一种含乳香外泌体的乳香提取物及其制备方法和应用

1.本发明涉及药物制备技术领域，尤其涉及一种含乳香外泌体的乳香提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,uc)是一种病因尚不十分明确的结肠和直肠慢性非特异性疾病。其病变部位局限于大肠黏膜及黏膜下层。临床主要表现为腹泻、腹痛及粘液脓血便。由于其难以治愈且易发展为结直肠癌，uc已经成为严重威胁人类健康的疾病之一。
3.乳香来源于橄榄科植物乳香树boswellia carterii birdw及同属植物boswellia bhaw
–
dajiana birdw树皮渗出的树脂，为常用中药，具有活血行气化瘀、消肿止痛的功效。研究报道，乳香醇制剂对uc有很好的疗效，80％的患者服用后病情得到缓解，其对慢性结肠炎ii级和iii级患者有效率分别为100％和60％。临床双盲随机对照实验也表明，乳香提取物对于治疗炎症性肠病具有良好的作用，大约36％的炎症性肠病患者使用了乳香提取物进行治疗，并取得了积极的效果。此外，乳香的提取物h15gufic和醇制剂aflapin，在欧洲已经作为抗炎治疗的上市药物。以往乳香制剂主要针对三萜类乳香酸成分提取物，如h15gufic、醇制剂aflapin。2020版《中华人民共和国药典》收载的乳香复方多以原粉入药。由于其药效物质基础研究尚未透彻，导致药效精准仍有待提高。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种含乳香外泌体的提取物及其制备方法和应用，针对溃疡性结肠炎药效更为明确、效果更佳。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种含乳香外泌体的乳香提取物的制备方法，包括以下步骤：
7.将乳香进行低温粉碎，得到乳香粉末；所述低温粉碎的温度为-25～-15℃；
8.将所述乳香粉末置于pbs缓冲液中，进行第一离心，得到上清液；所述第一离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力为3000～10000g，离心的时间≥5min；
9.将所述上清液进行第二离心，得到沉降物；所述第二离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离心时间≥0.5h；
10.将所述沉降物分散到pbs缓冲溶液中，得到悬浮液；
11.将所述悬浮液加入到蔗糖的密度梯度溶液中，进行第三离心，收集且合并不同蔗糖密度梯度层之间的条带；从上到下，所述蔗糖的密度梯度溶液中蔗糖的质量浓度依次为4～12％、25～35％、40～50％和55～65％；所述第三离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离心时间≥0.5h；
12.将所得条带与pbs缓冲液混合，进行第四离心，除去蔗糖，得到沉淀物，所述沉淀物为含乳香外泌体的提取物；所述第四离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离
心时间≥0.5h。
13.优选的，所述乳香为醋乳香。
14.优选的，所述醋乳香的制备方法包括：将容器预热至100～150℃后加入乳香，不断翻炒3～15min后，加入米醋，继续不断翻炒3～15min，摊开晾凉，得到醋乳香；所述乳香和米醋的质量比为1：(3～15)。
15.优选的，所述第一离心的次数为2次。
16.优选的，所述第二离心的离心力为80000～200000g，离心时间为0.5～3h。
17.优选的，所述第三离心的离心力为80000～200000g，离心时间为0.5～3h。
18.优选的，所述第四离心的离心力为80000～150000g，离心时间为0.5～3h，所述第四离心的次数为2～4次。
19.本发明提供了上述方案所述制备方法制备得到的含乳香外泌体的乳香提取物；所述乳香提取物中乳香外泌体的粒径在400nm以下。
20.本发明提供了上述方案所述含乳香外泌体的乳香提取物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
21.优选的，所述药物的剂型为丸剂、片剂、胶囊、口服液或注射剂。
22.与现有技术相比，本发明所述的含乳香外泌体的乳香提取物尤其是醋乳香提取物能明显改善溃疡性结肠炎症状，实施例的结果表明，针对葡聚糖硫酸钠诱导的大鼠溃疡性结肠炎症状，本发明的含乳香外泌体的乳香提取物能够降低溃疡性结肠炎对小鼠疾病活动指数、结肠长度和小鼠结肠粘膜损伤指数的影响，降低模型大鼠血清中炎性因子tnf-α、il-1β、il-6含量。
附图说明
23.图1为乳香和醋乳香外泌体透射电镜图；a.乳香外泌体；b.醋乳香外泌体；
24.图2为乳香醋炙前后粒径和zeta电位对比检测结果；a.乳香醋炙前后粒径对比图；b.乳香醋炙前后zeta电位对比图。
25.图3为各组体重变化曲线图；
26.图4为各组dai评分图；
27.图5为各组结肠长度；
28.图6为结肠形态和长度测量图；其中，a：正常组；b：模型组；c：乳香组；d：醋乳香组；e：乳香外泌体组；f：醋乳香外泌体组；g：阳性药组。
29.图7为各组cmdi评分图；
30.图8为各组结肠组织病理切片；其中，a正常组；b模型；c乳香组；d醋乳香组；e乳香外泌体组；f醋乳香外泌体组；g阳性药组；
31.图9为hs评分图；
32.图10为各组血清中炎性因子含量；其中，a：tnf-α；b：il-1β；c：il-6。
具体实施方式
33.本发明提供了一种含乳香外泌体的乳香提取物的制备方法，包括以下步骤：
34.将乳香进行低温粉碎，得到乳香粉末；所述低温粉碎的温度为-25～-15℃；
35.将所述乳香粉末置于pbs缓冲液中，进行第一离心，得到上清液；所述第一离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力为3000～10000g，离心的时间≥5min；
36.将所述上清液进行第二离心，得到沉降物；所述第二离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离心时间≥0.5h；
37.将所述沉降物分散到pbs缓冲溶液中，得到悬浮液；
38.将所述悬浮液加入到蔗糖的密度梯度溶液中，进行第三离心，收集且合并不同蔗糖密度梯度层之间的条带；从上到下，所述蔗糖的密度梯度溶液中蔗糖的质量浓度依次为4～12％、25～35％、40～50％和55～65％；所述第三离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离心时间≥0.5h；
39.将所得条带与pbs缓冲液混合，进行第四离心，除去蔗糖，得到沉淀物，所述沉淀物为含乳香外泌体的提取物；所述第四离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离心时间≥0.5h。
40.本发明将乳香进行低温粉碎，得到乳香粉末。
41.在本发明中，所述低温粉碎的温度为-25～-15℃，所述乳香粉末的粒径优选小于100目。本发明对所述低温粉碎的方式没有特殊要求，能够得到满足上述粒径要求的乳香粉末即可，在本发明中，具体是采用离心的方式进行粉碎。本发明进行低温粉碎的目的是最大程度保护外泌体不受粉碎过程中温度因素影响。
42.在本发明中，所述乳香优选为醋乳香；所述醋乳香的制备方法优选包括以下步骤：将容器预热至100～150℃后加入乳香，不断翻炒3～15min后，加入米醋，继续不断翻炒3～15min，摊开晾凉，得到醋乳香。在本发明中，所述乳香和米醋的质量比优选为1：(3～15)，更优选为1:10。
43.得到乳香粉末之后，本发明将所述乳香粉末置于pbs缓冲液中，进行第一离心，得到上清液。
44.在本发明中，所述pbs缓冲液的质量优选为乳香粉末质量的3～9倍，更优选为6倍。所述第一离心前，本发明优选先将乳香粉末的pbs缓冲液震荡5～100s。在本发明中，所述第一离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力为3000～10000g，离心的时间≥5min，优选的，温度为3～6℃，离心力为5000～7000g，离心的时间为5～40min；更优选的，温度为4℃，离心力为5500g，离心的时间为20min。在本发明中，所述第一离心的次数优选为2次。本发明通过第一离心将外泌体溶解与pbs缓冲液中，并与乳香粉末分离。
45.得到上清液后，本发明将所述上清液进行第二离心，得到沉降物。
46.在本发明中，所述第二离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离心时间≥0.5h；优选的，温度为3～6℃，离心力为80000～200000g，离心的时间为0.5～3h；更优选的，温度为4℃，离心力为150000g，离心的时间为2h。本发明通过第二离心初步提取分离外泌体。
47.得到沉降物后，本发明将所述沉降物分散到pbs缓冲溶液中，得到悬浮液。本发明对所述pbs缓冲溶液的用量没有特殊要求，能够将沉淀物分散均匀即可。本发明对所述分散的方式没有特殊要求，采用本领域熟知的分散方式即可。
48.得到悬浮液后，本发明将所述悬浮液加入到蔗糖的密度梯度溶液中，进行第三离心，收集且合并不同蔗糖密度梯度层之间的条带；从上到下，所述蔗糖的密度梯度溶液中蔗
糖的质量浓度依次为4～12％、25～35％、40～50％和55～65％；所述第三离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离心时间≥0.5h。
49.优选的，所述蔗糖的密度梯度溶液中蔗糖的质量浓度依次为8％、30％、45％和60％；所述第三离心的温度优选为3～6℃，离心力优选为80000～200000g，离心的时间优选为0.5～3h；更优选的，温度为4℃，离心力为150000g，离心的时间为2h。本发明通过进行第三离心，可以在蔗糖梯度溶液中纯化得到外泌体。
50.得到条带后，本发明将所得条带与pbs缓冲液混合，进行第四离心，除去蔗糖，得到沉淀物，所述沉淀物为含乳香外泌体的提取物；所述第四离心的条件包括：温度为1～10℃，离心力≥80000g，离心时间≥0.5h。
51.在本发明中，所述第四离心的温度优选为3～6℃，离心力优选为80000～150000g，离心时间优选为0.5～3h；更优选的，温度为4℃，离心力为100000g，离心时间为2h。
52.在本发明中，所述第四离心的次数优选为2～4次。本发明通过多次离心最大程度的除去蔗糖。
53.得到沉淀物后，本发明优选将沉淀用pbs重悬后，保存在-80℃冰箱中备用。
54.本发明提供了上述方案所述制备方法制备得到的含乳香外泌体的乳香提取物；所述乳香提取物中乳香外泌体的粒径在400nm以下。在本发明中，当乳香为醋乳香时，所述乳香外泌体的粒径在400nm以下，当乳香不进行米醋翻炒时，所述乳香外泌体的粒径在200nm以下。
55.本发明提供了上述方案所述含乳香外泌体的乳香提取物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。在本发明中，所述药物的剂型优选为丸剂、片剂、胶囊、口服液或注射剂。
56.下面结合实施例对本发明提供的含乳香外泌体的乳香提取物及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
57.实施例1
58.取乳香，-20℃粉碎，加入6倍质量pbs，震荡30s，于4℃5500g下离心20min，取上清液。将上清液再次于4℃5500g下离心20min。采用低温高速离心机在4℃150000g下离心2h后，弃去上清，将所得沉降物分散到pbs缓冲溶液中，得到悬浮液，从上到下，向离心管中依次加入8％、30％、45％、60％蔗糖溶液，将所述悬浮液加入到离心管中，继续用低温高速离心机在4℃150000g下进行蔗糖密度梯度离心2h，离心后可分出不同条带，收集并合并不同蔗糖密度梯度层之间的条带，加入pbs继续在100000g下离心2h进行除糖，重复两次，得到的沉淀用pbs重悬后，保存在-80℃冰箱中备用。
59.实施例2
60.与实施例1的不同之处仅在于将乳香替换为醋乳香，醋乳香的制备方法为：取净容器预热至130℃后下入乳香，不断翻炒9min后，按照10:1的比例喷入米醋，继续不断翻炒11min，摊开晾凉，得醋乳香。
61.外泌体的透射电镜观察：将4g醋酸铀酰粉溶于100ml预热(50～60℃)过滤水中，制备4％醋酸铀酰原液。将1ml4％醋酸铀酰原液稀释至3ml过滤水中。将一滴样品沉积到涂覆的网格的表面上。在样品顶部加入1％醋酸铀酰，等待15秒。样品充分吸收后，用纸巾轻轻吸去醋酸铀酰而不接触表面。在室温下干燥样品5分钟。用透射电子显微镜扫描样品图像，结
果如图1所示(标尺为100nm)。图1中a为实施例1提取的乳香外泌体；b为实施例2提取的醋乳香外泌体。
62.外泌体粒径浓度检测：采用zetaview pmx 110纳米颗粒追踪分析仪测定外泌体粒径分布、颗粒浓度和zeta电位。以去离子水清洗样本池，采用聚苯乙烯微球(110nm)校准。样本采用pbs缓冲液溶解，进行检测结果如图2所示，图2中，a为乳香醋炙前后粒径对比图，b为乳香醋炙前后zeta电位对比图。通过粒径和zeta电位的检测对比研究发现，乳香醋炙后外泌体的粒径增大，醋炙前(实施例1)粒径在200nm以下，醋炙后(实施例2)粒径在400nm以下。同时乳香醋炙后，外泌体的zeta电位分布增加了
±
20mv的分布区域。可见，通过醋炙处理，降低了乳香外泌体的稳定性，使外泌体更易聚集，这个现象在外泌体的透射电镜观察中得到了证实(图1)。
63.药理实验
64.1.体重方法
65.对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt，dss)诱导溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,uc)小鼠体重变化的影响：70只spf级c57bl/6j小鼠自适应喂养一周，造模动物依次于1d～6d、20d～25d、39d～44d用质量分数为2％的dss溶液代替饮用水模拟病程反复过程进行造模，正常动物自由饮水。将60只造模动物随机分为乳香组(rf，1.5g/kg)、醋乳香组(pf，1.5g/kg)、乳香外泌体组(erf，1.5g/kg)、醋乳香外泌体组(epf，1.5g/kg)、阳性药柳氮磺吡啶组(y，1.5g/kg)和模型组(m)，每组10只，根据治疗性给药原则，于13d起，灌胃给药进行干预，每天一次，连续36d，正常组和模型组灌胃给予质量分数为0.3％的羧甲基纤维素钠(cmc-na)溶液。分别于造模开始前和每个周期后称量小鼠体重并记录数据，结果如图3和表1所示。
66.体重结果
67.通过图3和表1可以看出，在实验的1～49d内，正常组体重逐渐增加，模型组及各给药组体重呈波动式上升趋势。在49d时，与正常组比，模型组体重显著降低(p《0.01)；与模型组比，乳香组、醋乳香组，乳香外泌体组，醋乳香外泌体组及阳性药组体重均呈现升高趋势，其中阳性药组具有极显著性差异(p＜0.01)；与乳香组比，醋乳香组体重升高更为明显，显示醋乳香促进体重增长的作用更强；与乳香外泌体组比，醋乳香外泌体组体重升高更为明显，显示醋乳香外泌体促进体重增长的作用更强。
68.表1各组小鼠体重测定结果
[0069][0070]
与正常组比较，^^p＜0.01；与模型组比较，**p＜0.01。
[0071]
2.dai方法
[0072]
对dss诱导uc小鼠疾病活动指数(disease activity index，dai)的影响：70只spf级c57bl/6j小鼠自适应喂养一周，造模动物依次于1d～6d、20d～25d、39d～44d用质量分数为2％的dss溶液代替饮用水模拟病程反复过程进行造模，正常动物自由饮水。将60只造模动物随机分为乳香组(rf，1.5g/kg)、醋乳香组(pf，1.5g/kg)、乳香外泌体组(erf，1.5g/kg)、醋乳香外泌体组(epf，1.5g/kg)、阳性药柳氮磺吡啶组(y，1.5g/kg)和模型组(m)，每组10只，根据治疗性给药原则，于13d起，灌胃给药进行干预，每天一次，连续36d，正常组和模型组灌胃给予质量分数为0.3％的cmc-na溶液。分别于造模开始前和每个周期后对小鼠进行dai评分并记录数据。dai评分标准为：体重无下降，大便正常，无大便隐血、肉眼血便，评0分；体重下降1～5％，大便松散，大便隐血，评1分；体重下降5～10％，大便松散，大便隐血，评2分；体重下降10～15％，大便为稀便，肉眼血便，评3分；体重下降》15％，大便为稀便，肉眼血便，评4分(注：正常大便：成形大便；松散大便：不粘附于肛门的糊状、半成型大便；稀便：可粘附于肛门的稀水样便)。测试结果见图4和表2。
[0073]
dai结果
[0074]
通过图4和表2可以看出，在1～49d测定给药的各时间点，正常组dai评分为0，模型组及各给药组dai呈波动式。与正常组相比，模型组dai均显著升高。与模型组相比，各组dai有所降低。在49d时，与正常组比，模型组dai显著升高(p＜0.01)；与模型组比，乳香组、醋乳香组，醋乳香外泌体组及阳性药组dai明显降低(p＜0.05或p＜0.01)，乳香外泌体组表现出降低趋势；与乳香组比，醋乳香组dai评分更低(p＜0.05)，表明醋乳香比乳香缓解dss诱导uc症状作用更好；与乳香外泌体组比，醋乳香外泌体组dai较低，显示醋乳香外泌体降低dai效果较好。
[0075]
表2dai评分结果
[0076][0077][0078]
与正常组比较，^^p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与乳香组比较，
#
p＜0.05。
[0079]
3.结肠长度方法
[0080]
对dss诱导uc小鼠结肠长度的影响：70只spf级c57bl/6j小鼠自适应喂养一周，造模动物依次于1d～6d、20d～25d、39d～44d用质量分数为2％的dss溶液代替饮用水模拟病程反复过程进行造模，正常动物自由饮水。将60只造模动物随机分为乳香组(rf，1.5g/kg)、醋乳香组(pf，1.5g/kg)、乳香外泌体组(erf，1.5g/kg)、醋乳香外泌体组(epf，1.5g/kg)、阳
性药柳氮磺吡啶组(y，1.5g/kg)和模型组(m)，每组10只，根据治疗性给药原则，于13d起，灌胃给药进行干预，每天一次，连续36d，正常组和模型组灌胃给予质量分数为0.3％的cmc-na溶液。第49d时，小鼠麻醉后眼眶取血，脱颈处死后，剥离结肠组织，量取结肠长度。测试结果见图5、图6和表3。
[0081]
结肠长度结果
[0082]
如图5、图6和表3所示，与正常组小鼠结肠相比，模型组小鼠结肠长度显著变短(p＜0.01)，说明dss可明显抑制小鼠结肠生长；与模型组比，各给药组小鼠结肠长度较长，说明药物缓解了dss对小鼠结肠生长的抑制作用；与乳香组比，醋乳香组小鼠结肠长度更长，提示醋乳香对改善uc小鼠结肠长度的作用优于乳香；与乳香外泌体组相比，醋乳香外泌体组小鼠结肠长度更长，提示醋乳香外泌体对改善uc小鼠结肠长度的作用优于乳香外泌体。
[0083]
表3小鼠结肠长度结果
[0084][0085][0086]
与正常组比较，^^p＜0.01。
[0087]
4.cmdi方法
[0088]
对dss诱导uc小鼠结肠粘膜损伤指数(colonic mucosal damage index，cmdi)的影响：70只spf级c57bl/6j小鼠自适应喂养一周，造模动物依次于1d～6d、20d～25d、39d～44d用质量分数为2％的dss溶液代替饮用水模拟病程反复过程进行造模，正常动物自由饮水。将60只造模动物随机分为乳香组(rf，1.5g/kg)、醋乳香组(pf，1.5g/kg)、乳香外泌体组(erf，1.5g/kg)、醋乳香外泌体组(epf，1.5g/kg)、阳性药柳氮磺吡啶组(y，1.5g/kg)和模型组(m)，每组10只，根据治疗性给药原则，于13d起，灌胃给药进行干预，每天一次，连续36d，正常组和模型组灌胃给予质量分数为0.3％的cmc-na溶液。第49d时，小鼠麻醉后眼眶取血，脱颈处死后，剥离结肠组织，量取结肠长度后，用冰的生理盐水洗净，肉眼观察进行cmdi评分。cmdi评分等级为：正常，无充血水肿、表面光滑、无糜烂或溃疡，评0分；轻度充血水肿，粘膜表面光滑，无溃疡或糜烂，评1分；中度充血水肿，粘膜表面不光滑颗粒状，有溃疡、糜烂或者肠粘连，评2分；高度充血水肿，有糜烂、溃疡，溃疡纵经《1.0cm，评3分；高度充血水肿，有糜烂或溃疡，溃疡纵经》1.0cm，评4分。结果见图7和表4。
[0089]
cmdi结果
[0090]
如图7和表4所示，正常组cmdi为0，与正常组相比，模型组小鼠cmdi评分显著升高(p＜0.01)，说明dss导致了结肠粘膜损伤；与模型组相比，各给药组cmdi评分较低；与乳香
组相比，醋乳香组cmdi评分较低，提示醋乳香比乳香缓解uc小鼠结肠黏膜损伤作用更优；与乳香外泌体组相比，醋乳香外泌体组cmdi评分较低，提示醋乳香外泌体比乳香外泌体缓解uc小鼠结肠黏膜损伤作用更强。
[0091]
表4cmdi评分结果
[0092][0093]
与正常组比较，^^p＜0.01。
[0094]
5.结肠组织学观察方法
[0095]
对dss诱导uc小鼠结肠组织病理学变化的影响：70只spf级c57bl/6j小鼠自适应喂养一周，造模动物依次于1d～6d、20d～25d、39d～44d用质量分数为2％的dss溶液代替饮用水模拟病程反复过程进行造模，正常动物自由饮水。将60只造模动物随机分为乳香组(rf，1.5g/kg)、醋乳香组(pf，1.5g/kg)、乳香外泌体组(erf，1.5g/kg)、醋乳香外泌体组(epf，1.5g/kg)、阳性药柳氮磺吡啶组(y，1.5g/kg)和模型组(m)，每组10只，根据治疗性给药原则，于13d起，灌胃给药进行干预，每天一次，连续36d，正常组和模型组灌胃给予质量分数为0.3％的cmc-na溶液。第49d时，小鼠麻醉后眼眶取血，脱颈处死后，剥离结肠组织，取小鼠病变最严重的一段结肠组织，浸入4％组织固定液中固定，常规石蜡包埋，制成切片，苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosion，he)染色，用显微镜观察结肠组织病理变化。
[0096]
结肠组织学观察结果
[0097]
结肠组织经he染色观察发现，如图8所示，正常组小鼠结肠(a)肠壁厚且清晰，上皮完整，腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞丰富，无炎性细胞浸润。与正常组相比，模型组小鼠结肠(b)结肠壁变薄，上皮不完整，上皮细胞坏死脱落，溃疡症状较严重，大量炎性细胞浸润黏膜肌层；乳香组小鼠结肠(c)肠壁稍厚，部分区域溃疡形成，腺体排列整齐，隐窝较正常，杯状细胞较丰富，少量炎性细胞浸润；与乳香组相比，醋乳香组小鼠结肠(d)肠壁稍厚，上皮较完整，溃疡部位较少，腺体排列整齐，隐窝扩张，杯状细胞丰富，较少炎性细胞浸润，溃疡症状有明显改善，说明醋乳香比乳香改善dss引发uc小鼠结肠组织病理改变作用更好；乳香组外泌体组小鼠结肠(e)肠壁较厚，溃疡部分很少，腺体排列整齐，隐窝较正常，杯状细胞较丰富，少量炎性细胞浸润；与乳香外泌体组相比，醋乳香外泌体组小鼠结肠(f)肠壁稍厚，上皮较完整，溃疡部位极少，腺体排列整齐，隐窝正常，杯状细胞丰富，极少炎性细胞浸润，溃疡症状显著改善；说明醋乳香外泌体比乳香外泌体改善dss引发uc小鼠结肠组织病理改变作用更好。阳性药组小鼠结肠(g)肠壁清晰，上皮完整，腺体排列整齐，隐窝正常，杯状
细胞丰富，无炎性细胞浸润，说明给药后溃疡症状有明显改善。
[0098]
6.结肠组织病理学评分(histopathological score，hs)方法
[0099]
对dss诱导uc小鼠结肠组织病理学变化的影响：70只spf级c57bl/6j小鼠自适应喂养一周，造模动物依次于1d～6d、20d～25d、39d～44d用质量分数为2％的dss溶液代替饮用水模拟病程反复过程进行造模，正常动物自由饮水。将60只造模动物随机分为乳香组(rf，1.5g/kg)、醋乳香组(pf，1.5g/kg)、乳香外泌体组(erf，1.5g/kg)、醋乳香外泌体组(epf，1.5g/kg)、阳性药柳氮磺吡啶组(y，1.5g/kg)和模型组(m)，每组10只，根据治疗性给药原则，于13d起，灌胃给药进行干预，每天一次，连续36d，正常组和模型组灌胃给予质量分数为0.3％的cmc-na溶液。第49d时，小鼠麻醉后眼眶取血，脱颈处死后，剥离结肠组织，取小鼠病变最严重的一段结肠组织，浸入4％组织固定液中固定，常规石蜡包埋，制成切片，he染色，用显微镜观察结肠组织病理变化进行hs评分，评分等级为：正常，无水肿及溃疡、组织学病变，评0分；充血水肿，少数炎性细胞，评1分；浅表有糜烂，粘膜及粘膜下层充血水肿，评2分；多数炎性细胞，隐窝脓肿，粘膜层有坏死并形成溃疡，病变深达粘膜下层或肌层，评3分。
[0100]
结肠组织病理学评分(hs)结果
[0101]
如图9和表5所示，正常组hs为0，与正常组相比，模型组小鼠hs评分显著升高(p＜0.01)，说明dss导致结肠严重水肿，黏膜层大面积坏死，隐窝结构改变甚至消失，并伴有严重炎性细胞浸润；与模型组相比，各给药组hs评分显著降低(p＜0.01)，结肠组织病理情况有所改善；与乳香组相比，醋乳香干预后小鼠结肠隐窝更清晰，炎性细胞浸润程度更轻，醋乳香组hs评分较低；与乳香外泌体组相比，醋乳香外泌体组hs评分较低，提示醋乳香外泌体比乳香外泌体缓解dss引发结肠病理改变作用更强。
[0102]
表5hs评分结果
[0103][0104]
与正常组比，^^p＜0.01；与模型组比，**p＜0.01。
[0105]
7.血清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，tnf-α)、白介素-1β(interlenkin-1β，il-1β)和白介素-6(interlenkin-6，il-6)含量检测方法
[0106]
对dss诱导uc小鼠炎性因子水平变化的影响：70只spf级c57bl/6j小鼠自适应喂养一周，造模动物依次于1d～6d、20d～25d、39d～44d用质量分数为2％的dss溶液代替饮用水模拟病程反复过程进行造模，正常动物自由饮水。将60只造模动物随机分为乳香组(rf，1.5g/kg)、醋乳香组(pf，1.5g/kg)、乳香外泌体组(erf，1.5g/kg)、醋乳香外泌体组(epf，
1.5g/kg)、阳性药柳氮磺吡啶组(y，1.5g/kg)和模型组(m)，每组10只，根据治疗性给药原则，于13d起，灌胃给药进行干预，每天一次，连续36d，正常组和模型组灌胃给予质量分数为0.3％的cmc-na溶液。第49d时，小鼠麻醉后眼眶取血，保存于1.5ml ep管中。静置1h后，4℃，3500r/min，离心15min，取上清液，分装后，于-80℃保存备用。采用elisa法分别对各组小鼠血清中炎性因子tnf-α、il-1β、il-6水平进行测定。按试剂盒说明书进行操作。
[0107]
血清中炎性因子tnf-α、il-1β、il-6含量检测结果
[0108]
如图10和表6所示：与正常组相比，模型组炎性因子tnf-α、il-1β、il-6含量显著升高(p《0.01)，说明dss诱导了小鼠炎症反应；与模型组相比，部分给药组tnf-α、il-1β、il-6含量显著降低(p《0.05或p《0.01)；与乳香组相比，醋乳香组炎性因子tnf-α、il-1β、il-6含量更低，且tnf-α具有极显著性差异(p《0.01)，说明乳香醋炙后抗炎作用增强；与乳香外泌体组相比，醋乳香外泌体组炎性因子tnf-α、il-1β、il-6含量更低，且tnf-α具有显著性差异(p《0.05)，说明醋乳香外泌体降低血清炎性因子效果更好。
[0109]
表6各组血清中炎性因子含量结果
[0110][0111]
与正常组比较，^^p＜0.01；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01；与乳香组比较，
##
p＜0.01；与乳香外泌体组比较，ap＜0.01。
[0112]
实施例3
[0113]
取乳香，低温粉碎，加入3倍量pbs，震荡5s，于2℃3000g下离心5min，取上清液。将上清液再次于2℃3000g下离心5min；采用低温高速离心机在2℃80000g下离心0.5h后，弃去上清，将所得沉降物分散到pbs缓冲溶液中，得到悬浮液，从上到下，向离心管中依次加入4％、25％、40％、55％蔗糖溶液，将所述悬浮液加入到离心管中，继续用低温高速离心机在2℃80000g下进行蔗糖密度梯度离心0.5h，离心后可分出不同条带，收集且合并不同蔗糖密度梯度层之间的条带，加入pbs继续在80000g下离心0.5h进行除糖，重复2次，得到的沉淀用pbs重悬后，保存在-80℃冰箱中备用。
[0114]
实施例4
[0115]
取净容器预热至150℃后下入乳香，不断翻炒12min后，按照8:1的比例喷入米醋，继续不断翻炒15min，摊开晾凉，得醋乳香。取醋乳香，低温粉碎，加入9倍量pbs，震荡100s，于10℃10000g下离心40min，取上清液。将上清液再次于10℃10000g下离心30min；采用低温
高速离心机在10℃200000g下离心3h后，弃去上清，将所得沉降物分散到pbs缓冲溶液中，得到悬浮液，从上到下，向离心管中依次加入12％、35％、50％、65％蔗糖溶液，将所述悬浮液加入到离心管中，继续用低温高速离心机在10℃200000g下进行蔗糖密度梯度离心3h，离心后可分出不同条带，收集且合并不同蔗糖密度梯度层之间的条带，加入pbs继续在150000g下离心3h进行除糖，重复3次，得到的沉淀用pbs重悬后，保存在-80℃冰箱中备用。
[0116]
由以上结果可知，本发明提供了一种含乳香外泌体的提取物及其制备方法和应用，针对溃疡性结肠炎药效更为明确、效果更佳。
[0117]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。