枸橼酸喷托维林半抗原、抗原、抗体及检测装置和制备方法与流程

1.本发明涉及药品安全检测领域，特别是涉及枸橼酸喷托维林半抗原、抗原、抗体及检测装置和制备方法。


背景技术：

2.枸橼酸喷托维林用于上呼吸道感染引起的无痰干咳和百日咳等，对小儿疗效优于成人。中成药及保健食品中非法添加化学药物的现象也时有发生，个别不法商家为了增加疗效、牟取暴利，在该类产品中添加了可促进疗效的化学药物，这些化学药物未经试验验证、临床验证和国家相关部门严格审核批准，本身难以保证其质量安全；同时添加的种类和剂量更是存在随意性和不确定性，这种现象危害严重，可能导致中成药原有的药效发生改变，消费者在不知情的情况下服用这些含有非法添加化学成分的药物可能会造成巨大的健康隐患。
3.国家食品药品监督管理局《药品检验补充检验方法和项目批准件》收载了关于止咳平喘类中成药8种非法添加的化学成分，其中包括枸橼酸喷托维林。目前，枸橼酸喷托维林的检验方法有高效液相色谱法、气质联用法、气相色谱
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串联质谱法、液相色谱
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串联质谱法。以上检测方法对检测仪器要求较高，仪器价格昂贵，很难普及，而且检测时间长，效率低，对检测人员操作技术要求高，不能满足现场快速检测的需求。
4.本专利拟采用免疫检测的方法对中成药、保健品或中药饮品中非法添加的枸橼酸喷托维林进行检测，以达到快速检测的目的与之相比，本发明专利应用免疫学测定方法，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供枸橼酸喷托维林半抗原、抗原、抗体及检测装置和制备方法。
6.根据本发明的一个方面，提供了一种枸橼酸喷托维林半抗原，其结构如下所示：（ⅰ）。
7.在一些实施方式中，枸橼酸喷托维林半抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，将α
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苯基环戊基乙酸与氯化亚砜反应生成α
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苯基环戊基乙酰氯；s2，α
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苯基环戊基乙酰氯再与缩二乙二醇反应生成α
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苯基环戊基乙酸缩二乙二醇酯；
s3，α
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苯基环戊基乙酸缩二乙二醇酯用吡啶溶解后在丁二酸酐作用发生反应，制备得到所述枸橼酸喷托维林半抗原。枸橼酸喷托维林半抗原是通过α
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苯基环戊基乙酸与氯化亚砜反应生成α
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苯基环戊基乙酰氯，α
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苯基环戊基乙酰氯再与缩二乙二醇反应生成α
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苯基环戊基乙酸缩二乙二醇酯，用吡啶溶解后在丁二酸酐作用发生反应，制备得到的，具体反应过程如下：。
8.在一些实施方式中，枸橼酸喷托维林抗原包含枸橼酸喷托维林半抗原，以及与枸橼酸喷托维林半抗原偶联在一起的载体蛋白。枸橼酸喷托维林半抗原分子仅具有免疫反应性，而不具有免疫原性。因此，为了赋予枸橼酸喷托维林半抗原以免疫原性，还需要将该枸橼酸喷托维林半抗原与合适的载体分子偶联、结合或者交联在一起，由此产生既具有免疫反应性又具有免疫原性的枸橼酸喷托维林抗原。
9.在一些实施方式中，载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、鸡卵清白蛋白或血蓝蛋白中的一种，枸橼酸喷托维林抗原包括枸橼酸喷托维林免疫抗原和检测线用枸橼酸喷托维林抗原，枸橼酸喷托维林免疫抗原和检测线用枸橼酸喷托维林抗原的载体蛋白不同。
10.在一些实施方式中，枸橼酸喷托维林抗原的制备方法，包括以下：取枸橼酸喷托维林半抗原溶于dmf溶液中，搅拌并加入 dcc和nhs，在4℃条件下磁力搅拌并反应过夜，离心后取第一上清液，制备得到a液；称取适量载体蛋白溶于浓度0.1mol/l，ph值8.0的pbs溶液中，加入dmf溶液，搅拌溶解制备得到b液；磁力搅拌下，将a液逐滴滴入b液中，4℃条件下反应12h，反应完毕后，离心取第二上清液，4℃条件下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，制备得到枸橼酸喷托维林抗原，将枸橼酸喷托维林抗原以10mg/ml的浓度分装于离心管中，冻存于
‑
20℃冰箱中备用。该制备方法通过加入不同的载体蛋白，可以分别制备得到枸橼酸喷托维林免疫抗原和检测线用枸橼酸喷托维林抗原。
11.在一些实施方式中，枸橼酸喷托维林抗体为特异性针对枸橼酸喷托维林抗原的抗体。
12.在一些实施方式中，枸橼酸喷托维林抗体为枸橼酸喷托维林单克隆抗体或枸橼酸喷托维林多克隆抗体。
13.在一些实施方式中，枸橼酸喷托维林多克隆抗体的制备方法，包括以下：用枸橼酸喷托维林免疫抗原分别免疫3只2.5kg以上的新西兰白兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射：首次免疫，采用枸橼酸喷托维林免疫抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，采用枸橼酸喷托维林免疫抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以elisa法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取igg 抗体，通过protein a柱层析纯化，制备得到枸
橼酸喷托维林多克隆抗体，并将枸橼酸喷托维林多克隆抗体于
‑
20℃冻存备用。
14.在一些实施方式中，用于检测枸橼酸喷托维林的检测装置，包括试纸条和反应杯，试纸条包括反应膜，反应膜上设有检测线和质控线，检测线内包被有检测线用枸橼酸喷托维林抗原，反应杯包含有胶体金标记的枸橼酸喷托维林抗体，枸橼酸喷托维林抗体特异性地针对枸橼酸喷托维林抗原。检测线由检测线用枸橼酸喷托维林抗原在硝酸纤维素膜上进行线性点样制得。质控线由枸橼酸喷托维林抗体在硝酸纤维素膜上点样获得的。设置质控线的目的是为了指示该装置在使用时检测体系是成立的，以确保所获得结果的可靠性和正确性。在胶体金标记的枸橼酸喷托维林抗体通过虹吸移动至质控线时，其会与形成该质控线的枸橼酸喷托维林抗体发生结合反应，由此显现颜色。如果质控线显色，则指示该检测系统成立，检测结果可用。相反，如果质控线不显色，则指示该检测系统不成立，检测结果不可用。检测线和质控线应相互平行并相距合适距离，由此实现最佳检测。检测线和质控线相距至少0.3厘米。
15.在一些实施方式中，检测枸橼酸喷托维林的方法，包括使用检测枸橼酸喷托维林的检测装置对样品进行检测，样品为中成药、保健品或中药饮品。
16.本发明的有益效果：本发明公开了枸橼酸喷托维林半抗原、抗原、抗体、检测装置和制备方法，应用层析式免疫胶体金原理，试纸中检测线与质控线线比色来半定量检测样品中的枸橼酸喷托维林，可以在短时间内快速准确地检测出样品是否含有枸橼酸喷托维林。本发明与现有技术相比，具有使用方便、经济快捷、制作容易、成本低廉的特点，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，提高了检测效率，达到了快速检测的目的，能更好的满足监管部门及检测机构现场监督执法的需要。
附图说明
17.图1为本发明的一种实施方式的枸橼酸喷托维林半抗原的质谱图。
18.图2为本发明的一种实施方式的用于检测枸橼酸喷托维林的检测装置的结构示意图。
具体实施方式
19.下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
20.实施例1枸橼酸喷托维林半抗原的制备方法：s1，向100ml单口瓶中依次加入2.0gα
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苯基环戊基乙酸和30ml氯化亚砜，加热温度为℃，搅拌至回流，回流反应3
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4h，tlc监控反应物料α
‑
苯基环戊基乙酸消失，降至室温搅拌，将反应液在50℃下减压蒸馏至干，10ml加入二氯甲烷，搅拌至溶液澄清，制备得到α
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苯基环戊基乙酰氯待用；s2，向另一100ml单口瓶中依次加入3.0g缩二乙二醇和5ml二氯甲烷，室温搅拌，混合均匀后，转至冰浴下搅拌，将上述α
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苯基环戊基乙酰氯滴入其中，滴毕后转至室温搅拌1h，再升浴温至40℃搅拌5h，然后降至室温搅拌，向反应液中加入20ml纯化水和20ml二氯甲烷，搅拌分液，分取有机层，水相用20ml二氯甲烷萃取，合并有机层，加入无水硫酸钠干燥，过滤后，滤液在45℃下减压浓缩，剩余约20ml溶液，制备得到的α
‑
苯基环戊基乙酸缩二乙二
醇酯，直接用于下步反应；s3，向另一100ml单口瓶中依次加入20ml 1.0eq.的α
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苯基环戊基乙酸缩二乙二醇酯、2.1g 2.0eq.的丁二酸酐和0.05gdmap，加热至40℃搅拌6
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12h，tlcrf约为0.6
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0.8的点基本消失，降至室温搅拌。往反应液中加入30ml纯化水，搅拌分液，分取有机层，水层用乙酸乙酯萃取2
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3遍，合并有机层，并用30ml饱和食盐水洗涤，加入无水硫酸钠干燥，过滤，滤液在45℃下减压蒸馏至无明显液体流出，剩余物柱层析，分得所需目标液，浓缩至干，得浅棕色透明液体1.6g，即制备得到枸橼酸喷托维林半抗原，质谱鉴定ei
‑
ms（negative）m/z：377.2[m
‑
h]
‑ꢀ
。
[0021]
实施例2枸橼酸喷托维林免疫抗原的制备方法：取0.1mmol实施例1中制备得到的枸橼酸喷托维林半抗原溶于2ml二甲基甲酰胺（dmf）中，搅拌加入0.2mmol二环己基碳二亚胺（dcc）和0.1mmoln
‑
羟基琥珀酰亚胺（nhs），在4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后取上清液，制备得到a液；称取140mg 牛血清蛋白（bsa）溶于10ml浓度为0.1mol/l，ph值为8.0的pbs溶液中，加入1mldmf溶液，搅拌溶解制备得到b液；磁力搅拌下，将a液逐滴滴入b液中，在4℃下反应 12h，离心后，取上清液，在4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，制备得到枸橼酸喷托维林免疫抗原，即枸橼酸喷托维林
‑
bsa抗原，将枸橼酸喷托维林
‑
bsa抗原以10mg/ml的浓度分装于0.5ml 离心管中，冻存于
‑
20℃冰箱中备用。
[0022]
实施例3检测线用枸橼酸喷托维抗原的制备方法：取0.1mmol实施例1中制备得到的枸橼酸喷托维林半抗原溶于2ml dmf中，搅拌加入0.2mmol dcc和0.1mmol nhs，在4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜，制备得到a液；称取120mg 鸡卵清蛋白（ova）溶于10ml浓度0.1mol/l，ph值为8.0的pbs溶液中，加入1mldmf溶液，搅拌溶解制备得到b液；磁力搅拌下，将a液逐滴滴入b液中，在4℃下反应 12h，离心后，取上清液，在4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到检测线用枸橼酸喷托维林抗原，即枸橼酸喷托维林
‑
ova抗原，将枸橼酸喷托维林
‑
ova抗原以10mg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中，冻存于
‑
20℃冰箱中备用。
[0023]
实施例4枸橼酸喷托维林多克隆抗体的制备及纯化：用实施例2制备的枸橼酸喷托维林免疫抗原分别免疫3只2.5kg以上的新西兰白兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射。首次免疫，用枸橼酸喷托维林
‑
bsa抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用枸橼酸喷托维林
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bsa抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以elisa法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取igg 抗体，最后再用protein a柱层析纯化，得到的枸橼酸喷托维林多克隆抗体
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20℃冻存备用。
[0024]
实施例5用于检测枸橼酸喷托维林的检测装置的制备：5.1胶体金的制备取1ml浓度为1％氯金酸溶液，加入99ml超纯水配制成成浓度0.01％的氯金酸溶
液，加热沸腾后，取1.6ml浓度1％的柠檬酸三钠溶液一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积；5.2胶体金标记多克隆抗体的制备调节5.1中制备得胶体金溶液ph值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入实施例4中制备的枸橼酸喷托维林多克隆抗体，1h后加入与抗体量相当的聚乙二醇（peg），充分反应30min后加入与抗体量相当的牛血清蛋白（bsa），加完后，继续搅拌30min。在9000rpm下离心30min，获得均一性金标抗体沉淀，再加对硝基苯酚丁酸酯（pnpb）重悬备用；5.3胶体金检测装置的制备5.3.1在硝酸纤维素膜（nc膜）上将实施例3制备的检测线用枸橼酸喷托维林抗原进行线性点样，由此形成检测线（t线），并将羊抗兔igg抗体进行线性点样，由此形成质控线（c线），羊抗兔igg抗体选择生工生物工程（上海）股份有限公司供应的羊抗兔igg抗体；5.3.2在底板上，沿同一方向依次将样品垫，喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连，向反应杯内加入5.2制备的胶体金标记多克隆抗体，冻干；5.3.3步骤5.3.2中得到的试纸条和反应杯组合在一起就形成了本发明的用于检测枸橼酸喷托维林的胶体金检测装置。
[0025]
实施例6枸橼酸喷托维林的胶体金快速检测的检测方法：6.1样品的预处理：取0.1 g或0.1ml中成药（凉茶或保健品）待测物加至稀释瓶中，稀释瓶中盛装有0.9ml ph7.4的含有30%乙醇的磷酸盐缓冲液，拧紧瓶盖大力摇匀约30秒，混匀后即为待测液。
[0026]
6.2使用实施例5中的胶体金检测装置进行检测：拧开试剂瓶上盖，吸取200μl待测液于反应杯中，并上下抽吸5次混匀，20
‑
40℃开始第一步反应，并计时3min；将测试条插入到反应杯中，20
‑
40℃下开始第二步反应，并计时3min；从微孔中取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读。
[0027]
6.3参照下表1进行结果判读：表1结果判读表6.4取同样的样品，利用现有的液相色谱
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质谱法或质谱法对该样品中的枸橼酸喷托维林的含量进行检测，并将本实施例中检测方法与现有的液相色谱
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质谱法或质谱法的检测结果进行比较，结果见下表2：表2 本实施例检测方法与现有方法的结果比较
实施例7用于检测枸橼酸喷托维林的检测装置的灵敏度测定：向空白对照样品中分别添加不同质量的枸橼酸喷托维林，得到枸橼酸喷托维林添加量分别为10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、70μg/kg、100μg/kg的添加样品，采用实施例6的检测方法，用胶体金试纸条进行测试，测试后使用仪器比较检测线与质控线颜色深浅。当枸橼酸喷托维林添加量为50μg/kg时，检测线颜色深度为质控线的90％以下，因此其对枸橼酸喷托维林的灵敏度为50μg/kg。
[0028]
实施例8用于检测枸橼酸喷托维林的检测装置的特异性实验分别按照枸橼酸喷托维林50μg/kg、茶碱5mg/kg、马来酸氯苯那敏5mg/kg、盐酸苯海拉明5mg/kg、地西泮5mg/kg、磷酸苯丙哌林5mg/kg、醋酸泼尼松5mg/kg、磷酸可待因5mg/kg的添加量，向空白对照样品中添加上述化合物，得到添加样品，采用实施例6的检测方法，用胶体金试纸条进行测试。结果发现，只有添加50μg/kg枸橼酸喷托维林的样品能够检出阳性，而加入茶碱、马来酸氯苯那敏、盐酸苯海拉明、地西泮、磷酸苯丙哌林、醋酸泼尼松、磷酸可待因的样品无法检出阳性，说明本检测装置对枸橼酸喷托维林的特异性较好。
[0029]
实施例9用于检测枸橼酸喷托维林的检测装置的保质期测试实验：取三批常规生产的检测装置分别做保质期测试实验，放置于室内，保持室温环境，每隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性和50μg/kg、100μg/kg、150μg/kg加标实验，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定用于检测枸橼酸喷托维林的检测装置的保质期为1年。
[0030]
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。