一种芽孢杆菌在农作物抗土传病害和促进生长中的用途的制作方法

1.本发明属于生物环保技术领域，尤其涉及一种芽孢杆菌在农作物抗土传病害和促进生长中的用途。


背景技术：

2.离子型稀土矿的开采和过度使用化肥农药等人类活动破坏了土壤性状，从而造成日益严峻的污染问题。土壤是链接植物与营养物质的桥梁，遭到破坏就会降低土壤肥力和质量，影响植物生长。重金属等有害物质通过食物链富集毒性，对食品安全及人体健康构成极大威胁。国内外研究者针对土壤重金属污染的修复进行诸多尝试，如客土法、玻璃化法、电动修复法等。这些方法都不同程度地存在着操作费用高、易导致土壤退化、产生二次污染、破坏土壤生物多样性等缺点，因而不适合大范围推广运用，尤其不适合农业用地的推广运用。相比之下，植物修复－微生物协同修复作为一种相对简单、经济、有效且环境友好的土壤重金属污染生物修复方法，极具发展前景，可用于土壤原位修复。
3.植物的生长及其根际与内生的微生物关系十分密切。重金属胁迫可以影响土壤微生物微量金属元素的摄取、酶活性、蛋白质合成、dna复制和细胞分裂等，进而影响土壤微生物的生存和群落结构。研究表明，即使在高浓度的重金属环境下，抗逆的植物促生菌也能生长并产生吲哚乙酸(iaa)，iaa对植物细胞分裂分化十分重要，能促进植物生长，进而促进植物产生更大的生物量和更好的重金属吸收效果。
4.cn 110938565 a公开了一种蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019，保藏编号为gdmcc no：60778，对17种稀土离子的去除和回收效果均较理想，可广泛用于稀土离子的回收和稀土离子污染的修复。蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019对稀土离子的吸附效果好，但缺乏其对植物生长影响的相关研究和报道。


技术实现要素：

5.为解决现有技术中存在的问题，本发明对蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019的性质做了进一步的研究并考察其对特定植物生长的影响，提供一种芽孢杆菌在农作物抗土传病害和促进生长中的用途，该蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019绿色无污染，对多种病害病原菌具有较好拮抗作用，不仅具有较高的产iaa活性，还可产生铁载体和生物固氮，对圣女果等植物的生长有明显的促进作用。
6.本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
7.本发明提供一种芽孢杆菌在农作物抗土传病害和促进生长中的用途，所述芽孢杆菌为蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019，保藏编号为gdmcc no：60778。
8.优选地，所述农作物包括：水稻、黄瓜、番茄和圣女果。
9.优选地，所述土传病害包括：水稻纹枯病、黄瓜枯萎病、番茄早疫病。
10.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明对蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019的性质做了进一步的研究并考察其对特定植物生长的影响，发现该蜡样芽胞
杆菌(bacillus cereus)dw019兼具抗土传病害和促进农作物生长的功效；对多种土传病害病原菌具有较好拮抗作用，可用于水稻纹枯病(thanatephorus cucumeris)、黄瓜枯萎病(thanatephorus cucumeris)、番茄早疫病(alternaria tomatophila)等土传病的预防及抑制；对圣女果等农作物的生长有明显的促进作用，通过产吲哚乙酸、产铁载体和产nh3等方式协同促进农作物的生长。
11.蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019不仅具有较高的产iaa活性，还可产生铁载体和生物固氮。铁载体不仅能够与含铁矿物或者含铁有机物中的三价铁离子螯合形成可溶性有机物，而且能螯合其他金属离子。在重金属离子浓度高的情况下能够促进植物产生更多产铁载体，铁元素是植物生长发育所必须的元素，同时螯合的其它金属离子能在一定程度上降低重金属对蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019的毒害作用。重金属离子会在一定程度上抑制iaa的产生，然而铁载体能够缓解重金属对蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019的胁迫，促进植物的生长。生物固氮系统则可以通过固氮微生物中称之为固氮酶的复合酶系统将其还原为含氨复合物进而被植物吸收利用来促进植物生长。
附图说明
12.图1具有产iaa能力的9株菌株产iaa量的结果图。
13.图2圣女果刚种植完成的植株形态记录。
14.图3添加蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019种植圣女果30d后3组盆栽的植株形态记录。
15.图4蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019对水稻纹枯病(thanatephorus cucumeris)的拮抗作用示意图。
16.图5蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019对黄瓜枯萎病(thanatephorus cucumeris)的拮抗作用示意图。
17.图6蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019对番茄早疫病(alternaria tomatophila)的拮抗作用示意图。
具体实施方式
18.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
19.本发明中的菌株dw019指蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019。本发明中所涉及的培养基均为常规市售培养基，或可按本领域的常规方法制备。例如：所述pda液体培养基的制备方法包括如下步骤：采用去皮土豆200g切块100℃煮沸30min后过滤得到的滤液、葡萄糖20g、去离子水定容至1000ml，高压灭菌，即得。
20.实施例一 芽孢杆菌的筛选与促生性质考察
21.芽孢杆菌的筛选包括如下步骤：
22.1)芽孢杆菌的初筛：使用分析天平准确称取根际土壤10.0g，加入到带有玻璃珠和90ml无菌水的250ml三角瓶中，将其放入摇床150rpm振荡10min后，静置10min。取静置后得到的上清液1ml于ep管内，80℃条件下水浴10min，之后放入冰块中迅速冷却至室温，用移液枪吸取100μl上清液涂布到lb固体培养基上，放入37℃恒温培养箱中，让菌株在此条件下生长24h。
23.2)芽孢杆菌的纯化：次日从培养箱中拿出步骤1)中长势较好、单菌落数量较多的一个菌株的平板，每次选取培养基上长出的一个单菌落，在lb固体培养基上进行划线。由于不同菌株的形态特征以及分布规律各有不同，最终可以发现，从该稀土矿区上植物根系区域的土壤中总共筛选得到了31株菌株，且均属于芽孢杆菌。纯化培养3次，并分别编号，用浓度为30％的无菌甘油于-28℃的条件下保存备用。
24.分别将筛选并纯化得到的芽孢杆菌进行产吲哚乙酸(iaa)功能、产铁载体能力、产nh3能力的测定，具体步骤如下：
25.(1)产吲哚乙酸(iaa)的检测：分别将待测菌株接种到含0.5g/l色氨酸的lb液体培养基中摇床培养(37℃，150rpm)36h，然后取50μl悬浮液加入到白瓷板中，再加入100μl显色试剂(含4.5g/l fecl3、10.8mol/l h2so4)，常温下遮光处理30min，观察颜色变化，若颜色变红则表示有iaa产生。将培养液在8000rpm下离心5min，以1：2的体积比将离心后的上清液和显色试剂混合，着色30min后，测定550nm处的吸光度值，即可从定量的角度看出吲哚乙酸产生的多少。结果显示：筛选出的芽孢杆菌中具有产iaa能力的有9株，这些菌株产生iaa量的范围为3.65～20.27mg/l，如图1所示，其中y17-1和dw019这两种菌株产生吲哚乙酸的量相对较多，它们的产iaa量分别达到了20.27和16.06mg/l。
26.(2)产铁载体和产nh3能力的测定：分别将待测菌株接种到带无铁(kmb)培养基中摇床培养(37℃，150rpm)24h，然后8000rpm下离心5min，取上清液，按1：1的体积比将取出的上清液与cas检测溶液混合，若颜色由蓝色变成橘红色，则意味着有铁载体的产生。以富铁培养基为对照组，用分光光度法测定630nm处的吸光度值，可测定铁载体产生的数量。分别将待测菌株接种到含10ml蛋白胨水培养基的试管中，浓度为10g/l，摇床培养(37℃，150rpm)72h，每管加入0.5ml的nessler’s试剂，颜色由褐色转变为黄色表明有nh3产生。结果显示：能够产生铁载体的有3株，能够产生nh3的有8株，而同时能够产生铁载体和氨气的菌株只有3株，它们分别为p3-1、sp1-3以及dw019。另发明人惊奇的是，菌株dw019不仅具有较高的产iaa活性，又可产生铁载体和生物固氮，总体表现出较强的促生特性；而菌株y17-1虽然具有较高的产iaa活性，但不产生铁载体，也不产生nh3。
27.实施例二 蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019对植株生长的影响测定
28.从网上购得21株圣女果苗(各植株的差异较小)，选出3株植株用于测定初始的根的长度、植株的高度、植株茎的直径、植株的重量(未烘干)和叶片中所含叶绿素的量。具体方法如下：
①
根的长度：用规格较大的米尺进行测量；
②
植株的高度：用规格较大的米尺进行测量；
③
植株茎的直径：用数显游标卡尺进行测量；
④
植株的重量：将植株根部土壤用水冲洗干净后，擦干表面的水，并放置在无太阳照射处任其自然风干，用分析天平测量；
⑤
叶片中所含叶绿素的量：测定方法为分光光度法，具体操作步骤如下：取新鲜圣女果叶片洗干净、晾干后，去除叶片中脉并剪碎,在天平中放置一张称量纸，去皮后将剪碎的叶片置于其上，准确获得0.2g叶片后，将叶片同称量纸一并取出，将碎叶片倒入研钵中，用勺子加入少量碳酸钙、石英砂，再加2-3ml 95％乙醇，充分研磨，使之成为均匀的液体状，再加入10ml 95％乙醇，继续研磨，直至组织变白即可，静置几分钟后，将研钵中的所有物质倒入漏斗中进行过滤，用干净的容量瓶在漏斗下方接住液体，并将研钵、滤纸和残渣中的叶绿素洗入容量瓶，最后定容至刻度线处，即25ml，盖上盖子反复摇匀；将上述容量瓶中的溶液与95％乙醇按1:4的比例稀释后，使之混匀，立即倒入适量混匀后的溶液于比色皿中。使用同样体积
的95％乙醇作为参比溶液,使用紫外分光光度计，然后在此对照组的基础上置零，分别在波长为665nm,649nm和470nm下测定吸光度,记录好数据后，按照(2.1)、(2.2)、(2.3)、(2.4)即可进行计算，最终得出植株叶片中所含有的叶绿素含量，还能得出叶片中的类胡萝卜素含量。
29.ca(叶绿素a)＝13.95a665nm-6.88a649nm
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(2.1)
30.cb(叶绿素b)＝24.69a649nm-7.32a665nm
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(2.2)
31.总叶绿素＝ca cb
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(2.3)
32.cx.c(类胡萝卜素)＝(1000a470nm-2.05ca-114.8cb)/245
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(2.4)
33.其余18株圣女果苗置于矿山土壤中进行种植，并将其随机分成3组，每组6个平行。圣女果苗刚种植完成的植株形态如图2所示。
34.制备菌液的第一步即进行菌株的活化，往真空冷冻保藏的菌粉中加入无菌水进行溶解并借助合适规格的移液枪打匀，然后取出一部分用于稀释涂布和划线，并将平板整齐放在恒温培养箱中，让菌株在这个环境中生长12h，剩余的菌液借助甘油进行低温保存。第二步即接种，在已提前紫外灭菌并通入无菌风的超净工作台中，用接种环任意选取平板上长出的单菌落，接种至提前准备好的lb液体培养基中，于180rpm，35℃培养5h。最后即菌液浓度的测定，对培养了5h的菌株溶液进行梯度稀释，分别采用10-4
、10-5
、10-6
和10-7
浓度的菌株溶液点在平板每个格子的正中央，每个浓度的菌液点3格。次日早晨进行菌落计数，即可计算出菌液浓度。
35.3组圣女果植株分别同时加入lb液体培养基4ml、加入lb液体培养基和上述所测得浓度的菌液各2ml、加入上述所测得浓度的菌液4ml，每个盆钵装已采集并过筛的土壤1kg。每次浇水量为每盆植株100ml，晴天浇水两次，阴雨天浇水一次或不浇水，具体视情况而定，并于种植期间进行拍照记录，留心植株的生长状况。并于30d后进行如上述最初进行的指标的测定，植株形态如图3所示。为减小误差，每个指标均测量三次，取平均值。
36.研究结果表明，菌株dw019能够很大程度促进植株的生长，加入了浓度为2.36
×
109个/ml和1.18
×
109个/ml dw019菌株的圣女果植株，均比没有加入菌液、只加入了培养基的对照组植株生长更快，开出的花更多，表现出肉眼可见的长得更为枝繁叶茂，尤其是在加菌量为4ml2.36
×
109个/ml菌液的情况下，植株的根部明显比对照组植株更长，达到33.13
㎝
，植株长得更高，达到29.72
㎝
，茎明显更粗，达到5.78mm，叶绿素的含量也达到了10.347mg/g，比没有加入菌液的植株苗高出极多，鲜重达到13.050g，结果数达到5个。总的来看，将4ml浓度为2.36
×
109个/ml的菌株dw019加入种植圣女果的土壤中能够促进圣女果苗对土壤中营养物质的吸收，改善土壤环境，对植株的生长有极大的促进作用。加入y17-1菌株的圣女果植株生长情况与不加y17-1菌株的对照组植株生长情况无明显差异。可见，y17-1虽然具有较高的产iaa活性，但是不产生铁载体，也不产生nh3，对植株的生长无明显促进作用。
37.实施例三 蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019与土传病致病菌的拮抗研究
38.本发明的蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019对多种土传病害病原菌的平板对峙效果如下：先将多种土传病害病原菌在pda固体培养基(去皮土豆200g切块100℃煮沸30min后过滤得到的滤液、葡萄糖20g、琼脂15g、定容至1000ml)上进行活化，然后使用pda液体培养基进行纯化培养两次。
39.1)蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019菌液对致病菌的抑菌试验
40.分别将各种士传病害病原菌做10-1-10-4
稀释培养5d后，在无菌操作台酒精灯前操作，用移液器取0.1ml致病菌悬液，加在pda固体培养基上，接种棒消毒冷却后，用接种棒涂布均匀于平板中心，距离平板1cm处；用移液器吸取10μl的dw019菌液滴到平板上(四周四次)，每个浓度做3个平行试验。用空白平板作对照。盖上平板，在26℃培养箱中培养5d；待致病菌和蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019长出后，观察平板上的蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019对多种致病菌有抑制作用。相关抑制作用示意图如图4-图6所示。
41.2)蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019代谢产物对致病菌的抑菌试验
42.分别将各种士传病害病原菌做10-1-10-4
稀释培养5d后，将蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019的培养液8000rpm离心10min，取上清液，收集滤液即得代谢产物，在酒精灯前操作，用移液器取0.1ml致病菌悬液，加在pda平板上，接种棒消毒冷却后，用接种棒涂布均匀于平板中心，距离平板1cm处；用移液器吸取10μl的蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019代谢产物滴到平板上(四周四次)，每个浓度做3个平行试验。用空白平板作对照。盖上平板，在26℃培养箱中培养5d；待致病菌和蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019长出后，观察平板上的蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)dw019代谢产物对多种致病菌有抑制作用。
43.以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。