一种植物乳杆菌检测的引物探针组合、RPA检测试剂盒及其检测方法与流程

一种植物乳杆菌检测的引物探针组合、rpa检测试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合、rpa检测试剂盒以及检测方法。


背景技术：

2.乳杆菌为革兰氏阳性、厌氧或兼性厌氧、无芽孢杆菌，在自然界中分布广泛。植物乳杆菌是乳杆菌的一种，与其他乳杆菌相比，该菌活性较高，能大量产酸。科学研究表明，植物乳杆菌对多种致病菌具有抑制作用，它通过与病原菌竞争限制性营养素来抑制病原菌生长，还通过其生产的乳酸、双乙酰等物质对其他细菌产生作用，调节肠道菌群之间的关系以及微生态的组成。作为一种益生菌，植物乳杆菌还具有多种保健作用，如调节免疫功能、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐受症、抑制肿瘤细胞形成和降低血清胆固醇从而预防心血管疾病等。此外，植物乳杆菌还广泛应用于食品发酵、生物防腐等领域，是一种新型的绿色添加剂。相关产业具有广阔的应用前景。
3.目前，常规益生菌检测主要通过生化反应和选择性培养计数等方法进行，不够快速准确，限制了益生菌产品的发展和应用。随着分子生物学技术的快速发展，以序列扩增为基础的核酸检测方法得到广泛应用。其中，重组酶聚合酶扩增(rpa)技术具有成本低、速度快、灵敏度高等优势，将该技术应用于植物乳杆菌检测，能够减少检测成本、简化实验流程、提高结果准确率，为益生菌产业发展助力。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术上的问题，本发明提供一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合、rpa检测试剂盒以及检测方法，特异性强，灵敏度高，重复性好，简化检测步骤、提高检测效率。
5.本发明提供以下技术方案：
6.一种用于植物乳杆菌检测的引物探针组合，所述上、下游引物的核苷酸序列分别如seq id no.1、2所示，基因探针的核苷酸序列如seq id no.3所示的。
7.进一步的，上、下引物应用于pcr反应中的终浓度为0.4μm，荧光探针应用于pcr反应中的终浓度为0.12μm。
8.进一步的，所述seq id no.3即荧光标记探针序列5’端起第34位碱基标记fam荧光基团，第35位为无碱基位点，第37位碱基标记bhq1猝灭基团。
9.一种将引物探针组合用于植物乳杆菌rpa检测试剂盒的应用。
10.一种采用引物探针组合的植物乳杆菌rpa检测试剂盒，包括权利要求1所述的引物探针组合，还包括快速核酸释放剂、缓冲液体系a、缓冲液体系b和干粉反应管。
11.进一步的，所述快速核酸释放剂包括质量浓度为1mg/ml～20mg/ml的溶菌酶、体积百分比为1％～5％的聚乙二醇、摩尔浓度为0.5mm～5mm的二硫苏糖醇和摩尔浓度为1mm～
10mm的tris-hcl。
12.进一步的，所述缓冲液体系a包括peg-6000和无核酸酶水，所述缓冲液体系b包括醋酸镁和无核酸酶水，所述干粉反应管包含单链dna结合蛋白、重组酶、链置换dna聚合酶、海藻糖、peg-6000和dntps。
13.一种利用植物乳杆菌rpa检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
14.(1)将待测样本与快速核酸释放剂充分混合，核酸释放剂与样本的混合比例为3：3～20，混合物于25℃～95℃孵育1～10min，完成核酸释放；
15.(2)向每个反应管中依次加入29.4μl缓冲液体系a、2μl上游引物、2μl下游引物、0.6μl荧光探针和8.5μl无核酸酶水；
16.(3)向每个反应管中加入5μl样本与核酸释放剂的混合物；
17.(4)向每个反应管中加入2.5μl缓冲液体系b，混匀并离心后，进行上机检测，反应程序为：42℃反应20min，每30s读取一次荧光值，判断植物乳杆菌是否检出。
18.进一步的，步骤(4)中先判断扩增过程中是否产生指数扩增曲线，未产生指数扩增曲线则判定为阴性；
19.产生指数扩增曲线，按照下表进行判读：
20.。
21.采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：
22.1、本发明提供的引物探针针对植物乳杆菌基因组保守区域设计并经过筛选，具有良好的特异性和灵敏度，检出限低。
23.2、本发明的快速核酸释放剂只需与样本简单混合后孵育，即可完成样本核酸释放过程，提高了提取效率，减少了试剂和样品用量，简化了操作步骤，降低了人工成本，具有高效率，低成本，高质量等优点。处理后的样本无需进一步纯化，可直接用于rpa检测。
24.3、本发明提供的植物乳杆菌检测方法将等温rpa检测技术与快速核酸释放剂结合，可在30分钟左右完成从样本到结果的检测全流程，大幅提高了检测效率。
附图说明
25.图1为使用本发明的试剂盒进行植物乳杆菌检测的特异性测定的结果示意图。
26.图2-4为使用本发明的试剂盒进行植物乳杆菌检测的灵敏度测定的三次结果示意图。
27.图5为为使用本发明的试剂盒进行植物乳杆菌检测的重复实验结果示意图。
具体实施方式
28.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
29.实施例1
30.本发明提供了一种植物乳杆菌检测的引物探针组合，根据ncbi数据库提供的植物乳杆菌全基因组序列，通过blast比对,选择保守特异性序列作为检测靶标，如seq id no.4所示，序列如下：
[0031]5’‑
atgccatttaatggttatcagacgtattatcgaatcgtaggggatcggcaatcaaataagacaccgttagttttgctacatggtggtccaggatcaacgcataattactttgaaggatttgatgacctggccgttcaaacgggacgaccaatcgtcatgtatgatcaattaggctgtgggcgttcatcgatacctgatgacgatcaattatggcaagccgcaacgtgggtggcagagttacaggcgttacgtacgtatttagacttacccgagattcacttactagggcagtcctggggtggtatgctagctattatttatggttgtgactatcgaccacaggggattaaaagtttgattttagccagtaccttgtcttcagcccgactgtgggctcaggaacagcatcggatgattcggttaatgtccccagcggattagtcggctattgcgacagcagaacggttacaggatttcacaggtgctgcctacctgactgctaatcaacattttatgacgcaacatgcgtcgggcccgattactgctgatgatcctgaattcctacggcgatcaaaacgggtggggaccacggcttataatgtagcgtggggtcccaatgaatataatccgactggtacgttggcggattatgagtataccgaccgattacagtatttgcagatgccaactttagtcaccagtggaacggatgatttgtgtacgccattagtcgctaagaccatggtcgaccagttacctcatgcgacttggacgttatttccccgtagccgtcacatggcgtttgtcgatgaaaacacggcctatatgacgcgattgcgtcactggctagcagcccatgattag-3’[0032]
根据上述检测靶标序列以及引物探针的要求，设计得到一种用于植物乳杆菌特异性检测的引物探针组合，包括上游引物、下游引物和荧光探针。所述上游引物和下游引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示，所述荧光探针的核苷酸序列如seq id no.3所示，如下：
[0033]
seq id no.1：
[0034]5’‑
tcccaatgaatataatccgactggtacgttg-3’。
[0035]
seq id no.2：
[0036]5’‑
taactggtcgaccatggtcttagcgactaatg-3’[0037]
seq id no.3：
[0038]5’‑
ccgaccgattacagtatttgcagatgccaacttgcaccagtggaacgga-3’[0039]
各引物应用于pcr反应中的终浓度为0.4μm，基因探针应用于pcr反应中的终浓度为0.12μm。seq id no.3即荧光标记探针序列5’端起第34位碱基标记fam荧光基团，第35位为无碱基位点，第37位碱基标记bhq1猝灭基团。
[0040]
实施例2
[0041]
本发明的引物探针组合可以作为用于植物乳杆菌rpa检测试剂盒的应用。
[0042]
本发明提供了一种采用引物探针组合的植物乳杆菌rpa检测试剂盒。
[0043]
试剂盒还包括快速核酸释放剂、缓冲液体系a和缓冲液体系b和干粉反应管。
[0044]
快速核酸释放剂包括质量浓度为2.5mg/ml的溶菌酶、体积百分比为2.5％的聚乙二醇、摩尔浓度为1mm的二硫苏糖醇和摩尔浓度为5mm的tris-hcl。
[0045]
其中，所述缓冲液体系a包括peg-6000和无核酸酶水，所述缓冲液体系b包括醋酸镁和无核酸酶水，所述干粉反应管包含单链dna结合蛋白、重组酶、链置换dna聚合酶、海藻糖、peg-6000和dntps。
[0046]
在本实施例中，缓冲液体系a、缓冲液体系b和干粉反应管购自潍坊安普未来生物科技有限公司。
[0047]
本实施例提供一种利用本发明免提取rpa等温快速检测试剂盒进行植物乳杆菌检测的方法，步骤如下：
[0048]
(1)将待测样本与快速核酸释放剂充分混合，核酸释放剂与样本的混合比例为3：3～20，最优比为1:1，混合物于25℃～95℃，最优温度为37℃，孵育1～10min，完成核酸释放；
[0049]
(2)向每个反应管中依次加入29.4μl缓冲液体系a、2μl上游引物、2μl下游引物、0.6μl荧光探针和8.5μl无核酸酶水；
[0050]
(3)向每个反应管中加入5μl样本与核酸释放剂的混合物；
[0051]
(4)向每个反应管中加入2.5μl缓冲液体系b，混匀并离心后，进行上机检测，反应程序为：42℃反应20min，每30s读取一次荧光值。
[0052]
步骤(4)中先判断扩增过程中是否产生指数扩增曲线，未产生指数扩增曲线则判定为阴性；
[0053]
产生指数扩增曲线，按照表1进行判读：
[0054]
表1检测结果判读原则
[0055][0056]
ct值代表扩增曲线与设定阈值线相交时的循环数，ct值越小，荧光强度达到阈值时所需的pcr循环次数越少。样本中靶标序列的浓度越高；ct值越大，荧光强度达到阈值时所需的pcr循环次数越多。样本中靶标序列的浓度越低。
[0057]
实施例3
[0058]
使用本发明的试剂盒进行植物乳杆菌检测的特异性测定
[0059]
按实施例2记载的检测方法，选择植物乳杆菌(atcc 8014)、鼠李糖乳杆菌(atcc 53103)、金黄色葡萄球菌(atcc 29213)、大肠杆菌(atcc 43889)菌液为样本，进行rpa检测，每个菌种做3次重复实验。用以评价该试剂盒和检测方法组合的特异性。结果如图1所示，仅3个植物乳杆菌样本产生扩增曲线，表明本发明提供的引物探针具有较高的特异性，可对植物乳杆菌进行准确检测。
[0060]
实施例4
[0061]
使用本发明的试剂盒进行植物乳杆菌检测的灵敏度测定。
[0062]
按实施例2记载的检测方法，选择浓度为105、104、103、102cfu/ml的植物乳杆菌液为样本，进行rpa检测，每个浓度梯度进行3次重复试验，用以评价该试剂盒和检测方法组合的检测灵敏度。其中105、104、103cfu/ml的样本检测结果如图2-4所示，102cfu/ml未见扩增曲线。因此，本方法的检出限为103cfu/ml。
[0063]
采用商品化磁珠法细菌dna核酸提取纯化试剂盒对上述梯度稀释的植物乳杆菌液样本进行核酸提取，然后使用本发明提供的引物探针和rpa反应体系进行检测，进行对照实验。检出情况如表2所示。可见实施例4与对照例均能检出最低浓度为103cfu/ml的植物乳杆菌，二者具有较高的一致性。表示本发明提供的快速核酸释放剂能有效裂解细菌，具有较高的核酸释放效率，经快速核酸释放剂处理后的样本可实现与商品化磁珠法提取试剂盒处理后的样本相当的rpa检测灵敏度。
[0064]
表2灵敏度测定实验结果
[0065][0066]
其中“ ”表示检测结果为阳性，“－”表示检测结果为阴性
[0067]
表3展示了本发明所述的检测方法与常规的细菌核酸检测方法的耗时对比，可知本发明所述的检测方法分别缩短了核酸提取和扩增检测两个步骤的用时，具有效率好、成本低、灵敏度高的特点
[0068]
表3检测方法耗时对比
[0069][0070][0071]
实施例5
[0072]
使用本发明植物乳杆菌rpa快速检测试剂盒和检测方法的重复性评价。
[0073]
按实施例2记载的检测方法，分别对105和104copies/ml的含植物乳杆菌靶标序列的重组质粒标准品进行检测，每个浓度均进行4次重复实验，用于评价该试剂盒和检测方法组合的检测重复性。结果如图5所示，ct值见表2，由结果可知，本方法具有较好的重复性。
[0074]
表2.重复性评价
[0075][0076]
由上述实施例可知，本发明提供的试剂盒与检测方法的组合具有特异性强，灵敏度高，重复性好的优点，可在30分钟左右完成样品中植物乳杆菌的准确检测。
[0077]
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。