一种新型近红外水合肼荧光检测试剂及其应用的制作方法

1.本发明属于分析化学技术领域，涉及一种新型近红外水合肼荧光检测试剂的构建及应用。


背景技术：

2.水合肼（hydrazine，n2h4）是一种无色的易燃液体，在电池燃料、甚至导弹和火箭推进系统中都有应用。同时，它还是一种高反应活性的还原性和弱碱性物质，可作为抗氧化剂、除草剂以及植物生长调节剂等广泛应用于制药和农药相关领域。此外，水合肼还在纺织染料、防腐以及其他精细化工方面有重要的作用。
3.但是，水合肼对生物体而言是一种高毒性化学物质，它在使用、运输、存放等过程中都容易造成土壤等环境污染和人体伤害。如水合肼是一种神经毒素，它有着优异的水溶性，易于通过口腔或皮肤等途径被人体吸收，从而严重损害器官和中枢神经系统。美国环境保护署（epa）将水合肼列为潜在的致癌物，并将其阈值极限（tlv）设置为10 ppb。因此，开发可靠、灵敏的水合肼实时检测方法具有非常重要的意义。
4.已有色谱法、电化学法、滴定法等常规方法已被报道可用于水合肼的检测，但是这些方法通常需要昂贵的仪器设备、复杂的前处理和操作过程等缺陷。与之相比，基于荧光探针的荧光检测法则因其出色的选择性、灵敏度以及可实现在细胞组织内实时检测等一系列优点，受到了研究人员的青睐。
5.目前已有多个荧光探针被报道，且具有优异的特异性和灵敏度，但他们大多最大发射波长在紫外区域（400-600 nm）。如cn 110204535 a报道了一个香豆素类化合物的水合肼荧光分子探针，可与水合肼进行特异性作用，产生荧光光谱的变化，从而实现对水合肼的定量检测，但其最大发射波长为450 nm。有着较大的组织伤害性和较小的组织穿透力，且容易受到背景荧光的干扰，准确度容易受到影响。因此，开发一种灵敏度高、特异性强、可用于水溶液和生物体内水合肼检测的近红外荧光探针，是十分重要且必要的。


技术实现要素：

6.针对现有水合肼荧光分子探针存在的不足，本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、可用于水溶液和生物体内水合肼检测的近红外荧光探针及其高效制备方法。
7.为了实现上述目的，本发明提供了一种荧光检测试剂，具有式i结构：所述荧光探针的制备方法优选为：1）将邻羟基苯甲醛和dcm-cho溶解于无水乙醇中，加入四氢吡咯为催化剂，将反应体系
置于室温下搅拌至反应完全，可见大量红色固体析出。抽滤并用无水乙醇洗涤三次，干燥后，可获得化合物1。
8.2）将化合物1和乙酰丙酸溶于无水二氯甲烷中，加入edc和dmap作为缩合剂和催化剂。将反应体系在室温下搅拌至反应完全。减压除去溶剂后柱层析纯化，可得目标分子探针。
9.所述(1)步骤中邻羟基苯甲醛、dcm-cho和四氢吡咯的摩尔比为2:2:1。
10.所述(2)步骤中化合物1、乙酰丙酸、edc和dmap的摩尔比为5:10:10:1。
11.本发明的合成如下所示：本发明的机理如下所示：相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：（1）本发明提供的荧光检测试剂可与水合肼进行特异性作用，产生荧光光谱的变化，从而实现对水合肼的定量检测；（2）本发明提供的荧光检测试剂与水合肼响应之后，会发出红色荧光，具有组织穿透力强、组织损伤性小、且能有效避免背景荧光的干扰，准确度更高；（3）本发明提供的荧光检测试剂仅2步即可合成，后处理简单，产率高，适合大规模推广使用。
附图说明
12.【图1】本发明实施中荧光检测试剂的荧光强度随水合肼浓度变化的荧光发射光谱图；【图2】本发明实施中荧光检测试剂的荧光强度与水合肼浓度的线性关系图；
【图3】本发明实施中荧光检测试剂对水合肼的选择性图；【图4】本发明实施中荧光检测试剂在hela细胞内荧光共聚焦成像图。
具体实施方式
13.以下实施方式旨在进一步阐释说明本发明而不是对本发明的限定。
14.实施例1化合物1的合成将邻羟基苯甲醛(272.30 mg, 2 mmol) 和dcm-cho (552.57 mg，2 mmol)溶解于18 ml无水乙醇中，加入四氢吡咯0.07 ml（71.12 mg，1 mmol）为催化剂，将反应体系置于室温下搅拌，tlc监测至反应完全，可见大量红色固体析出。抽滤并用无水乙醇洗涤三次，干燥后，可获得化合物1 605.83 mg，产率为76.8 %。
15.目标分子探针的合成及结构表征将化合物1（394.42 mg，1 mmol）和乙酰丙酸（232.23 mg，2 mmol）溶于18 ml的无水二氯甲烷，加入edc（383.4 mg，2 mmol）和dmap（24.43 mg，0.2 mmol）作为缩合剂和催化剂。将反应体系在室温下搅拌，tlc监测至反应完全。减压除去溶剂后柱层析纯化，可得目标分子探针404.38 mg，产率为82.1 %。1h nmr (400 mhz, dmso-d6) δ 8.22 (d, j=7.9 hz, 1h), 8.08-8.06 (m, 2h), 7.89 (d, j=7.8 hz, 1h), 7.72-7.70 (m, 2h), 7.59 (d, j=14.6 hz, 1h), 7.56-7.55 (m, 2h), 7.47 (t, j=8.2 hz, 1h), 7.33 (d, j=7.6 hz, 4h), 6.85-6.81 (m, 2h), 6.37 (s, 1h), 2.72-2.70 (m, 4h), 2.13 (s, 3h). hrms (m/z): [m h]
calcd for : 493.5187, found: 493.4924.实施例2荧光检测试剂母液和水合肼母液的制备取实施例1制备的荧光探针化合物小心转移于50 ml的容量瓶中，室温下加入ch3cn，充分摇匀使之完全溶解，最后定容至刻度线，得到1 mm的荧光检测试剂母液。在测试过程中，每次用微量进样器量取20 μl的上述溶液，将其溶于测试体系中，并保证每次测试总体积为2 ml，此时测试体系中荧光检测试剂的浓度为10 μm。水合肼用pbs缓冲溶液配制成5 ml不同的浓度梯度（0.1 mm、0.2 mm、0.4 mm、0.7 mm、1.0 mm、1.5 mm、2.0 mm、3.0 mm、4.0 mm、5.0 mm）的母液。其余测试需要使用的小分子和无机盐则分别用pbs缓冲溶液配制成浓度为3 mm的母液。
[0016]
实施例3荧光检测试剂的荧光强度与水合肼浓度的变化取50 μl浓度为1 mm的荧光检测试剂母液溶解在pbs缓冲溶液和乙腈溶液各3450 μl和1450 μl的混合溶液中，然后移取50 μl的不同浓度的水合肼母液于体系中，使得最终整个检测体系探针的浓度为10 μm，而水合肼的浓度则分别为1 μm、2 μm、4 μm、7 μm、10 μm、15 μm、20 μm、30 μm、40 μm、50 μm。在室温下孵育20 min充分响应后，在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱。荧光发射光谱变化图见附图1。结果表明，随着水合肼浓度的增加，体系在682 nm处荧光强度逐渐增强。图2为实施例1制得的荧光检测试剂荧光强度变化与水合肼浓度的关系线性图，从图2中可以得出，在0-7 μm范围内呈良好的线性关系，线性方程为y=22.41343x 26.421，线性相关系数为：0.99454，并计算出检测限 (lod)为0.32 μm (s/n＝
3)，表明该荧光检测试剂具有良好的灵敏度。
[0017]
实施例4荧光检测试剂与不同物质反应后的荧光光谱取50 μl浓度为1 mm的荧光检测试剂母液溶解在pbs缓冲溶液和乙腈溶液各3450 μl和1450 μl的混合溶液中，然后移取50 μl的浓度为2 mm的水合肼母液以及3 mm的naclo、nacn、nahso3、na2s、na2so4、nabr、zncl2、nai母液分别加入检测体系中，使得最终整个检测体系探针的浓度为10 μm，而水合肼的浓度为20 μm，而naclo、nacn、nahso3、na2s、na2so4、nabr、zncl2、nai的浓度为30 μm。在室温下孵育20 min充分响应后，在10 mm 的比色皿中测试不同体系的荧光光谱，计算其在682 nm处的相对荧光强度值，以682 nm处相对应荧光强度为纵坐标，得到探针对不同物质的响应柱状图，结果如图3所示。结果表明，只有水合肼对检测试剂有较高的响应性。
[0018]
实施例5在hela培养基中加入10 μm的荧光检测试剂溶液，置于 37 o
c，5 %的co2下在培养箱中孵育30分钟后，用0.1 m的pbs 缓冲液（10 mm，ph=7.4）洗涤三次，除去未进入细胞的探针分子，然后更换培养基，再由水合肼缓冲溶液（25 μm）培养30分钟，用0.1 m的pbs 缓冲液（10 mm，ph=7.4）洗涤三次，置于荧光显微镜下观察其荧光变化，结果如附图4所示。实验表明进入细胞体内的探针分子和水合肼反应，发出强烈的红色荧光，因此该荧光检测试剂对细胞中的水合肼有良好的成像作用，可用于检测生物体内的水合肼。
[0019]
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，本领域的相关技术人员能从发明公开的内容不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。