一种核酸质谱盐离子干扰评价方法与流程

1.本发明涉及生物质谱检测的技术领域，尤其涉及一种核酸质谱盐离子干扰评价方法。


背景技术：

2.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，maldi tof ms)是八十年代末发展起来的一种新的质谱分析技术，是激光电离技术和高速数据采集处理系统相结合的产物。经过多年的发展，maldi tof ms由于其简单快速、高通量和高灵敏度的优势，已被广泛应用于核酸、糖、蛋白质等生物大分子及合成高聚物分子的分子量测定和结构分析。
3.maldi tof ms技术是将聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)扩增延伸后的样品分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下飞过真空的飞行管，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即通过离子的质量电荷之比(m/z)与离子的飞行时间成正比来分析离子，并测得样品分子的分子量。
4.核酸样品经pcr扩增反应或/和延伸反应后，反应产物中带有大量的盐离子，如na

、k

、mg
2
、mn
2
等金属阳离子，以下简称盐离子，因核酸扩增和/和延伸产物带有磷酸根，极性和负电性大，容易吸附盐离子，形成一种加合物，加合物产生的加合峰为干扰峰，核酸反应产物的目标峰附近出现盐离子而产生加合峰时，当加合峰与目标峰不重合时对于目标峰影响较少，当加合峰与目标峰重合时，可能造成目标峰变宽信噪比下降、分辨率下降、峰高升高、峰面积加大，峰偏移等不利于质谱分析结果判读。


技术实现要素：

5.本发明提供一种核酸质谱盐离子干扰评价方法，以至少解决现有技术中存在的以上技术问题。
6.本发明一方面提供一种核酸质谱盐离子干扰评价方法，该方法包括：
7.根据核酸质谱图识别pcr反应产物中盐离子加合峰，所述盐离子加合峰为pcr反应中盐离子产生的加合物形成的质谱峰；
8.根据所述盐离子加合峰的峰型特征和分布特征对所述盐离子进行干扰评价，所述干扰评价包括盐离子纯化程度、盐离子影响量或/和补偿量、预期纯化剂更换时间中的一种或多种。
9.在一可实施方式中，所述盐离子加合峰位于核酸质谱图中目标峰的位置处或目标峰的右侧，所述目标峰为pcr反应中目标对象形成的质谱峰，所述目标对象为核酸样本的延伸引物或/和延伸产物。
10.在一可实施方式中，所述目标对象包含但不限于核酸样本的延伸引物、核酸样本的腺嘌呤a型延伸产物、核酸样本的鸟嘌呤g型延伸产物、核酸样本的胞嘧啶c型延伸产物、
核酸样本的胸腺嘧啶t型延伸产物、核酸样本尿嘧啶的u型延伸产物中的一种或多种。
11.在一可实施方式中，在pcr反应中，所述目标对象与所述盐离子反应生成加合物，所述加合物的分子量为所述目标对象的分子量与所述盐离子的分子量之和。
12.在一可实施方式中，所述盐离子加合峰的峰型特征包括分子量、峰高、峰面积、信噪比、分辨率中的一种或多种。
13.在一可实施方式中，所述盐离子加合峰包括独立加合峰和重叠加合峰；
14.若所述盐离子加合峰的分子量与所述目标峰的分子量的差值与盐离子的分子量相同，则所述盐离子加合峰为独立加合峰；
15.若核酸质谱图中存在独立加合峰且所述目标峰之间的分子量的差值与盐离子的分子量相同，则分子量较大的所述目标峰中存在重叠加合峰。
16.在一可实施方式中，对所述盐离子进行盐离子纯化程度评价，包括：
17.将独立加合峰的峰高或/和峰面积与其对应的目标峰的峰高或/和峰面积的比值确定为加合比，所述加合比为0-1之间的小数；
18.根据所述加合比对所述盐离子纯化程度进行评价。
19.在一可实施方式中，所述对所述盐离子影响量或/和补偿量进行评价，包括：
20.若所述目标峰的右侧出现独立加合峰，则独立加合峰与其对应的目标峰的加合比为盐离子影响量；所述独立加合峰的峰高或峰面积为盐离子补偿量；
21.若所述目标峰的位置出现重叠加合峰，则根据所述加合比与所述目标峰位置的总峰面积确定盐离子的影响量；所述目标峰位置的总峰面积与所述目标峰的面积之差为盐离子补偿量。
22.在一可实施方式中，对所述预期纯化剂更换时间进行评价，包括：
23.若所述目标峰的右侧出现盐离子加合峰，当所述盐离子加合峰的峰面积逐渐增大、峰高逐渐变高且所述盐离子加合峰与其对应的所述目标峰的加合比大于等于纯化阈值线时，则预测可更换纯化剂。
24.在一可实施方式中，该方法还包括对pcr反应产物中盐离子的纯化进行评价，所述盐离子的纯化评价包括加合比、峰高、峰面积、信噪比、分辨率中的一种或多种。
25.在本发明的上述方案中，通过分析盐离子产生的加合物形成的加合峰的峰型特征和分布特征来识别pcr反应产物中盐离子纯化程度、盐离子影响量或/和补偿量、预测纯化剂更换时间及对于已经产生影响的目标峰进行补偿；通过分析盐离子对质谱图的干扰，从而进一步提高实验人员对质谱图的判读，提高质谱图分析的准确度。
附图说明
26.图1示出了一种核酸质谱盐离子干扰评价方法的流程示意图；
27.图2示出了不加除盐纯化剂的质谱峰图；
28.图3示出了加除盐纯化剂的质谱峰图。
具体实施方式
29.为使本发明的目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅
仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.如图1示出了本发明提供的一种核酸质谱盐离子干扰评价方法的流程示意图，该方法包括：
31.步骤s101、根据核酸质谱图识别pcr反应产物中盐离子加合峰，所述盐离子加合峰为pcr反应中盐离子产生的加合物形成的质谱峰。
32.pcr反应为聚合酶链式反应，本实施例选取成熟稳定的飞行时间质谱检测系统核酸样本预处理试剂，进行pcr扩增反应或/和延伸反应获取pcr反应产物，核酸样本预处理试剂为pcr反应的反应物，具体如下表1所示，
33.表1为pcr反应的预处理试剂及预处理试剂的主要组分
[0034][0035]
将上述试剂加入到384孔板中进行pcr反应，共计6孔位，分为两组，每组3孔位，其中一组样品中不加除盐纯化剂，作为对照组；另一组每孔加入等量除盐纯化剂，作为实验组，其中除盐纯化剂为阳离子交换树脂。使用飞行时间核酸质谱仪进行上机检测，获取对照组和实验组的质谱原始数据，共计有6组数据。原始数据包括目标峰及目标峰右侧的质谱峰的峰位置、峰高、峰宽、分辨率、偏移量、信噪比、峰面积等，基于原始数据绘制核酸质谱峰图，其中质谱峰图的横坐标为质荷比(m/z)，即分子量，纵坐标为强度。
[0036]
步骤s102、根据所述盐离子加合峰的峰型特征和分布特征对所述盐离子进行干扰评价，所述干扰评价包括盐离子纯化程度、盐离子影响量或/和补偿量、预期纯化剂更换时间中的一种或多种。
[0037]
因为盐离子加合峰为pcr反应中盐离子产生的加合物形成的质谱峰，因此盐离子加合峰的分子量大于与其对应的目标峰的分子量，因此盐离子加合峰位于核酸质谱图中目标峰的右侧，盐离子包括但不限于na

、k

、mg
2
、mn
2
，目标峰为pcr反应中目标对象形成的质谱峰，目标对象为核酸样本的延伸引物或/和延伸产物。
[0038]
目标对象包含但不限于核酸样本的延伸引物p1、核酸样本的腺嘌呤a型延伸产物p2、核酸样本的鸟嘌呤g型延伸产物p3、核酸样本的胞嘧啶c型延伸产物p4、核酸样本的胸腺嘧啶t型延伸产物p5、核酸样本尿嘧啶的u型延伸产物p6中的一种或多种，目标对象统称为
pm。
[0039]
在pcr反应中，目标对象与盐离子反应生成加合物，即加合物是扩增产物及延伸产物自身带有的磷酸根与盐离子结合产生的一种物质，加合物的分子量为目标对象的分子量与盐离子的分子量之和。
[0040]
盐离子加合峰的峰型特征包括分子量、峰高、峰面积、信噪比、分辨率中的一种或多种。分子量即核酸质谱图中的横坐标数据，峰高、峰面积、信噪比及分辨率，依据飞行时间核酸质谱仪测试后得到的原始数据绘制的质谱图即可确定。
[0041]
在一个示例中，盐离子加合峰包括独立加合峰和重叠加合峰；
[0042]
若盐离子加合峰的分子量与目标峰的分子量的差值与盐离子的分子量相同，则盐离子加合峰为独立加合峰。当独立加合峰的信噪比(snr)≥3，分辨率(r)≥50时，独立加合峰成立。
[0043]
例如目标峰右侧的峰即盐离子加合峰的分子量与目标峰的分子量的差值为23，则该盐离子加合峰为钠离子产生的独立加合峰，由于实验误差、设备误差以及横坐标数据读取的误差等原因，盐离子加合峰的分子量与目标峰的分子量的差值不一定是整数，而有可能是小数，例如获取的差值为23.15，则依旧将该盐离子加合峰为钠离子产生的独立加合峰。
[0044]
若质谱图中存在独立加合峰且所述目标峰之间的分子量的差值与盐离子的分子量相同，则分子量较大的所述目标峰中存在重叠加合峰。
[0045]
若质谱图中存在独立加合峰，说明质谱图中存在盐离子的影响，盐离子有可能在目标峰的位置出现重叠加合峰。例如目标峰p1分子量与目标峰p2分子量的差值等于钠离子或钾离子或锰离子的分子量，那么目标峰p2这个位置会有可能存在目标峰p1产生的钠离子加合峰或钾离子加合峰或锰离子加合峰的情况，即说明目标对象p1与盐离子(例如钠离子或钾离子或锰离子)发生反应产生了加合物，加合物在目标峰p2位置产生的质谱峰与目标峰p2重叠，因此目标峰p2里就存在重叠加合峰。
[0046]
在一个示例中，对盐离子进行盐离子纯化程度评价，包括：
[0047]
将独立加合峰的峰高或峰面积与其对应的目标峰的峰高或峰面积的比值确定为加合比，加合比为0-1之间的小数；
[0048]
根据加合比对盐离子纯化程度进行评价。
[0049]
例如加合比＝独立加合峰的峰高/目标峰的峰高，或者加合比＝独立加合峰的峰面积/目标峰的峰面积，加合比越大，越趋近于1，说明加合物越多，盐离子纯化程度越低；加合比越小，越趋近于0，说明加合物越少，盐离子纯化程度越高。
[0050]
在一个示例中，对盐离子影响量或/和补偿量进行评价，包括：
[0051]
若所述目标峰的右侧出现独立加合峰，则独立加合峰与其对应的目标峰的加合比为盐离子影响量；所述独立加合峰的峰高或峰面积为盐离子补偿量；
[0052]
若所述目标峰的位置出现重叠加合峰，则根据所述加合比与所述目标峰位置的总峰面积确定盐离子的影响量；所述目标峰位置的总峰面积与所述目标峰的面积之差为盐离子补偿量。
[0053]
例如目标峰的右侧出现独立加合峰，假设根据核酸质谱图确定独立加合峰的峰面积为20，目标峰的峰面积为40，所以盐离子生成的独立加合峰影响量为独立加合峰峰面积/
目标峰峰面积＝0.5。盐离子产生的独立加合峰的峰高或峰面积即为补偿量，例如独立加合峰的峰面积20是补偿量。
[0054]
例如目标峰位置出现重叠加合峰，假设加合比为0.2，根据核酸质谱图上可以得到：目标峰位置的总峰面积为120，其中目标峰位置的总峰面积为目标峰的峰面积和重叠加合峰的峰面积之和，那么重叠结合峰最小影响量假设为y，根据加合比和目标峰位置的总峰面积，即可以确定由盐离子产生的重叠加合峰的影响量，y/总峰面积-y＝加合比，即y/120-y＝0.2，可以确定y＝20，因此由盐离子产生的重叠加合峰的影响量为20。假设目标峰的峰面积为80，则目标峰位置的总峰面积120与目标峰的面积80之差为盐离子补偿量，即120-80＝40。
[0055]
考虑盐离子的影响量或补偿量，再分析目标峰时需要考虑加合峰的影响，具体是：若目标峰的右侧出现独立加合峰，则分析目标峰的峰高或峰面积时加上独立加合峰的峰高或峰面积；若目标峰的右侧出现重叠加合峰，则分析目标峰的峰高或峰面积时减去重叠加合峰的峰高或峰面积。
[0056]
本实施例对照组中没有加入除盐纯化剂，因此对照组中的盐离子会对质谱峰图产生影响。经过飞行时间核酸质谱仪进行上机检测后，获取对照组的原始数据，其中对照组1的原始数据分别如下表2所示：
[0057]
表2：对照组1目标峰p1和目标峰p2数据
[0058]
质谱峰峰位置峰高峰宽分辨率偏移量信噪比峰面积目标峰p05172.0417.387.42687.88-0.42609.05113.72目标峰p15210.5715.607.53691.90-0.06546.67103.65右侧峰15212.174.788.84591.03-0.02144.6737.08右侧峰25232.585.998.93586.02-0.19209.9147.19右侧峰35249.704.4312.71413.010.79155.2949.70目标峰p26525.5013.6110.51621.020.55476.75126.13右侧峰16547.736.5111.07591.54-0.54227.9063.51右侧峰26564.955.0714.65448.180.87177.5565.48
[0059]
根据飞行时间核酸质谱仪得到的原始数据绘制核酸质谱图，如图2所示，其中横坐标为5210.57的峰为目标峰p1，横坐标为6525.50的峰为目标峰p2。通过对表1峰位置数据即分子量进行分析，目标峰p0的分子量为5172.04，目标峰p1的分子量为5210.57，目标峰p0与目标峰p1分子量相差为38.53，约为一个钾离子的分子量，那么在目标峰p1位置处可能存在钾离子峰干扰；目标峰p1右侧峰1与目标峰p0分子量相差约40.13约为一个钾离子的分子量，故右侧峰1与目标峰p1有重合，因此右侧峰1为钾离子形成的重叠加合峰。
[0060]
目标峰p1的分子量为5210.57，目标峰p1右侧峰2的分子量为5232.58，右侧峰2与目标峰p1之间的分子量差值为22.01，约为一个钠离子的分子量，因此目标峰p1右侧峰2为钠离子形成的独立加合峰。
[0061]
目标峰p1的分子量为5210.57，目标峰p1右侧峰3的分子量为5249.70，右侧峰3与目标峰p1之间的分子量差值为39.13，约为一个钾离子的分子量，因此目标峰p1右侧峰3为钾离子形成的独立加合峰。
[0062]
同理，由于目标峰p2与其右侧峰1之间的分子量差值为22.23，约为一个钠离子的
分子量，因此目标峰p2右侧峰1为钠离子形成的独立加合峰。目标峰p2与其右侧峰2之间的分子量差值为39.45，约为一个钾离子的分子量，因此目标峰p2右侧峰2为钾离子形成的独立加合峰。
[0063]
在一个示例中，对所述预期纯化剂更换时间进行评价，包括：
[0064]
若所述目标峰的右侧出现盐离子加合峰，当所述盐离子加合峰的峰面积逐渐增大、峰高逐渐变高且所述盐离子加合峰与其对应的所述目标峰的加合比大于等于纯化阈值线，按照本示例纯化阈值线等于0.2时，则预测可更换纯化剂。
[0065]
进一步分析对照组质谱峰数据，通过对峰面积数据分析，以其中对照组1中目标峰p1为例，目标峰p1右侧峰2峰面积与目标峰p1峰面积的加合比ria
12
＝47.19/103.65＝0.46，目标峰p1右侧峰3峰面积与目标峰p1峰面积比ria
13
＝49.70/103.65＝0.48；目标峰p1右侧峰2峰高与目标峰p1峰高比ria
12
＝5.99/15.60＝0.38，目标峰p1右侧峰3峰高与目标峰p1峰高比ria
11
＝4.43/15.60＝0.28。对于目标峰p1和p2，目标峰右侧独立加合峰峰面积与目标峰峰面积，即加合比ria≥0.2；目标峰右侧独立加合峰峰高与目标峰峰高比值，即加合比ria≥0.2。因此，当加合比ria≥纯化阈值线0.2时，说明需要加入或更换纯化剂，不同种类的除盐纯化剂及不同核酸扩增配方造成的加合比略有差异，可以通过试验的方式给出纯化阈值线具体值，如果严格控制纯化效果，纯化阈值线可以是0.15或0.18等，如果是放宽纯化效果，纯化阈值线可以是0.25或0.30等，本发明对此不做限制。
[0066]
本实施例实验组中加入除盐纯化剂，因此实验组中没有盐离子对质谱峰图产生影响。经过飞行时间核酸质谱仪进行上机检测后，获取实验组的原始数据，其中实验组1的原始数据分别如下表3所示：
[0067]
表3：实验组1目标峰p1和目标峰p2数据
[0068]
质谱峰峰位置峰高峰宽分辨率偏移量信噪比峰面积目标峰p15209.3041.386.91753.750.01817.51252.29右侧峰15228.072.005.110000右侧峰25246.931.256.65788.820.7124.667.33目标峰p26523.9535.7010.56617.680.50705.17332.58右侧峰16580.672.0621.14311.36-1.5040.7738.47右侧峰26621.182.2417.01389.16-0.3044.2033.58
[0069]
根据飞行时间核酸质谱仪得到的原始数据绘制核酸质谱图，如图3所示，其中横坐标为5209.30的峰为目标峰p1，横坐标为6523.95的峰为目标峰p2。通过对表3峰位置数据分析，目标峰p1与其右侧峰1和右侧峰2的分子量的差值与盐离子的分子量均不相同，因此，可判定目标峰p1右侧的右侧峰1和右侧峰2不是盐离子产生的加合峰。目标峰p2与其右侧峰1和右侧峰2的分子量的差值与盐离子的分子量均不相同，因此，可判定目标峰p2右侧的右侧峰1和右侧峰2不是盐离子产生的加合峰。
[0070]
进一步对峰高数据分析可知，目标峰p1右侧的右侧峰1和右侧峰2的峰高分别为2.00和1.25，目标峰p2右侧的右侧峰1和右侧峰2的峰高分别为2.06和2.24，说明加入纯化剂后目标峰右侧的右侧峰1与右侧峰2峰高较低，对目标峰影响较小。
[0071]
通过对表2和表3的数据分析可知，对目标峰右侧产生的盐离子加合峰统计可以看出加合峰为独立加合峰，且多为钠离子、钾离子产生的加合峰。对照组中目标峰p1的峰高为
15.60，峰面积为103.65，而实验组中目标峰p1的峰高为41.38，峰面积为252.29，与实验组对比，对照组中目标峰的峰高明显降低，峰面积明显减小。另外对照组中，钠离子、钾离子产生的独立加合峰的峰面积/峰高与目标峰的峰面积/峰高比值ria大于等于纯化阈值线0.2，由此可以判断核酸样品中盐离子对质谱检测有干扰。说明盐离子纯化剂纯化效果较差和/或纯化剂使用过程中纯化效果发生衰减，提示需要及时更换纯化剂，对目标峰做结果分析时需要对已经产生影响的目标峰进行补偿。
[0072]
在一个示例中，该方法还包括：
[0073]
对pcr反应产物中盐离子的纯化进行评价，所述盐离子的评价包括加合比、峰高、峰面积、信噪比、分辨率中的一种或多种。以加合峰为对象分别横向统计独立加合峰的评价项目，以目标峰为对象分别纵向统计独立加合峰的评价项目，针对不同的评价项目可以按照定性或定量的方式进行评价，核酸反应产物中纯化盐离子结果评价权重依次分别为加合比、峰高、峰面积、信噪比、分辨率，各权重可以独立使用和/或联合使用。例如根据独立加合峰与目标峰的加合比定性评价盐离子纯化程度，根据峰高或峰面积定量计算加合比，来定性分析盐离子的影响量或补偿量。
[0074]
以上结合具体实施例描述了本技术的基本原理，但是，需要指出的是，在本技术中提及的优点、优势、效果等仅是示例而非限制，不能认为这些优点、优势、效果等是本技术的各个实施例必须具备的。另外，上述公开的具体细节仅是为了示例的作用和便于理解的作用，而非限制，上述细节并不限制本技术为必须采用上述具体的细节来实现。
[0075]
本技术中涉及的诸如“包括”、“包含”、“具有”等等的词语是开放性词汇，指“包括但不限于”，且可与其互换使用。这里所使用的词汇“或”和“和”指词汇“和/或”，且可与其互换使用，除非上下文明确指示不是如此。这里所使用的词汇“诸如”指词组“如但不限于”，且可与其互换使用。
[0076]
还需要指出的是，在本技术的方法中，各步骤是可以分解和/或重新组合的，这些分解和/或重新组合应视为本技术的等效方案。
[0077]
提供所公开的方面的以上描述以使本领域的任何技术人员能够做出或者使用本技术。对这些方面的各种修改对于本领域技术人员而言是非常显而易见的，并且在此定义的一般原理可以应用于其他方面而不脱离本技术的范围。因此，本技术不意图被限制到在此示出的方面，而是按照与在此公开的原理和新颖的特征一致的最宽范围。
[0078]
为了例示和描述的目的已经给出了以上描述。此外，此描述不意图将本技术的实施例限制到在此公开的形式。尽管以上已经讨论了多个示例方面和实施例，但是本领域技术人员将认识到其某些变型、修改、改变、添加和子组合。