一种基于倍频散射检测α-淀粉酶含量的方法

一种基于倍频散射检测
α-淀粉酶含量的方法
技术领域
1.本发明属于分析化学领域，涉及一种α-淀粉酶含量的检测方法，具体涉及一种基于倍频散射检测α-淀粉酶含量的方法。


背景技术：

2.α-淀粉酶(1,4-α-d-葡聚糖葡聚糖水解酶)是第一个被发现和表征的酶，主要在人类的胰腺和唾液腺中产生，是一种重要的酶，对淀粉、糖原和其他相关碳水化合物中存在的α-1,4-糖苷键水解进行催化，从而转化为糖，例如葡萄糖、麦芽糖和糊精。此外，α-淀粉酶在食品、发酵、纺织、造纸、洗涤剂、燃料和制糖工业中有着广泛的应用。且随着生物技术的进步，α-淀粉酶的应用已经扩展到许多其他领域，如临床、医学和分析化学。
3.其中，在人类健康状况监测方面，α-淀粉酶已成为许多疾病临床诊断中最具代表性的生物标志物之一。不同体液中α-淀粉酶的活性需要定期监测，因为唾液、尿液、皮脂或血清中该酶的水平能反映健康状态。α-淀粉酶水平升高表明急性胰腺炎、胰腺癌、唾液腺感染、胆管阻塞或肠胃炎的发病，而α-淀粉酶水平降低则表明胰腺或肾脏功能紊乱，以及妊娠毒血症。同时，抑制α-淀粉酶活性可以减少ii型糖尿病的发生，是治疗糖尿病的重要药物靶点。因此，α-淀粉酶的检测在诊断和疾病治疗中具有重要的临床意义，对于测定α-淀粉酶活性的高灵敏度和高选择性也提出了更高的要求。
4.此外，α-淀粉酶的检测在农业、养殖业等领域也具有重要的应用价值。淀粉作为能源物质贮藏在植物的种子和块茎等组织中。在种子的胚乳中含有大量离散的、不溶性的淀粉颗粒。α-淀粉酶在谷类作物中以多种形式存在，在淀粉代谢及种子发芽过程中起着非常重要的作用，其大量表达合成受植物激素如赤霉素的调节影响。α-淀粉酶活性是影响啤酒大麦等农作物品质的重要因素之一，因此研究人员将高α-淀粉酶活性性状作为啤酒大麦等农作物品种选育的重要目标之一。另外，研究表明，家蚕幼虫体液中的淀粉酶是一类较为重要的酶，它能将淀粉分解为小分子糖类，促进营养物质的吸收利用和提供生理活性所必须的能量。该酶的活性与家蚕的生理状况密切相关。因此，对α-淀粉酶含量进行检测在动植物品种选育及其生长发育情况研究，以及微生物筛选等方面具有重要的应用价值。
5.目前，有许多方法用于测定动物体液或植物提取液中的α-淀粉酶含量或活性，如分光光度法、色谱法、比色法、荧光测定法、电化学方法、免疫学方法等。然而，这些方法普遍存在检测体系组成复杂，成本较高，操作步骤繁琐的问题，而且检测灵敏度以及选择性都不够理想。
6.因此，如何提供一种操作简单、灵敏度高、选择性好、成本低且高效的α-淀粉酶检测方法，成为了本领域亟待解决的问题。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种α-淀粉酶含量的检测方法，具体提供一种基于倍频散射检测α-淀粉酶含量的方法。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种基于倍频散射检测α-淀粉酶含量的方法，所述方法包括如下步骤：
10.(1)将淀粉与缓冲溶液混合，得淀粉混合液，检测淀粉混合液的倍频散射强度，记为a0；将淀粉、α-淀粉酶标准品与缓冲溶液混合，得标准混合液，检测标准混合液的倍频散射强度，记为an；将淀粉、待测样本与缓冲溶液混合，得待测混合液，检测待测混合液的倍频散射强度，记为ax；
11.(2)计算倍频散射强度变化值a0-an和a0-ax，绘制倍频散射强度变化值与α-淀粉酶标准品含量之间的标准曲线，根据标准曲线法计算待测样本中的α-淀粉酶含量。
12.倍频散射(frequency-doubling scattering，fds)，是光散射光谱技术中的一种，是指光散射波长位于激发波长一半时产生的一种特殊的弹性散射，因其高灵敏度、快速性和方便性而引起了广泛关注。这种技术基于这样一种现象：当分子或粒子结合在一起时，粒子体积的增大可以增强系统的光散射信号，从而实现对这些分子的灵敏检测。与其他分析方法相比，fds光谱方法具有耗时少、仪器简单、灵敏度高等显著优点。此外，它可以通过普通的荧光光谱仪与使用廉价且安全的试剂来实现检测分析。
13.本发明方法的检测原理是：在一定浓度范围以及适宜的测量参数下，淀粉随着其浓度的增加呈现规律性递增的倍频散射强度。固定淀粉的使用浓度，基于α-淀粉酶与淀粉之间的特异性反应，α-淀粉酶浓度的增加将导致反应体系倍频散射强度的减弱，由此即建立得到α-淀粉酶含量的检测方法。
14.本发明创造性地基于倍频散射进行α-淀粉酶含量的检测，与其他方法相比，所述方法具有操作简便、快速、检测体系简单、不需要大型仪器设备、成本低、检测灵敏度高、选择性好(能将α-淀粉酶与对腺苷脱氨酶、碱性磷酸酶、β-淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、胰酶等其他常见的酶区分)的优点，具有重要的应用价值。
15.优选地，所述淀粉为可溶性淀粉。
16.优选地，检测倍频散射强度时所用参数为：ex＝490nm，ex/em＝10/5。
17.当使用其他参数设置时，得到的倍频散射峰峰形不好。
18.优选地，所述淀粉混合液、标准混合液或待测混合液中淀粉的浓度均为3-5mg/ml，例如3mg/ml、3.2mg/ml、3.5mg/ml、3.7mg/ml、4mg/ml、4.2mg/ml、4.5mg/ml、4.7mg/ml、5mg/ml等。
19.优选地，所述标准混合液中α-淀粉酶标准品的浓度为1-200μg/ml，例如1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml等。
20.优选地，步骤(1)所述混合后还包括在55-65℃下进行加热，例如55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃等。
21.优选地，所述加热的时间为20-40min，例如20min、22min、25min、27min、30min、32min、35min、37min、40min等。
22.优选地，所述缓冲溶液包括磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液。
23.优选地，所述磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液的浓度为8-12mm，例如8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、10.5mm、11mm、11.5mm、12mm等。
24.优选地，所述磷酸缓冲液或磷酸盐缓冲液的ph为7.0-7.6，例如7.0、7.1、7.2、7.3、
7.4、7.5、7.6等。
25.优选地，所述待测样本包括动物体液或植物提取物。
26.所述动物体液例如血清、血浆、尿液、脑脊液、唾液等。
27.所述植物例如小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米等。
28.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
29.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
30.本发明创造性地提出一种基于倍频散射检测α-淀粉酶含量的方法，与其他方法相比，所述方法具有操作简便、快速、检测体系简单、不需要大型仪器设备、成本低、检测灵敏度高(检出限0.593μg/ml)、选择性好(能将α-淀粉酶与腺苷脱氨酶、碱性磷酸酶、β-淀粉酶、脂肪酶、胃蛋白酶、β-葡萄糖苷酶、葡萄糖氧化酶、胰酶等其他常见的酶区分)等优点，可用于动物体液或植物提取物等样本的检测，具有重要的应用价值。
附图说明
31.图1是不同浓度的可溶性淀粉的倍频散射强度结果图。
32.图2是固定浓度的可溶性淀粉与不同浓度的α-淀粉酶作用后的倍频散射强度结果图。
33.图3是倍频散射强度变化与α-淀粉酶(1mg/ml)的体积之间的拟合曲线。
34.图4是倍频散射强度变化与α-淀粉酶(1mg/ml)的体积之间的拟合直线。
35.图5是固定浓度的可溶性淀粉与不同酶作用后的倍频散射强度变化结果对比图。
具体实施方式
36.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
37.实施例1
38.本实施例考察不同浓度可溶性淀粉的倍频散射强度变化
39.将可溶性淀粉(购自北京化工厂有限责任公司)溶解于pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液中，配制成100mg/ml的可溶性淀粉母液。分别取不同体积(0μl、2.5μl、5μl、10μl、20μl、50μl、100μl)的可溶性淀粉母液用pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液稀释，定容至500μl。设置倍频散射强度测量参数为：ex＝490nm，ex/em＝10/5，测量反应后的溶液的倍频散射强度(荧光分光光度计，型号f-4600，日立)，结果见图1。
40.如图1所示，在一定浓度范围以及适宜的测量参数下，可溶性淀粉随着其浓度的增加呈现规律性递增的倍频散射强度。因此，本发明提出：固定可溶性淀粉的使用浓度，基于α-淀粉酶与可溶性淀粉之间的特异性反应，α-淀粉酶浓度的增加将导致反应体系倍频散射强度的减弱，由此即可建立一种检测α-淀粉酶的方法。
41.实施例2
42.本实施例提供一种基于倍频散射检测α-淀粉酶的方法，步骤如下：
43.(1)将可溶性淀粉溶解于pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液中，配制成100mg/ml的可溶性
淀粉母液。将α-淀粉酶标准品用pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液配置成浓度为1mg/ml的α-淀粉酶母液。
44.(2)取20μl可溶性淀粉母液，分别与不同体积(0μl、0.5μl、1μl、2.5μl、5μl、10μl、25μl、50μl、100μl)的α-淀粉酶母液混合后，用pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液稀释，定容至500μl，在60℃下反应30min。
45.(3)设置倍频散射强度测量参数为：ex＝490nm，ex/em＝10/5，测量反应后的溶液的倍频散射强度，结果见图2。各组溶液的倍频散射强度记为an(n表示加入的α-淀粉酶母液的体积，分别为0、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100)。计算各组溶液的倍频散射强度变化值，倍频散射强度变化值＝a0-an，绘制倍频散射强度变化值与α-淀粉酶体积之间的拟合曲线(图3)和拟合直线(图4)。
46.如图3所示，α-淀粉酶的浓度为0-200μg/ml范围内体系的倍频散射强度变化值与其浓度呈良好的线性关系，adj.r-square为0.99174。图4的回归方程为y＝19.37117 84.50491x，相关系数为r＝0.9945，adj.r-square为0.98536。且本发明方法的检出限为0.593μg/ml，灵敏度高。
47.(4)配制样本1——唾液加标样本溶液，方法为：收集适量唾液，用0.22μm过滤膜过滤，加入相应体积的pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液将唾液稀释至0.01％。
48.配制样本2——尿液加标样本溶液，方法为：采集新鲜的人体尿液，用pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液直接稀释至1.0％。所有唾液和尿液样品均取自健康个体，加标之前经110℃灭活30min，以消除样品中的α-淀粉酶信号干扰。
49.取50μl不同加标样本溶液与20μl可溶性淀粉母液混合，用pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液稀释，定容至500μl，在60℃下反应30min。设置倍频散射强度测量参数为：ex＝490nm，ex/em＝10/5，测量反应后的溶液的倍频散射强度，记为ax，计算各组溶液的倍频散射强度变化值a0-ax，利用标准曲线法，计算得到待测样本中的α-淀粉酶的含量。
50.实施例3
51.本实施例提供一种基于倍频散射检测α-淀粉酶的方法，其与实施例2的区别仅在于将“可溶性淀粉”替换为“直链淀粉，购自北京索莱宝科技有限公司”。其他参照实施例2。
52.实施例4
53.本实施例考察实施例2和实施例3的基于倍频散射检测α-淀粉酶的方法的精密度和准确度。
54.取50μl上述两种加标样本溶液，分别按照实施例2和实施例3的方法平行测定3次，结果如表1所示。
55.表1
56.方法样本加标浓度回收率(％)rsd(％)实施例2150μg/ml972.9实施例2250μg/ml104.63.4实施例3150μg/ml90.45.7实施例3250μg/ml111.27.2
57.结果显示，实施例2加标回收率在97-104.6％范围内，实施例3加标回收率在90.4-111.2％范围内，表明实施例2的方法的准确性高。
58.实施例2的相对标准偏差均比实施例3的相对标准偏差小，说明本发明采用可溶性淀粉更利于方法精密度、准确度的提高。
59.实施例5
60.本实施例考察实施例2的基于倍频散射检测α-淀粉酶的方法的特异性，方法如下：
61.取20μl可溶性淀粉母液，除空白对照组不加酶外，其他各组分别加入不同种酶溶液(α-淀粉酶：1mg/ml，50μl；腺苷脱氨酶：250u/ml，2μl；碱性磷酸酶：100u/ml，5μl；β-淀粉酶：100mg/ml，5μl；脂肪酶：100mg/ml，5μl；胃蛋白酶：100mg/ml，5μl；β-葡萄糖苷酶：100mg/ml，5μl；葡萄糖氧化酶：100mg/ml，5μl；胰酶：100mg/ml，5μl)，用pb(10mm,ph＝7.3)缓冲液稀释，定容至500μl，在60℃下反应30min。
62.设置倍频散射强度测量参数为：ex＝490nm，ex/em＝10/5，测量反应后的溶液的倍频散射强度，并计算各组溶液的倍频散射强度变化值(空白对照组的倍频散射强度与各组溶液的倍频散射强度的差值)，结果见图5。
63.结果表明：本发明的方法对α-淀粉酶的特异性良好，可将其与其他常见的酶区分开。
64.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种基于倍频散射检测α-淀粉酶含量的方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
65.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
66.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。