以例如通过聚合酶的核酸外切酶活性来裂解荧光探针，以使得荧光团和猝灭剂(空间上)彼此分离存在并且由荧光团产生可识别的荧光信号。有利地，由此可以例如与进行扩增反应相组合，通过光学方式检测特定dna序列的存在。
16.根据一个实施方案，识别步骤可以重新执行至少再一次，以能够识别另外的信号，特别是另外的光学信号，其代表至少两个隔室中可能进行的反应的反应结果。有利地，可以执行识别步骤多次，以使得例如可以评估多个测量值，特别是以能够借助光学信号来跟踪(阳性或阴性)检测反应的时间进程。
17.根据一个实施方案，执行识别步骤多次，以检测不同的信号，特别是不同的光学信号，特别是不同波长的光学信号。例如，可以通过这种方式使用不同的荧光探针。特别地，也可以在反应隔室中使用具有不同吸收和发射光谱的至少两种不同荧光探针，其尤其可以推断隔室中不同dna靶标的存在。通过这种方式，例如实现光谱多路复用，从而可以在反应室中检查样品液体中至少两种不同dna靶标的存在。
18.根据一个实施方案，在识别步骤之间，时间间隔改变或可变，特别是其中在评估步骤中可以确定光学信号的值、光学信号值的增加和额外或替代地光学信号的增加值的变化率可变为最大时的循环和额外或替代地时间间隔。在此，例如可以改变时间间隔、温度或循环，以使得获得光学信号的最大值，例如亮度、强度等。有利地，由此可以在使用循环检测反应，例如聚合酶链式反应时确定c
t
值，其与最初包含在样品中的拷贝数相关联并可任选有利地用于验证反应结果。
19.此外，当重复执行该方法的步骤时，识别步骤和评估步骤可以至少部分地在时间上彼此并行地执行。有利地，由此可以确定反应进程和/或缩短用于确定隔室中的反应结果和由此确定拷贝数所需的时间。
20.根据一个实施方案，在评估步骤中，最初包含在流体中的绝对拷贝数可以通过使用所述至少两个隔区/隔室的反应结果基于二项式分布和/或通过包括考虑反应的定量检测特性(例如反应特异性的检测概率函数的形式)来计算。所述二项式分布在此作为一般分布函数包括泊松分布和高斯分布作为极限情况。反应的定量检测特性在此特别描述了反应开始的概率，这取决于最初预先存在于反应隔室中的拷贝数(和在尤其分配步骤和/或设定步骤中产生的特定边界条件下)。有利地，因此可以通过使用已知的反应特异性的检测概率函数以统计显著性来确定最初预先存在于样品液体中的至少一种基因靶标的拷贝数。
21.该方法可以例如在控制装置中例如以软件或硬件的形式或以软件和硬件的混合形式实现。
22.在此提出的方式还产生控制装置，其被设计为在相应的单元中进行、控制或实施在此提出的方法的变体的步骤。通过控制装置形式的本发明的实施变体，也可以快速且有效地实现本发明所基于的目的。
23.为此，控制装置可以具有至少一个用于处理信号或数据的计算单元、至少一个用于存储信号或数据的存储单元、用于从传感器读入传感器信号或用于向致动器输出控制信号的至少一个与传感器或致动器的接口、和/或至少一个用于读入或输出嵌入在通信协议中的数据的通信接口。计算单元例如可以是信号处理器、微控制器等，其中存储单元可以是闪存、eeprom或磁存储单元。通信接口可以被设计成无线和/或有线地读入或输出数据，其
中可以读入或输出有线数据的通信接口可以例如从相应的数据传输线以电学或光学方式读入该数据或输出到相应的数据传输线。
24.在本情况下，控制装置可以理解为是指处理传感器信号并且根据其输出控制信号和/或数据信号的电装置。控制装置可以具有可在硬件和/或软件方面设计的接口。在硬件方面设计的情况下，接口可以是例如所谓的系统asic的一部分，其包含控制装置的各种功能。然而，接口也可以是单独的集成电路或至少部分地由分立元件组成。在软件方面设计的情况下，接口可以是软件模块，其例如与其它软件模块一起存在于微控制器上。
25.在一个有利的实施方式中，通过控制装置控制用于确定流体中包含的至少一种dna序列的拷贝数的方法。为此，控制装置可以例如访问传感器信号，例如用于设定反应条件的设定信号和代表隔室中可能进行的反应的反应结果的光学信号。所述控制通过致动器，例如被设计用于输出设定信号的设定单元和被设计用于识别光学信号的识别单元来进行。
26.也有利的是具有程序代码的计算机程序产品或计算机程序，该程序代码可以存储在机器可读载体或存储介质，例如半导体存储器、硬盘存储器或光学存储器上并用于进行、实施和/或控制根据上述实施方案任一项的方法的步骤，尤其是当该程序产品或程序在计算机或装置上执行时。
27.在此提出的方式的实施例在附图中示出并且在以下描述中更详细地解释。其中显示了：图1用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法的一个实施例的流程图；图2用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法的一个实施例的流程图；图3根据一个实施例的用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法的评估步骤的流程图；图4根据一个实施例的借助用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法进行的测量系列的示意图；和图5控制装置的一个实施例的框图。
28.在本发明的有利实施例的以下描述中，相同或相似的附图标记用于各个图中示出并且具有相似作用的元件，其中省略了对这些元件的重复描述。
29.图1显示了根据一个实施方案的用于确定流体中包含的至少一种dna序列的拷贝数的方法100的流程图。方法100可用于例如分子实验室诊断领域。方法100可以例如由如以下附图之一中所述的控制装置控制。
30.在方法100的步骤102中，将至少一部分的流体分配到至少两个隔区/隔室中。方法100包括进一步的设定步骤105，其为分配到所述至少两个隔区/隔室中的流体设定必要反应条件，以在所述至少两个隔区/隔室中实现反应并获得各一个反应结果。在识别步骤110中，识别信号，例如光学信号的强度，该信号代表隔室中可能进行的反应的反应结果。在信号评估步骤115中，评估信号。所述评估在考虑拷贝在隔室中的统计分布并通过使用反应特异性的检测概率函数的情况下进行，该函数根据最初存在于隔室中的拷贝数给出隔室中进行扩增反应的概率。通过这种方式，可以基于隔室中实现的反应结果以统计准确度来确定最初预先存在于流体中的至少一种靶标/dna序列的拷贝数。
31.因此在此基于至少两个(彼此独立的)的检测反应的统计评估来确定定量反应结
果。为了在大的测量范围内实现尽可能准确地定量，通常有利的是大量的隔室，通常超过10个，优选50至1000，或甚至10000至100000个。隔室的数量与定量范围成比例，取决于该定量范围应为多大，需要相应大量的彼此独立的反应隔室。
32.根据该实施例，分配步骤102在设定步骤105之前进行。流体/样品液体的分布/隔区/等分的第一步骤在此是后续评估的基础。在本文中，“隔室”或“反应隔室”被理解为是指可能可以发生检测反应的有限/限定的液体体积。例如，可以在微腔内或也可以通过产生不可混溶的第二液体中的液滴来制造隔室。为了在微腔中产生反应隔室，所述微腔尤其可以首先通过相邻的通道用样品液体填充，然后用与样品液体不可混溶的第二液体，例如油密封，其中从与微腔相邻的区域(完全)置换样品液体。
33.流体的隔区或分配是在此提出的方法的特性，定量特别是通过对隔室中的阳性/阴性反应计数来进行。
34.根据该实施例，反应条件例如代表物理条件，例如温度或温度分布，由其例如可以实现隔区/隔室中的反应。在此应注意，特异性检测反应通常特别地仅在至少一种可通过该反应检测的分子存在于隔室中时发生。否则在隔室中存在假阳性反应结果。
35.例如，通过光学信号，例如通过荧光探针，确定反应隔室中的反应结果。荧光探针例如作为能够例如与流体中的其它物质结合并由此使得可识别反应结果的物质来实现。根据该实施例，重新识别通过箭头125表示。根据该实施例此外任选的是，在识别步骤110之间，时间间隔改变或可变。此外，在评估步骤115中，可以确定光学信号的值、值的增加和/或值的变化率变为最大时的循环和/或时间间隔。当使用具有温度依赖性荧光的荧光染料时，可以通过这种方式例如实现温度循环(其例如与进行聚合酶链式反应有关)的跟踪。通过这种方式，除了隔室中的反应检测功能外，光学信号还可以用于控制隔室中的温度分布，因此特别是用于控制必要反应条件的设定。
36.根据该实施例，在评估步骤115中，通过使用各个隔室中可能进行的反应的反应结果通常基于二项式分布来计算最初包含于流体中的至少一种dna序列的绝对拷贝数(拷贝数的预计值)。二项式分布在此作为一般分布函数包括泊松分布和高斯分布作为极限情况。由此——通过使用灵敏性降低的，特别是检测限，即检测限(lod)真正地大于1的检测反应——能够计算至少一种dna序列的拷贝数，即使在检测隔室中最初存在该dna序列的多个拷贝时也是如此。
37.换言之，产生了基于检测反应特异性的扩增特性来定量dna分析的可能性。
38.迄今使用的变体是数字pcr。在数字pcr中，包含至少一种荧光探针和待分析的样品材料的pcr预混物首先分配到大量在空间上分离的，即彼此独立的反应隔室中。在反应隔室的热循环之后，通过荧光信号来确定在哪些反应隔室中进行了扩增。通过对阳性(和阴性)反应的纯粹计数，随后可以基于泊松统计来对最初存在于样品中的靶标特异性dna的数量进行绝对定量。
39.数字pcr中基于泊松统计的定量在此基于高度灵敏的pcr检测反应，其已可以可靠地检测反应隔室中单个dna靶分子的存在。然而，检测反应的灵敏性(所谓的检测限，lod)可能较低，并且通常与特异性，即可用于可靠地检测特定靶标的准确度存在竞争。如果检测反应的特异性太低，这可能导致假阳性结果。通常，在设计检测反应(例如引物设计)时，因此必须在反应的灵敏性和特异性之间找到合适的折衷。检测反应的极高特异性的规定可能与
单拷贝范围内的极高灵敏性不可兼具。
40.与迄今使用的方式相比，新提出的方式中可以在反应隔室中存在dna序列的多个拷贝，并且基于“检测反应的定量扩增特性”可以统计方式推断最初存在于液体中的 dna序列的拷贝数。“检测反应的定量扩增特性”在此描述了用于检测dna序列的扩增反应进行的概率，这取决于最初存在于反应隔室中的通过反应扩增的dna序列的拷贝数。统计计算尤其可以通过二项式分布来进行。
41.根据该实施例，为此提出了方法100，其使得能够对样品(其在此被称为流体或样品液体)中的dna序列/靶标dna进行绝对定量，即使在降低的灵敏性的情况下，即检测反应的所谓的检测限 (lod) 》 1时也是如此。此外，通过根据该实施例的方法100，考虑了扩增反应在灵敏性和特异性方面的一般检测特性(即特别是还任选包括考虑了假阳性率)，特别是扩增反应的开始行为，以由其确定有效的测试结果。
42.因此，提出了方法100，其在引入步骤102中能够将其中包含有样品材料的液体(其在此被称为流体)分配到大量的反应隔室中，这些反应隔室也被称为隔室并且可以例如以微腔形式存在。根据该实施例，方法100包括用于在隔室中制造合适的物理条件，例如温度或温度分布的设定步骤105，所述隔室使得能够在其中进行扩增反应。在识别步骤110中，例如通过由荧光探针引起的光学信号来检测各个隔室中的反应结果。为此还注意到，从各个单独的隔室中发出光学信号，其指示隔室中的反应结果。在此提到的“光学信号”此时包括从各个隔室中发出的多个光学信号。在评估步骤115中，基于作为具有泊松分布和高斯分布的极限情况的一般分布函数的二项式分布，对多个隔室中的反应结果进行统计评估，其中例如包括考虑了定量检测反应特性，特别是使用检测反应的开始行为的定量描述，即特别是考虑了检测反应的灵敏性和特异性(即特别是也任选包括考虑了假阳性率)。此外，导出统计验证的测试结果，并任选地以统计显著性计算最初预先存在于流体中的例如至少一种dna序列的绝对拷贝数。
43.有利地，由此大量给定的检测反应可以用于对最初存在于样品液体中的至少一种基因靶标的dna拷贝进行绝对定量。特别地，检测反应的较低灵敏性，即真正地大于1的检测限就足够。特别地，以较高的特异性和较低的灵敏性为特征的检测反应可用于定量。与例如受限于由泊松统计描述的范围的现有技术数字pcr相比，通过在此描述的基于更一般的二项式统计的方法100，可以任选通过使用相同的等分装置实现另一测量范围内的定量。然而，根据该实施例，这取决于扩增反应的灵敏性特性。通过对于基因靶标具有不同灵敏性和/或特异性的不同配置的检测反应的组合，可以有利地在更大的测量范围内进行定量。同样，根据该实施例，也可以基于在此提出的方法100使用具有低特异性和已知显著假阳性率的检测反应来确定有效的测试结果。在此，通过将样品液体等分到大量隔室并进行彼此(几乎)独立的扩增反应，可以基于实验确定的阳性反应比例并在包括考虑已知的反应特异性的假阳性率的情况下以统计显著性推断样品的实际性质。
44.在该基本实施方案中，在此提出的方法100包括步骤102、105、110、115。在方法100的步骤102中，将其中包含有样品材料的流体分配到多个反应隔室中。特别地，流体包含核酸。根据该实施例，所述隔室特别是都具有相同体积。在方法100的步骤105中，在隔室中制造合适的物理条件，例如温度或温度分布，其使得能够在其中进行扩增反应。这特别是基于核酸的方法，例如聚合酶链式反应或等温扩增法。在方法100的步骤110中，例如基于由至少
一种荧光探针引起的光学信号，检测各个隔室中的反应结果。例如，定量聚合酶链式反应可用作检测反应，其中使用包含指示特异性pcr产物存在的靶标特异性荧光探针的预混物。通过这种方式，可以通过荧光信号(的增加)来实时跟踪反应动力学。在方法100的步骤115中，对多个隔室中的反应结果进行统计评估。特别地，基于作为具有泊松分布和高斯分布的极限情况的一般分布函数的二项式分布并通过包括考虑检测反应的定量特性来进行所述评估。这尤其意味着通过使用该反应在灵敏性和特异性方面的开始行为。由此导出统计验证的阳性或阴性测试结果，任选地计算以统计概率最初预先存在于样品液体中的至少一种dna序列/基因靶标的绝对拷贝数。当例如使用定量聚合酶链式反应作为检测反应时，也可以额外地通过任选将各个隔室中的反应动力学与标准反应(其通过特定的最初存在的拷贝数进行)进行比较来推断最初存在于样品中的dna量，并与基于反应隔室的统计确定的测试结果相组合。
45.图2显示了根据一个实施例的用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法100的流程图。在此示出的方法100可以对应于或类似于图1中描述的方法100。仅不同地示出了步骤105、110，因为根据该实施例，它们可以并行地进行。这意味着，根据该实施例，在重复执行方法100的步骤时，设定步骤105和识别步骤110可以至少部分地在时间上彼此并行地执行。根据该实施例，步骤102、115仍然可以不变地执行。
46.根据该实施例还提出了方法100，其使得能够确定存在于流体中的至少一种dna序列的绝对拷贝数，其中为此可以使用灵敏性降低的，即检测限(lod)真正地大于1的检测反应。此外，由此允许导出有效的、任选定量的测试结果，即使在使用具有有限的灵敏性和特异性的检测反应(这些反应本身不得出有效的测试结果)时也是如此。
47.换言之，根据该实施例，步骤105和步骤110并行地执行，这意味着在进行扩增反应的过程中在多个时间点检测荧光信号。由此可以额外地确定反应进程，这可以实现阳性和阴性检测反应的还更可靠的识别。特别地，根据该实施例，可以例如在定量聚合酶链式反应中额外地确定荧光信号的增加或荧光信号增加的变化率变为最大时的循环(“c
t
值”)。由于该值同时与最初包含于流体中的拷贝数相关联，它可以任选地此外用于验证测试结果。
48.图3显示了根据一个实施例的用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法的评估步骤115的流程图。评估步骤115可以对应于图1或2之一中描述的评估步骤115。
49.在步骤115中，特别是基于来自该方法的识别步骤的反应结果，即例如测得的阳性率并通过使用考虑到检测反应的开始行为的定量特性以及样品dna在隔室中的统计分布的预定函数，计算最初存在于流体中的绝对拷贝数。
50.在下文中，更详细地描述了函数的确定，其使得能够基于在特定边界条件下特定检测反应的测得的阳性率以统计显著性计算最初预先存在于样品中的基因靶标的dna量。特别地，为了提供函数，给定微流体隔室中的检测反应的定量特性首先(近似)通过函数描述(至少在相关测量范围内)，该函数例如也可以被称为检测概率函数、检测概率(pod)函数或“检测反应的灵敏性特性”，其指示在隔室中存在刚好c个拷贝时在该隔室中进行扩增反应的概率。在此，例如赫维赛德函数可用于(简化)近似描述，因此
其中指示检测反应的检测限(lod)。通常，更复杂的函数，例如多项式也适用于定量表征扩增反应的开始行为，所述函数已基于大量实验数据集得以确定并因此还更准确地反映所用测试设置中的测定特性。进一步的(近似)描述例如通过上述赫维赛德函数与宽度的高斯函数的卷积得到以使得根据最初存在于隔室中的拷贝数的扩增反应的连续开始可以通过下列函数反映在隔室数量为和每个隔室的平均最初拷贝数为的情况下，得到下列二项式分布，其描述了最初存在刚好c个拷贝的隔室的比例：通过上面列出的用于定量描述扩增特性的函数，然后得到进行阳性检测反应的隔室的比例的隔室的比例通过扩增反应的开始的近似赫维赛德描述，公式如下以使得。相应地，对于高斯描述得到。根据对反应特性的这些(近似的、经验的)描述，发生扩增反应的隔室比例与每个隔室的最初拷贝平均数和检测反应的例如根据经验已知的检测限以及任选开始宽度直接相关。因此，可以在未知样品的情况下通过测得的阳性率和在已知(和任选已知)的情况下推断每个隔室的最初平均拷贝数并且因此确定样品中的绝对拷贝数，只要至少在一个子范围/区
间中存在函数关于变化的单调性。
51.在上一段中选择的通过积分项进行连续描述的情况下，可以使用β函数来描述二项式系数。除了连续表示之外，还可以始终使用离散描述，以得到和与其类似的其它公式。
52.图4显示了根据一个实施例的借助用于确定流体中包含的dna序列的拷贝数的方法进行的测量系列400的示意图。在此尤其通过曲线图所示的测量系列400的反应结果例如可通过如在前面描述的图1至3之一中解释的方法产生。
53.换言之，根据该实施例尤其由识别步骤中产生的荧光显微图像的示意图显示了示例性实验测量系列400。在此，使用pcr检测反应，其中使用针对诊断相关基因靶标的靶标特异性引物和荧光探针。在批次中各自存在特定量的含有基因靶标的模板 dna。每个隔室的平均拷贝数为每个隔室2、5、10和20个拷贝(cpc)。在热循环后产生的图4(a)-(d)中的荧光显微图像的示意图中，进行扩增的反应隔室呈现亮色，相反，其它部分呈现暗色。相关的定量pcr扩增曲线也以示意方式显示在图4(e)-(h)中。检测反应的阳性率从= 每个隔室2个最初拷贝(cpc)时的42%经由5 cpc时的 77%和10 cpc时的93%延伸到20 cpc时的100% (见图4 (a)-(d))。在包括考虑了最初存在的平均拷贝数和二项式统计(参见图 4 (i)，用于说明在使用96个隔室和每个隔室1、2、5、10和20个拷贝cpc的平均拷贝数时的分布函数)的情况下，可以基于测量系列400通过实验确定的阳性率来推断检测反应的灵敏性特性。
54.图 4 (j)此外显示了针对每个隔室的平均拷贝数绘制的实验确定的阳性率(测量点)和计算的阳性率(曲线)的图，所述计算的阳性率由使用赫维赛德描述(插图，细线)和高斯描述(插图，粗线)对扩增反应的开始行为建模来得到，其中使用对于扩增反应而言特性的合适参数。图 4 (j)中反映的曲线显示了计算的阳性率，其对于参数 = 2.6 (赫维赛德应用，细线)和 = 2.5， = 2.95(高斯应用，粗线)得到。特别是当使用高斯描述时，可以实现与实验确定的阳性率的良好一致性。因此，可以定量地反映每个隔室的平均最初拷贝数为2至20 的范围内的扩增反应的开始。相反，现在可以通过使用获得的扩增反应的开始行为的定量描述由实验确定的阳性率来确定最初存在于样品液体中的拷贝数。
55.图5显示了根据一个实施例的控制装置500的框图。根据该实施例，控制装置500具有设定单元505、识别单元510和评估单元515。设定单元505在此被设计为将设定信号520提供到例如设定单元525，该设定单元被形成为例如加热单元和/或冷却单元，以实现至少两个隔区/隔室中的反应并获得反应结果。识别单元510被设计为识别光学信号530，该光学信号代表隔区/隔室中可能进行的反应的反应结果532。光学信号530在此例如可由传感器单元535识别。评估单元515被设计为评估光学信号530和/或反应结果532并由此确定拷贝数。
拷贝数例如作为评估结果540可在图中图形化表示。例如，所确定的拷贝数与医学、临床、诊断或治疗相关，因此可以根据所确定的拷贝数和任选通过包括考虑进一步的信息来治疗患者。
56.如果一个实施例包括第一特征和第二特征之间的“和/或”连接词，则这应该被理解为是指该实施例根据一个实施方案既具有第一特征又具有第二特征，根据另一个实施方案只具有第一特征或只具有第二特征。
57.下面提到了关于根据本发明的方法的示例性规格：反应隔室的数量：2至1000000，优选10至30000个反应隔室的体积：5 pl至100 μl，优选500 pl至1 μl检测反应：等温扩增反应或(定量)聚合酶链式反应。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
