与女性免疫状态、生殖潜能和生殖衰老状态有关的标记物及应用

1.本技术涉及女性生殖状态相关标记物技术领域，尤其涉及与女性免疫状态、生殖潜能和生殖衰老状态有关的标记物及应用。


背景技术：

2.生殖衰老是发生在所有妇女身上的一个生理过程，与卵巢产生卵子的数量和质量下降以及低生育潜力有关。卵巢产生卵子的能力减弱和卵泡质量下降也被认为是卵巢储备功能减退的表现。女性生殖系统衰老先于其他器官系统，并与免疫老化和慢性炎症有关。目前对育龄妇女的生殖潜力和生育能力的评估主要包括体格检查、超声检查和生化检测生殖激素水平，但这些检查不能反映母体的免疫状态，也缺乏特异性免疫标志物。尽管通过这些检查可以评估女性生殖潜力，但通过当前的检查手段来预测生育能力下降的潜能仍然具有挑战性。


技术实现要素：

3.本技术发明人通过检测不同年龄组女性血清中treg细胞亚群的比例，以及分析各treg细胞亚群与育龄女性年龄和卵巢储备标记物之间的相关性，发现了hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞亚群和cd28
ˉ
treg样细胞比例与育龄女性年龄以及卵巢储备标记物之间具有明显相关性，提示hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞亚群和cd28
ˉ
treg样细胞比例具有作为判断女性免疫状态、生殖潜能和/或生殖衰老状态的标记物的巨大潜力，并以hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞亚群和cd28
ˉ
treg样细胞比例为基础建立了一种临床诊断生殖衰老、低生殖潜能的患者风险的方法。
4.第一方面，本技术实施例公开了一种与女性免疫状态、生殖潜能和生殖衰老状态至少一项有关的标记物，其中包括hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和/或cd28
ˉ
treg样细胞。
5.第二方面，本技术实施例公开了第一方面定义的标记物组合用于制备预测和/或评估女性免疫状态、生殖潜能和/或生殖衰老状态试剂或试剂盒中的用途。
6.第三方面，本技术实施例公开了第一方面定义的标记物组合用于筛选制备治疗或预防抗女性免疫低下、生殖潜能下降和/或生殖衰老药物中的用途。
7.第四方面，本技术实施例公开了一种用于预测和/或评估女性免疫状态、生殖潜能和/或生殖衰老状态试剂或试剂盒，其中包括用于检测权利要求1定义的标记物组合所表达的免疫相关分子的试剂。
8.在本技术实施例中，其中所述免疫相关分子包括cd3、cd4、cd25、cd45ra、cd127、cd28和hla-dr中的至少一项。
9.在本技术实施例中，其中所述免疫相关分子包括cd3、cd4、cd25、cd45ra、cd127、cd28和hla-dr的组合。
10.第五方面，本技术实施例公开了第一方面定义的标记物在制备女性辅助生殖技术
治疗预后预测和/或评估相关试剂或试剂盒中的应用。
11.在本技术实施例中，所述预测和/或所述评估包括：
12.建立hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞的参考值范围；
13.提取受试者外周血样本中单个核细胞，检测其中hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞比例；
14.判断受试者hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞比例是否超出参考值范围上限；
15.若是，则表明受试者具有辅助生殖技术治疗的低预后值和低生殖潜能。
16.在申请实施例中，参考值范围是基于20～24岁和25～29岁中国女性群体的外周血hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞比例和cd28
ˉ
treg样细胞比例的数据建立的。
17.与现有技术相比，本技术至少具有以下有益效果之一：
18.在本技术中发现，随着年龄的增长，cd28
ˉ
treg样细胞和hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞亚群比例明显增加。此外，treg亚群被发现与年龄和目前用于评估女性生殖潜能的卵巢储备标记物具有明显相关性。本技术以此建立参考值范围，通过对hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
tr eg样细胞比例是否超出参考值范围上限来评估采用art治疗的患者是否具有低预后值和低生殖潜能。这些结果表明，hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞具有作为反映生殖衰老免疫标记物的潜力，可以帮助临床医生识别低生殖潜能的患者，并建立个体化的治疗策略。
附图说明
19.图1为本技术实施例提供的外周免疫细胞亚群的多参数流式细胞仪分析结果；(a)淋巴细胞；(b)cd3

t细胞；(c)cd4

t细胞；(d)总treg细胞(cd4

cd25

cd127
ˉ
)；(e)cd28
ˉ
treg样细胞(cd28
ˉ
cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
)和cd28

treg样细胞(cd28

cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
)；(f)cd45ra
ˉ
treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
)和cd45ra

treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra

)；(g)hla-dr
ˉ
cd45ra
ˉ
treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
hla-dr
ˉ
)和hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
hla-dr

)。
20.图2为本技术实施例提供的不同年龄组间反映卵巢储备功能的标记物，包括卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，fsh)(a)；黄体生成素(luteinizing hormone，lh)(b)；抗缪勒管激素(anti-m
ü
llerian hormone，amh)(c)和超声检查窦卵泡计数(antral follicle count，afc)(d)；图2e和2f分别为不同年龄组间的fsh水平、amh水平和afc的比较统计图；数据用均数
±
标准差表示；*p《0.05,**p《0.01,***p《0.001,****p《0.0001。
21.图3为本技术实施例提供的不同年龄组的总treg细胞和不同treg细胞亚群的比例；(a)总的treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
)；(b)cd28

treg样细胞(cd28

cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
)；(c)cd28
ˉ
treg样细胞(cd28
ˉ
cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
)；(d)初始的treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra

)；(e)记忆性tregs(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
)；(f)hla-dr
ˉ
cd45ra
ˉ
tregs(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
hla-dr
ˉ
)；(g)hla-dr

cd45ra
ˉ
tregs(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
hla-dr

)；(h)cd28
ˉ
treg样细胞和hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞；在不同年龄组间的比较统计图；数据用均数
±
标准差表示。*p《0.05,**p《0.01,****p《0.0001。
22.图4为本技术实施例提供的年龄、卵巢储备标记物(fsh、amh和afc)和明显改变的
treg亚群(hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞)之间的相关性；(a)为年龄与生殖激素(fsh和amh水平)的相关性；(b)年龄和afc的相关性；(c)为年龄和明显改变的treg亚群(cd28
ˉ
treg样细胞和hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞)的相关性；(d)为hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞与fsh的相关性；(e)为hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和amh水平的相关性；(f)为hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和afc的相关性；(g)为cd28
ˉ
treg样细胞和afc的相关性。
具体实施方式
23.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。具体实施过程如下：
24.1、研究对象
25.本实施例根据年龄，将88名育龄妇女(受试者)分为四组(每组各22名)：20～29岁、30～34岁、35～39岁和40～49岁。受试者月经周期规律，卵巢数量正常，无卵巢手术史，无子宫内膜异位症，无内分泌紊乱。使用激素避孕药的妇女和患有自身免疫性疾病、遗传病、先天性疾病、进行过盆腔手术、放射治疗或自身免疫性内分泌疾病的妇女被排除在外。表1统计了研究人群的主要特征，包括88名受试者在各年龄阶段的人员比例、平均年龄、体重指数、促卵泡激素、黄体化激素、雌二醇、抗缪勒管激素和窦卵泡计数情况。
26.表1临床资料
[0027][0028]
2、研究方法
[0029]
(1)采集血样
[0030]
在月经周期中从受试者肘前静脉抽取外周血5ml，室温静置凝血后离心，于无菌条件下分离所得到的血清，用密度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，pbmcs)，用含10％胎牛血清(gibco)的rpmi 1640洗涤细胞，待测。
[0031]
(2)生殖激素的检测
[0032]
在unicel
tm
dxi800，贝克曼10免疫分析系统中，通过微粒化学发光分析(cima)检测amh水平。lh和fsh水平采用电化学发光免疫分析法(eclia)，罗氏8000模块分析仪和免疫分析模块(e602，罗氏诊断国际有限公司，罗特克鲁兹，瑞士)。检测血清amh、fsh、lh水平结果如表1所示。
[0033]
(3)窦卵泡计数检测
[0034]
在自然月经周期的第2至4天，受试者使用频率9mhz(hd11xe，bothell，wa)的经阴道超声扫描，检测afc。窦卵泡是指妇女卵巢中直径2～9mm左右的小卵泡。若未能观察到1～2个以上窦卵泡，afc被定义为不可见。
[0035]
(4)多参数流式细胞术检测外周血中的treg细胞亚群
[0036]
pbmcs用染色缓冲液(含有10％胎牛血清的pbs)洗涤两次，并根据说明书，加入相应荧光色素标记的单克隆抗体(表2)，4℃孵育30分钟。pbs洗涤两次，用分离缓冲液重悬细胞，采用bd lsrfortessa x-20进行多参数流式细胞检测，结果用flowjo v10 software(tree star)软件进行分析。
[0037]
表2多参数流式细胞术所用单克隆抗体信息
[0038][0039]
多参数流式细胞仪分析的其中各细胞亚群包括：总的treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
)、cd28

treg样细胞(cd28

cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
)、cd28
ˉ
treg样细胞(cd28
ˉ
cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
)、初始的treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra

)、记忆性tregs(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
)、hla-dr
ˉ
cd45ra
ˉ
treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
hla-dr
ˉ
)、hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞(cd3

cd4

cd25

cd127
ˉ
cd45ra
ˉ
hla-dr

)。
[0040]
(5)统计学分析
[0041]
使用spss统计软件版本20.0和graphpadprism版本8.0进行统计分析。所有的数据都用shapiro-wilk检验来评估分布的正态性。定量数据表示为均数
±
标准差，分类值表示为数字(n)和百分比(％)。对于偏态分布的数据，数据表示为中位数和极值(最小值和最大值)。
[0042]
在本技术中，“中位数”按顺序排列的一组数据中居于中间位置的数，代表一个样本、种群或概率分布中的一个数值，其可将数值集合划分为相等的上下两部分。对于有限的数集，可以通过把所有观察值由大至小排序后找出正中间的一个作为中位数。如果观察值有偶数个，通常取最中间的两个数值的平均数作为中位数。
[0043]
在本技术中，“参考值范围参考值范围”是相对于“中位数”所言，例如是将所有观察值至由小至大排序后，分别计算第5百分位数和第95百分位数，其中，第5百分位数作为参考值范围的下限，第95百分位数是参考值范围的上限。对应的，中位数即为第50％百分位数。
[0044]
例如，分别计算了hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞在20～29岁女性群体中的外周血中比例分布，以第5百分位数作为是参考值范围的下限，第95百分位数作为参考值范围的上限。
[0045]
其中，“第5百分位数”、“第95百分位数”的计算方法参考如下：以递增顺序将原始数据排列(即从小到大)；计算指数i＝n
×
p％(n为原始数据的个数；p为百分位数值，比如第5百分位数的5，第95百分位数的95)；若i不是整数，将i向上取整数，大于i的毗邻整数即为
第p百分位数的位置；若i是整数，则第p百分位数是第i项与第(i 1)项数据的平均值。
[0046]
分类变量的比较采用皮尔森卡方检验。用t检验来评估组间差异。单因素方差分析(多重比较)被用来确定三组之间的明显差异。皮尔森相关系数用于评估年龄、卵巢储备标记物(fsh、amh和afc)与treg亚群之间的关系。
[0047]
3、结果
[0048]
(1)不同年龄组的卵巢储备生物标记物
[0049]
结果如图2所示，fsh水平、amh水平和afc计数均随着年龄的增长而明显增加；lh水平在各年龄组间无差异。由此可见，fsh水平与年龄之间存在明显正相关，而afc水平和amh水平分别年龄与之间呈负相关。目前，现有技术中，fsh、afc和amh均被用作与卵巢储备功能相关的生物标记物。
[0050]
(2)各treg细胞亚群随年龄的增长变化情况
[0051]
本实验使用了多参数流式细胞术检测了不同年龄组外周血中treg细胞亚群随年龄增长的变化情况。图3比较不同年龄组的总treg细胞和各treg细胞亚群的百分比。
[0052]
如图3a所示，总treg细胞并未随受试者随年龄的增长而发生明显变化。如图3b所示，cd28

treg样细胞则随年龄增长而减少。如图3c所示，cd28
ˉ
treg样细胞随着年龄的增长而明显增加。如图3d所示，cd45ra

treg细胞随着年龄增长而明显减少。如图3e所示，cd45ra
ˉ
treg细胞随着年龄增长而明显增加。进一步分析发现，如图3f和3g所示，hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞亚群随着年龄增长而明显增加，而hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞在各年龄组间无明显差异。
[0053]
由此综合结果，如图3h所示，hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28

treg样细胞均随年龄增长而明显增加，呈正相关。
[0054]
(3)卵巢储备标记物与hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28

treg样细胞的相关性
[0055]
由于hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28

treg样细胞均表现了与年龄的相关性，且同卵巢储备标记物与年龄的相关性类似。为此本实施例进一步探讨了卵巢储备标记物与hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28

treg样细胞的相关性。图4显示了年龄与卵巢标记物如amh、fsh和afc之间的相关性，以及随年龄增长而明显变化的treg亚群之间的相关性。
[0056]
图4a表明，fsh水平与年龄明显正相关，而amh水平明显负相关。图4b表明afc水平与年龄呈明显负相关。图4c表明hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞均与受试者年龄呈明显正相关。图4d表明hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞与fsh水平呈明显正相关。图4e和4f分别表明hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞比例与和amh水平与afc水平均呈明显负相关。图4g表明cd28
ˉ
treg样细胞比例与afc计数之间存在明显的正相关。
[0057]
(4)基于参考值范围对不同年龄组的hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞的分布情况
[0058]
鉴于在参考值范围内与年龄和卵巢储备标记物的明显相关性，hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞比例可作为生殖衰老的免疫标记物。因此，本步骤建立了依据hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞两个细胞亚群的参考值范围值来预测和/或评估临床识别低生殖潜能的患者的方法。
[0059]
在本技术实施例中，预测和/或评估临床识别低生殖潜能的患者的方法具体包括：
[0060]
建立hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞的参考值范围；
[0061]
提取受试者外周血单个核细胞，检测其中hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞比例；
[0062]
判断受试者hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞比例是否超出参考值范围上限；
[0063]
若是，则表明受试者具有辅助生殖技术治疗的低预后值和低生殖潜能。
[0064]
在一个具体的实施例中，参考值范围是基于20～24岁和25～29岁中国女性群体的外周血hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞比例和cd28
ˉ
treg样细胞比例的数据建立的。
[0065]
例如，本步骤实施例中分别计算了hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞在外周血中比例的中位数以及第5和第95百分位数，如表3所示，hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞的参考值范围分别为3.46％～13.69％和0.08％～0.97％。
[0066]
表3 hla-dr

cd45ra
ˉ
treg和cd28
ˉ
treg细胞的参考值范围
[0067][0068]
如表4所示，使用已建立的参考值范围来评估hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞在所研究的总群体和不同年龄亚组中的分布，多数受试者的hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞比例在对应的参考值范围内，且覆盖率分别为87.4％和72.4％；但随着年龄增长超出cd28
ˉ
treg样细胞和hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞参考值范围上限的受试者比例不断增加。
[0069]
表4 hla-dr

cd45ra
ˉ
treg和cd28
ˉ
treg细胞的参考值范围分布
[0070][0071]
(5)hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞比例超过参考值范围的女性在辅助生殖技术(assisted reproductive technology，art)中具有低生殖潜力和低预后值。
[0072]
根据上述建立的hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞、生化和超声卵巢储备标记物对应的参考值范围对研究人群进行分组：hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞或cd28
ˉ
treg样细胞百分比高于参考值范围上限作为第1组，位于参考值范围内作为第2组。然后，比较两组间的平均年龄和卵巢储备标记物水平。
[0073]
表5参考值范围内及范围上限的treg亚群与各储备标记物的比较
[0074][0075]
结果如表5所示，hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞超出参考值范围上限的中位年龄和中位fsh水平分别对应明显高于位于参考值范围内的中位年龄和中位fsh水平；而超出参考值范围上限的中位amh水平和中位afc水平明显低于参考值范围内的中位水平。
[0076]
如表5，cd28
ˉ
treg样细胞超出参考值范围上限的中位年龄明显高于参考值范围内的中位年龄；而参考值范围上限以上的中位afc水平明显低于位于参考值范围内的中位afc水平。
[0077]
由此可见，使用参考值范围可以对于高龄女性采用art治疗的预后情况进行预测，hla-dr

cd45ra
ˉ
treg和cd28
ˉ
treg样细胞比例超出参考值范围上限的女性分别被分为低预后值，不被推荐使用art治疗。
[0078]
为了识别，本技术实施例建立了hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞的参考值范围作为基准，以帮助临床医生对生殖潜能较低的女性进行识别，有助于提高诊断效率。
[0079]
综上所述，在本技术中发现，随着年龄的增长，cd28
ˉ
treg样细胞和hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞亚群比例明显增加，且这两个亚群被发现与年龄和目前用于评估生殖潜能的卵巢储备标记物明显相关。本技术依此建立参考值范围，通过对hla-dr

cd45ra
ˉ
treg细胞和cd28
ˉ
treg样细胞是否超出参考值范围上限评估患者采用art治疗的低预后值和低生殖潜能。这些结果表明，这些hla-dr

cd45ra
ˉ
treg和cd28
ˉ
treg样细胞可能是有用的反映生殖衰老的免疫标记物，可以帮助临床医生识别低生殖潜能的患者，并建立个体化的治疗策略。
[0080]
以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。