一种四苯乙烯基苯并咪唑类荧光探针及其制备方法和应用

1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种四苯乙烯基苯并咪唑类荧光探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.人血清白蛋白(hsa,human serum albumin)是一种心形单链蛋白，由585个氨基酸组成，分子量约为66.5kda,是血浆中含量最丰富的蛋白质，占血浆蛋白总量的50％以上。hsa在肝细胞合成后，经粗面内质网加工后，转运至高尔基体修饰，然后形成成熟的白蛋白并释放到血液中。hsa具有强大的配体结合能力，是诸多内源性物质和外源性药物(如激素、脂肪酸、药物和其他生物活性小分子)的主要转运蛋白。此外，hsa在维持血浆胶体渗透压，清除自由基，抑制血小板聚集，参与免疫调节等生理过程中也发挥着重要功能。
3.在人体代谢正常情况下，血液中hsa的含量维持在35-50g/l，由于肾脏的过滤作用，尿液中hsa浓度通常低于30mg/l。hsa水平异常能够反映出人体内某些生理指标的异常，如血浆中低水平的hsa，可能是由类风湿性关节炎、肝功能衰竭、肝硬化和慢性肝炎引起的；尿液中高水平的hsa，则可能与慢性肾脏疾病、急性肾炎、糖尿病肾小球硬化、肾功能衰竭等疾病相关。因此，hsa在血清和尿液中的含量是监测人体健康状态及早期诊断相关疾病的重要指标。
4.目前，检测hsa的方法主要有：基于染料结合的比色方法、基于抗体的免疫化学方法和基于lc-ms/ms的蛋白质组学方法。其中，染料结合法和免疫化学法是临床检测hsa的主要方法。染料结合法大多选用溴甲酚绿(bcg)和溴甲酚紫(bcp)作为显色剂。bcg对hsa高度敏感，但特异性差，特别是在白蛋白含量较低和球蛋白含量较高的情况下，bcg也可与球蛋白结合，导致hsa的含量被高估；bcp对hsa的特异性好，但在需要血液透析和腹膜透析患者的血清中，bcp法测得的hsa含量偏低。免疫化学法虽然特异性强，但耗时长、操作繁琐、成本较高，限制了其在hsa检测中的应用。蛋白质组学方法对操作人员专业技能要求高、成本高昂、耗时长，不适用于hsa的快速检测。
5.相对于以上检测方法，基于分子探针技术的荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、响应速率快、实时监测、操作简单、成本低廉等优势，受到研究者的广泛关注。近年来，研究者虽然报道了数量众多的hsa荧光探针，但普遍存在以下缺陷：探针分子主要结合在hsa分子的药物位点上，由于多种内源性物质和外源性药物也结合在此处，探针与共存物存在竞争效应，抗干扰性差；不能有效区分hsa和bsa。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种四苯乙烯基苯并咪唑类荧光探针及其制备方法和应用，以解决现有hsa荧光探针的合成困难、灵敏度低、选择性差等问题。
7.本发明为实现其目的采用的技术方案是：一种四苯乙烯基苯并咪唑类荧光探针(简称tpnn)，其具有式(ⅰ)所示结构：
[0008][0009]
一种上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0010]
(1)将1，2-二甲基苯并咪唑和(3-溴丙基)二甲基溴化铵加入到乙腈中，加热回流，待反应完成后，分离得到化合物a：
[0011][0012]
(2)将化合物a和1,1,2-三苯基-2-(4-甲醛基苯)乙烯在n,n-二甲基甲酰胺中加热回流，分离纯化后得到式(ⅰ)所示结构的荧光探针。
[0013]
步骤(1)中，1，2-二甲基苯并咪唑和(3-溴丙基)二甲基溴化铵的摩尔比为1/1-1.5/1。
[0014]
步骤(1)中，反应温度为70-95℃，反应时间为8-12h。
[0015]
步骤(1)中，分离步骤为：反应结束后将反应液浓缩至原体积的1/2-1/4，析出固体后过滤得到产物。
[0016]
步骤(2)中，化合物a和1,1,2-三苯基-2-(4-甲醛基苯)乙烯的摩尔比为1/1-1/2。
[0017]
步骤(2)中，反应温度为70-95℃，反应时间为12h。
[0018]
步骤(2)中，加入哌嗪作为催化剂，化合物a与催化剂的摩尔比为1/2-1/4。
[0019]
步骤(2)中，分离纯化步骤为：反应结束后，将反应液旋蒸除去溶剂，所得粗产物用二氯甲烷/甲醇混合溶剂为淋洗剂，过硅胶色谱柱，过柱液经旋蒸除去溶剂、真空干燥后，得到荧光探针纯品，所述二氯甲烷/甲醇体积比为10/1。
[0020]
本发明步骤(1)的反应式为：
[0021][0022]
本发明步骤(2)的反应式为：
[0023][0024]
上述的荧光探针在hsa检测中的应用。
[0025]
本发明的有益效果是：
[0026]
(1)合成简单
[0027]
本发明制备荧光探针的原料易得、合成步骤简单、易于分离纯化，适合批量生产，有利于商业化的推广应用。
[0028]
(2)具有聚集诱导发光(aie)性质
[0029]
tpnn具有典型的aie性质，在聚集状态下能够发出高强度的荧光，提高了方法的灵敏度，检测限为14.33ng/ml。
[0030]
(3)响应速率快、选择性好、稳定性强
[0031]
tpnn对hsa的响应过程可在2min内完成，两者络合物在4h内保持稳定，检测过程不受其它物质(如离子、硫醇、氨基酸、其它蛋白质等)的干扰。
附图说明
[0032]
图1是tpnn的1h nmr谱图。
[0033]
图2是tpnn的
13
c nmr谱图。
[0034]
图3是在甲苯体积分数为0-100％的甲苯-四氢呋喃混合溶液中，tpnn的荧光光谱图。其中，(a)是tpnn的荧光光谱随甲苯体积分数的变化；(b)是tpnn在530nm处的荧光强度随甲苯体积分数的变化趋势。
[0035]
图4是加入不同浓度的hsa后，tpnn的荧光光谱图，其中，(a)是tpnn的荧光光谱随hsa浓度的变化趋势；(b)是tpnn在530nm处的荧光强度与hsa浓度间的线性关系。
[0036]
图5是tpnn对hsa的响应速率图。
[0037]
图6是加入不同物质后，tpnn在530nm处的荧光强度对比图，其中，(a)是在加入阳离子后，tpnn在530nm处的荧光强度；(b)是在加入阴离子后，tpnn在530nm处的荧光强度；(c)是在加入氨基酸后，tpnn在530nm处的荧光强度；(d)是在加入生物大分子后，tpnn在530nm处的荧光强度。
[0038]
图7是tpnn及tpnn-hsa复合物在530nm处的荧光强度随时间的变化。
[0039]
图8是tpnn及tpnn-hsa的络合物在530nm处的荧光强度随温度的变化。
具体实施方式
[0040]
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述，下述实施例仅作为说明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
[0041]
实施例1tpnn的合成
[0042]
(1)化合物a的合成
[0043][0044]
向50ml的圆底烧瓶中加入1，2-二甲基苯并咪唑0.44g(3mmol)和(3-溴丙基)二甲基溴化铵0.78g(3mmol)，乙腈25ml，开启搅拌，加热至90℃，回流反应8h。然后，将反应液冷却至室温，反应液减压浓缩为原体积的1/2，析出白色固体，减压抽滤得化合物a，将其进行下一步反应。
[0045]
(2)荧光探针tpnn的合成
[0046][0047]
向100ml的圆底烧瓶中加入1,1,2-三苯基-2-(4-甲醛基苯)乙烯0.36g(1mmol)和化合物a0.41g(1mmol)，哌嗪0.17g(2mmol)，n,n-二甲基甲酰胺80ml，开启搅拌，加热至90℃，回流反应12h后终止反应。然后，将反应液冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂，粗产物用二氯甲烷/甲醇(v/v，10:1)为淋洗剂过硅胶色谱柱，过柱液再经旋转蒸发除去溶剂、真空干燥，得到tpnn纯品。
[0048]
其1h nmr图谱如图1：
[0049]
其
13
c nmr图谱如图2：
[0050]
实施例2tpnn的aie性质
[0051]
将实施例1制备的tpnn的dmso储备液(浓度为500μm)加入到2ml ep管中，然后向管中依次加入不同体积分数的甲苯和四氢呋喃(v
甲苯
：v
四氢呋喃
＝0:10，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，10:0)。溶液总体积为1ml，tpnn终浓度为5μm。以上溶液室温放置10min后测定其荧光光谱(激发波长370nm)。
[0052]
图3(a)为在甲苯-四氢呋喃混合溶剂中，tpnn的荧光光谱随甲苯体积分数的变化；(b)为tpnn在530nm处的荧光强度随甲苯体积分数的变化趋势。如图3所示，四氢呋喃和甲苯分别作为tpnn的良性溶剂和不良性溶剂，随着甲苯-四氢呋喃混合溶液中甲苯体积分数的
增大，tpnn的溶解度逐渐减小，当甲苯体积分数由0增加到40％时，荧光缓慢增长；而当甲苯体积分数由40％增加至90％，荧光迅速增强；随着甲苯体积分数进一步升至100％，荧光强度开始降低，这主要是由于tpnn聚集体的沉淀导致的。tpnn的发射光谱在混合溶剂中的变化趋势与已报道的aie染料高度一致，反映出其具有aie特性
[0053]
实施例3tpnn对hsa的光谱响应性
[0054]
将实施例1制备的tpnn的dmso储备液(浓度为500μm)加入到2ml ep管中，然后向管中依次加入去离子水、pbs缓冲溶液(ph7,200mm)和不同体积的hsa储备液(浓度为1mg/ml)。溶液总体积为1ml，tpnn终浓度为5μm，pbs缓冲溶液终浓度为10mm，hsa终浓度为0-500μg/ml，以上溶液室温放置10min后测定其荧光光谱(激发波长370nm)。
[0055]
图4(a)为加入0-500μg/ml hsa后，tpnn的荧光光谱；图4(b)为加入0-60μg/ml hsa后，tpnn在530nm处的荧光强度与hsa浓度的线性关系图。如图4(a)和图4(b)所示，随着hsa浓度的增加，tpnn的荧光逐渐增强，显示出对hsa的高灵敏响应。tpnn在530nm处的荧光强度与0-60μg/ml范围内的hsa浓度符合线性方程：f
530
＝21.48*[hsa] 41.74(r2＝0.9951)，检测限为14.33ng/ml。结果表明tpnn对于hsa有较高的灵敏度，可以应用于hsa的定量分析。
[0056]
实施例4tpnn对hsa的响应速率
[0057]
将实施例1制备的tpnn的dmso储备液(浓度为500μm)、去离子水、pbs缓冲溶液(ph7,200mm)和不同体积的hsa储备液(浓度为1mg/ml)，依次加入四面透光的石英比色皿中，立刻放入荧光分光光度计，采用时间荧光扫描模式进行测定。激发波长设定为370nm，发射波长设定为530nm，时间间隔为2s。溶液总体积为1ml，tpnn终浓度为5μm，pbs缓冲溶液终浓度为10mm，hsa终浓度分别为30μg/ml和60μg/ml。
[0058]
图5为在加入30μg/ml和60μg/ml的hsa后，tpnn在530nm处荧光强度随时间的变化曲线。在加入hsa后，tpnn在530nm处的荧光强度迅速升高，在2min内达到稳定水平，表明tpnn与hsa的结合速率很快，可以应用于hsa的快速检测。
[0059]
实施例5tpnn对hsa的选择性
[0060]
将实施例1制备的tpnn的dmso储备液(浓度为500μm)加入2ml ep管中，再依次向管中加入去离子水、pbs缓冲溶液(ph7,200mm)和各种待测物，溶液总体积为1ml，tpnn终浓度为5μm，pbs缓冲溶液终浓度为10mm，以上溶液室温放置10min后测定其荧光光谱(激发波长370nm)。分析物包括：1.空白，2.hsa(60μg/ml)，3.bsa(60μg/ml)，4.ins(100μg/ml)，5.tps(100μg/ml)，6.lzm(100μg/ml)，7.β-glucosidase(100μg/ml)，8.igg(100μg/ml)，9.hgb(100μg/ml)，10.γ-globulin(100μg/ml)，11.glu(500μm)，12.ca(500μm)，13.d-biotin(100μg/ml)，14.cre(2mm)，15.creatine(3mm)，16.urea(30mm)，17.la(100μm)，18.ala(1mm)，19.glu(1mm)，20.pro(1mm)，21.hcy(1mm)，22.arg(1mm)，23.asp(1mm)，24.phe(1mm)，25.tyr(1mm)，26.his(1mm)，27.ser(1mm)，28.leu(1mm)，29.val(1mm)，30.trp(1mm)，31.met(1mm)，32.thr(1mm)，33.cys(1mm)，34.gsh(1mm)，35.na

(1mm)，36.k

(1mm)，37.mg
2
(1mm)，38.ca
2
(1mm)，39.zn
2
(1mm)，40.fe
2
(1mm)，41.fe
3
(1mm)，42.cu
2
(1mm)，43.co
2
(1mm)，44.ni

(1mm)，45.sr
2
(1mm)，46.sn
2
(1mm)，47.ba
2
(1mm)，48.cr
2
(1mm)，49.pb
2
(1mm)，50.nh
4
(1mm)，51.cd
2
(1mm)，52.mn
2
(1mm)，53.f-(1mm)，54.cl-(1mm)，55.br-(1mm)，56.i-(1mm)，57.co
32-(1mm)，58.no
3-(1mm)，59.s
2-(1mm)，60.s2o
32-(1mm)，61.so
32-(1mm)，62.so
42-(1mm)，63.hpo
4-(1mm)，64.ch3coo-(1mm)，65.ppi(1mm)，66.edta(1mm)，
67.stpp(1mm)。
[0061]
图6为加入各种化合物后，tpnn在530nm处的荧光强度。如图6所示，tpnn仅对hsa和bsa表现出了荧光增强响应，这是由于bsa和hsa有着类似的结构。tpnn对bsa荧光增强幅度低于hsa，根据荧光的强弱可以很好的区分这两种结构相似的蛋白。以上结果反映出，tpnn对hsa具有良好的选择性。
[0062]
实施例6tpnn与hsa反应前后的稳定性
[0063]
将实施例1制备的tpnn的dmso储备液(500μm)加入到2ml ep管中，再向管内依次加入去离子水、pbs缓冲溶液(ph7,200mm)和hsa储备液(1mg/ml)。溶液总体积为1ml，tpnn终浓度为5μm，pbs缓冲溶液终浓度为10mm，hsa终浓度为60μg/ml，以上溶液每隔0.5h进行一次荧光光谱的测定(激发波长370nm)，共4h。
[0064]
图7为tpnn和tpnn-hsa复合物在530nm处的荧光强度随时间的变化。如图7所示，随着放置时间的延长，tpnn在530nm处的荧光强度几乎没有变化，tpnn-hsa复合物在530nm处的荧光强度1h内上升了10％，随后保持稳定。结果表明，tpnn和tpnn-hsa复合物能在较长时间内保持稳定。
[0065]
实施例7温度对hsa测定的影响
[0066]
将实施例1制备的tpnn的dmso储备液(500μm)加入到2ml ep管中，再向管内依次加入去离子水、pbs缓冲溶液(ph7,200mm)和hsa储备液(1mg/ml)。溶液总体积为1ml，tpnn终浓度为5μm，pbs缓冲溶液终浓度为10mm，hsa终浓度为60μg/ml，以上溶液分别于不同温度(10℃、20℃、25℃、30℃、40℃)下放置10min后，进行荧光光谱的测定(激发波长370nm)。
[0067]
图8为tpnn和tpnn-hsa复合物在530nm处的荧光强度随温度的变化。随着温度的升高，tpnn和tpnn-hsa复合物在530nm处的荧光强度基本保持稳定，表明其在溶液中热稳定性强，受温度影响小。