一种王不留行黄酮苷在制备治疗脓毒症的药物中的应用

1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种王不留行黄酮苷在制备治疗脓毒症的药物中的应用。


背景技术：

2.脓毒症(sepsis)是一种由感染引起的全身炎症反应综合征，是全球范围内导致死亡的原因之一。在脓毒症患者中，危重患者占很大一部分。在高收入国家中，每年每1000人中3-10人会患有脓毒症。据统计，约11％的icu患者会发展为脓毒症，但脓毒症的治疗策略尚无统一的规范。目前常用的治疗策略包括液体复苏、抗感染治疗、糖皮质激素的应用和血液透析等，但仍有争议。尽管医疗条件不断改善，脓毒症死亡率仍达到在25-30％，当病人存在休克时死亡率甚至会达到40％，脓毒症及其相关疾病严重影响了人民的生命健康。
3.脓毒症的发病特征是宿主对感染产生的不受调节的严重全身炎症反应，同时伴随着多器官功能障碍(例如肺、肾、肝和血管)。目前，大量研究表明炎症因子和炎症趋化因子的产生在脓毒症疾病进程中起着关键作用。核因子的激活的b细胞的κ-轻链增强(nf-κb)是调控炎症相关基因重要的转录因子，在炎症因子瀑布级联反应中起到重要的调节作用，激活的nf-κb入核促进il-6、tnf-α、mcp-1等基因的转录和合成，最终导致组织器官炎症性损伤。
4.fk506结合蛋白51(fkbp51，也称作fkbp5)属于免疫嗜素fkbp家族，fkbp5能够与ikkα结合，并在调节nf-κb信号途径中起着关键作用。已有研究表明抑制fkbp5可通过nf-κb信号影响心血管疾病的发生。
5.王不留行是石竹科植物麦蓝菜vaccaria segetalis(neck.)garcke的干燥成熟种子，其主要成分为三萜皂苷、环肽、黄酮类、氨基酸及多糖等成分。王不留行黄酮苷(vaccarin，va)是一种天然的类黄酮苷，是中药王不留行的主要活性成分。有研究证明va具有活血通经、下乳消肿、利尿通淋等功能，但目前尚未见到va在防治脓毒症方面的报道。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种王不留行黄酮苷在制备治疗脓毒症的药物中的应用，所述药物对脓毒症有良好治疗作用。
7.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
8.本发明提出一种王不留行黄酮苷在制备治疗脓毒症的药物中的应用，所述王不留行黄酮苷的结构如下所示：
[0009][0010]
根据本发明实施例的王不留行黄酮苷在制备治疗脓毒症的药物中的应用，至少具有如下有益效果：王不留行黄酮苷用于制备治疗脓毒症药物，证明其能够降低细胞炎症因子的表达及分泌水平，抑制细胞fkbp5/nf-κb炎症信号通路；还能够降低感染脓毒症动物血清炎症因子il-1β、il-6、tnf-α和趋化因子mcp-1表达水平，改善感染脓毒症动物肾脏组织和肺组织病理，抑制肾脏组织中p-p65、nlrp3和c-caspase-1等nf-κb信号通路相关蛋白的表达，降低肾脏组织血清中肌酐、尿素氮水平，改善肺部炎症，提高了感染脓毒症动物存活率，对脓毒症具有潜在的治疗效果。
[0011]
在本发明中，脓毒症还包括脓毒症相关疾病，如内毒素血症(endotoxemia)、严重脓毒症(severe sepsis)和脓毒性休克(septic shock)等。都属于由革兰氏阴性菌导致全身性感染，进而引发的全身多脏器功能障碍等症状，其致病原因和治疗方法具有相似性。
[0012]
优选的，所述治疗脓毒症的药物为能够降低细胞炎症因子的表达及分泌水平的药物。
[0013]
优选的，所述炎症因子包括il-1β、il-6和tnf-α。
[0014]
优选的，所述治疗脓毒症的药物为能够抑制细胞fkbp5/nf-κb炎症信号通路的药物。
[0015]
优选的，所述nf-κb信号包括p65亚基的磷酸化、nlrp3和c-caspase-1。
[0016]
优选的，所述治疗脓毒症的药物为能够提高感染脓毒症动物存活率的药物。
[0017]
优选的，所述治疗脓毒症的药物为能够降低感染脓毒症动物血清炎症因子、改善感染脓毒症动物肾脏组织和肺组织病理的药物。
[0018]
优选的，所述治疗脓毒症的药物为能够抑制感染脓毒症动物肾脏组织和肺组织中炎症因子和趋化因子表达水平的药物。
[0019]
优选的，所述炎症因子包括il-1β、il-6、tnf-α，所述趋化因子包括mcp-1。
[0020]
优选的，所述治疗脓毒症的药物为能够降低感染脓毒症动物肾脏组织血清中肌酐、尿素氮的药物。
[0021]
优选的，所述治疗脓毒症的药物为能够抑制感染脓毒症动物肾脏组织中p-p65、nlrp3和c-caspase-1等nf-κb信号通路表达的药物。
[0022]
优选的，所述治疗脓毒症的药物为能够改善感染脓毒症动物肺水肿的药物。
[0023]
优选的，所述治疗脓毒症的药物还包括药学上可接受的载体或辅料。例如制备成口服给药制剂：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸剂、口服剂等；制备成直肠给药制剂：栓剂、灌肠剂；制备成注射给药制剂：肌肉注射制剂、静脉注射制剂等。
[0024]
本发明的优点在于：
[0025]
1.本技术王不留行黄酮苷用于制备治疗脓毒症药物，证明其能够降低细胞炎症因
子的表达及分泌水平，抑制细胞fkbp5/nf-κb炎症信号通路。
[0026]
2.本技术王不留行黄酮苷用于制备治疗脓毒症药物，还能够降低感染脓毒症动物血清炎症因子il-1β、il-6、tnf-α和趋化因子mcp-1表达水平，改善感染脓毒症动物肾脏组织和肺组织病理，抑制肾脏组织中p-p65、nlrp3和c-caspase-1等nf-κb信号通路表达。
[0027]
3.本技术王不留行黄酮苷用于制备治疗脓毒症药物，还能够降低肾脏组织血清中肌酐、尿素氮水平，改善肺水肿，提高了感染脓毒症动物存活率，对脓毒症具有潜在的治疗效果。
附图说明
[0028]
图1为本技术实施例1中不同浓度va对raw264.7细胞活力的影响图；
[0029]
图2为本技术实施例2中采用real-time pcr测定va对lps诱导raw264.7细胞炎症反应变化图；
[0030]
图3为本技术实施例2中采用elisa试剂盒测定va对lps诱导raw264.7细胞炎症反应变化图；
[0031]
图4为本技术实施例3中采用western blot方法测定不同培养组raw264.7细胞的nf-κb炎症信号通路图；
[0032]
图5为本技术实施例4中va对lps模型和clp模型小鼠存活率的影响图；
[0033]
图6为本技术实施例5中va对lps模型小鼠血清炎症因子水平的影响图；
[0034]
图7为本技术实施例5中va对clp模型小鼠血清炎症因子水平的影响图；
[0035]
图8为本技术实施例6中va对lps模型和clp模型小鼠血清中尿素氮水平的影响图；
[0036]
图9为本技术实施例6中va对lps模型和clp模型小鼠血清中肌酐水平的影响图；
[0037]
图10为本技术实施例6中采用real-time pcr测定va对lps模型小鼠肾脏组织中炎症因子和趋化因子的mrna表达水平的影响图；
[0038]
图11为本技术实施例6中采用real-time pcr测定va对clp模型小鼠肾脏组织中炎症因子和趋化因子的mrna表达水平的影响图；
[0039]
图12为本技术实施例7中采用苏木素伊红(h&e)染色试剂盒对小鼠肾脏组织染色结果图；
[0040]
图13为本技术实施例7中lps模型、clp模型小鼠肾小管损伤评分图；
[0041]
图14为本技术实施例8中采用western blot方法测定lps模型小鼠肾脏组织的nf-κb炎症信号通路图；
[0042]
图15为本技术实施例8中采用western blot方法测定clp模型小鼠肾脏组织的nf-κb症信号通路图；
[0043]
图16为本技术实施例9中采用real-time pcr测定va对lps模型小鼠肺组织中炎症因子和趋化因子的mrna表达水平的影响图；
[0044]
图17为本技术实施例9中采用real-time pcr测定va对clp模型小鼠肺组织中炎症因子和趋化因子的mrna表达水平的影响图；
[0045]
图18为本技术实施例10中采用苏木素伊红(h&e)染色试剂盒对小鼠肺组织染色结果图；
[0046]
图19为本技术实施例10中lps模型、clp模型小鼠肺组织炎症评分图；
[0047]
图20为本技术实施例11中va对lps模型和clp模型小鼠肺干湿重比的影响图；
[0048]
图21为本技术实施例12中通过分子对接技术预测va与fkbp5的结合模式图；
[0049]
图22为本技术实施例12中va与fkbp5的结合进行细胞热转移实验结果图。
具体实施方式
[0050]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0051]
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0052]
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
[0053]
以下实施例中使用的化合物为王不留行黄酮苷(va)，其结构为：
[0054]
购买自大连美仑生物技术有限公司。
[0055]
实施例1：研究va浓度对体外细胞活力的影响
[0056]
以raw264.7细胞构建体外细胞模型，用含有不同浓度va的培养基培养raw264.7细胞，并采用mtt比色法检测细胞存活和生长状况，以此判断细胞活力。其中，va的浓度为0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200、400μm，检测结果如图1所示。从图1可以看出，当va的浓度为0-400μm时，va对raw264.7细胞未见明显毒性。
[0057]
实施例2：研究va对lps(脂多糖)诱导体外细胞炎症反应的影响
[0058]
将raw264.7细胞放入不同试验组的培养基培养，培养基按如下分组：正常对照组(nc)、va高剂量组(va 100μm)、lps模型组(lps 1μg/ml)、lps模型 va低剂量组(lps 1μg/ml va 25μm)、lps模型 va中剂量组(lps 1μg/ml va 50μm)、lps模型 va高剂量组(lps 1μg/ml va 100μm)。
[0059]
培养24h后收取raw264.7细胞上清液，提取上清液中的rna，并采用实时荧光定量pcr法(real-time pcr)测定上清液中il-1β、il-6、tnf-α等炎症因子mrna的表达水平，测定结果如图2所示(图2a、2b、2c分别对应il-1β、il-6、tnf-α)。从图2可以看出，va显著降低了lps诱导体外细胞il-1β、il-6、tnf-α等炎症因子mrna的表达水平。
[0060]
采用elisa试剂盒对正常对照组(nc)、va高剂量组(va 100μm)、lps模型组(lps 1μg/ml)、lps模型 va高剂量组(lps 1μg/ml va 100μm)培养的raw264.7细胞上清液中炎症因子的分泌进行测定，测定结果如图3所示(图3a、3b、3c分别对应il-1β、il-6、tnf-α)。从图3可以看出，va明显抑制了lps诱导的细胞上清液中il-1β、il-6、tnf-α等炎症因子的分泌。
[0061]
实施例3：研究va对lps诱导体外细胞炎症反应信号通路nf-κb信号的影响
[0062]
采用western blot方法对正常对照组(nc)、va高剂量组(va 100μm)、lps模型组(lps 1μg/ml)、lps模型 va高剂量组(lps 1μg/ml va 100μm)培养的raw264.7细胞的p-p65、p65、nlrp3、c-caspase-1、β-actin等nf-κb炎症信号通路进行测定，并以p-p65/p65、nlrp3、c-caspase-1为横坐标，相对蛋白表达水平为纵坐标，得到不同试验组nf-κb炎症信号通路蛋白的表达水平，测定结果如图4所示，表明va显著抑制了lps诱导的细胞nf-κb炎症信号通路蛋白的表达。
[0063]
实施例4：研究va对lps模型和clp模型(盲肠结扎穿刺)小鼠存活率的影响
[0064]
构建lps模型：将小鼠随机分为生理盐水组(saline)、lps组、lps va组，每组10只。其中，saline组、lps组、lps va组的小鼠分别注射生理盐水、7mg/kg的lps、7mg/kg的lps 25mg/kg的va。
[0065]
构建clp模型：将小鼠随机分为sham组、clp组、clp va组，每组10只。其中，sham组小鼠只进行假手术，clp组小鼠接受盲肠结扎和穿刺手术，clp va组小鼠接受盲肠结扎和穿刺手术并给予25mg/kg的va进行药物治疗。
[0066]
每隔12小时观察lps模型和clp模型小鼠的存活情况，直至持续96小时，结果如图5所示(图5a、5b分别对应lps模型、clp模型)。从图5a可以看出，lps和clp导致小鼠感染脓毒症，lps组小鼠48小时的存活率不到50％，而lps va组小鼠48小时的存活率稳定在90％左右。从图5b可以看出，clp组小鼠72小时的存活率为0％，而clp va组小鼠72小时的存活率稳定在50％左右。表明va显著提升了lps模型和clp模型小鼠的存活率。
[0067]
实施例5：研究va对lps模型和clp模型小鼠血清炎症因子水平的影响
[0068]
构建lps模型：将小鼠随机分为生理盐水组(saline)、va组、lps组、lps va组，每组8只。其中，saline组、va组、lps组、lps va组的小鼠分别注射生理盐水、25mg/kg的va、7mg/kg的lps、7mg/kg的lps 25mg/kg的va。
[0069]
构建clp模型：将小鼠随机分为sham组、va组、clp组、clp va组，每组8只。其中，sham组小鼠只进行假手术，va组小鼠进行假手术并给予25mg/kg的va进行药物治疗，clp组小鼠接受盲肠结扎和穿刺手术，clp va组小鼠接受盲肠结扎和穿刺手术并给予25mg/kg的va进行药物治疗。
[0070]
对小鼠进行上述操作24小时后，麻醉小鼠，并收集血液获得血清。采用elisa试剂盒分别对lps模型和clp模型的小鼠血清炎症因子水平进行测定，lps模型的测定结果如图6(图6a、6b、6c分别对应il-1β、il-6、tnf-α)，clp模型的测定结果如图7所示(图7a、7b、7c分别对应il-1β、il-6、tnf-α)。从图中可以看出，va显著降低了lps模型和clp模型小鼠血清炎症因子水平。
[0071]
实施例6：研究va对lps模型和clp模型小鼠肾功能损伤的影响
[0072]
实施例5对小鼠建立lps模型、clp模型24小时后，麻醉小鼠，并收集肾脏组织。
[0073]
①
对lps模型、clp模型小鼠肾脏组织血清中尿素氮水平(bun)进行测定，测定具体操作流程为：按照表1向各试验组的试管中加入相应含量的组分，混匀，置沸水中准确水浴15min，立即用自来水冷却；于波长520nm，1cm光径，双蒸水调零，测定各管od值。
[0074]
表1各试验组的试管中加入组分及其含量
[0075][0076]
【注】：10mmol/l标准品为10mmol/l尿素氮，折算为280.1mg/l。
[0077]
lps模型、clp模型小鼠肾脏组织血清中尿素氮水平(bun)测定结果如图8所示(图8a、8b分别对应lps模型、clp模型)。从图8可以看出，va显著降低了lps模型和clp模型小鼠肾脏组织血清中尿素氮水平。
[0078]
②
对lps模型、clp模型小鼠肾脏组织血清中肌酐水平(cre)进行测定，测定具体操作流程为：按照表2向各试验组的试管中加入相应含量的样本、标准品(浓度为442μmol/l)、双蒸水、酶溶液a，37℃孵育5min后，在546nm波长测定吸光度a1；测定后再向上述试管中分别加入等量酶溶液b，37℃孵育5min，546nm波长测定吸光度a2。
[0079]
肌酐含量的计算公式如下：
[0080]
肌酐含量(μmol/l)＝[(测定a2—k*测定a1)—(空白a2—k*空白a1)]/[(标准a2—k*标准a1)—(空白a2—k*空白a1)]*标准品浓度(442μmol/l)
[0081]
其中，稀释因子k＝(加样量 酶溶液a体积)/(加样量 酶溶液a体积 酶溶液b体积)＝186/246。
[0082]
表2各试验组的试管中加入组分及其含量
1、β-actin等nf-κb炎症信号通路进行测定，并以p-p65/p65、nlrp3、c-caspase-1为横坐标，相对蛋白表达水平为纵坐标，得到不同试验组nf-κb炎症信号通路的蛋白表达水平，测定结果如图14、图15所示。从图14、图15可以看出，va能够抑制lps模型和clp模型小鼠肾脏组织中p-p65，nlrp3和c-caspase-1等nf-κb炎症信号通路蛋白的表达。
[0091]
实施例9：研究va对lps模型和clp模型小鼠肺组织中炎症因子和趋化因子mrna表达水平的影响
[0092]
实施例5对小鼠建立lps模型、clp模型24小时后，麻醉小鼠，并收集肺组织。采用实时荧光定量pcr法(real-time pcr)对肺组织中炎症因子il-1β、il-6、tnf-α以及趋化因子mcp-1的mrna表达水平进行测定。lps模型的测定结果如图16所示(图16a、16b、16c、16d分别对应il-1β、il-6、tnf-α、mcp-1)；clp模型的测定结果如图17所示(图17a、17b、17c、17d分别对应il-1β、il-6、tnf-α、mcp-1)。
[0093]
从图16、图17可以看出，va能够显著抑制lps模型、clp模型小鼠肺组织中炎症因子il-1β、il-6、tnf-α以及趋化因子mcp-1的mrna表达水平。
[0094]
实施例10：研究va对lps模型和clp模型小鼠肺组织病理的影响
[0095]
实施例5对小鼠建立lps模型、clp模型24小时后，麻醉小鼠，并收集肺组织。采用苏木素伊红(h&e)染色试剂盒对小鼠肺组织进行染色，染色结果如图18所示(图18a、18b分别对应lps模型、clp模型)；并观察lps模型、clp模型小鼠肺部组织病理，结果如图19所示(图19a、19b分别对应lps模型、clp模型)。从图18、图19可以看出，clp组和lps组小鼠肺损伤显著升高，而clp va组、lps va组小鼠肺损伤明显降低，表明va对脓毒症小鼠肺组织病理有明显改善作用。
[0096]
实施例11：研究va对lps模型和clp模型小鼠肺水肿的影响
[0097]
实施例5对小鼠建立lps模型、clp模型24小时后，麻醉小鼠，并收集肺组织。对lps模型、clp模型小鼠的肺干湿重比进行测定，结果如图20所示(图20a、20b分别对应lps模型、clp模型)。从图20可以看出，clp va组、lps va组小鼠肺干湿重比低于clp组和lps组，表明va对脓毒症小鼠肺水肿有明显的改善作用。
[0098]
实施例12：研究va和fkbp5的结合模式
[0099]
采用分子对接服务(molecular docking)的方法将fkbp5的活性区域与va进行分子对接，并预测其可能的结合模式，结果如图21所示。具体操作是以fkbp5与配体共晶id为7awf作为模板，通过分子模拟软件discovery studio 2018的cdocker模块建立了va和fkbp5的结合模式。如图21所示，va的羟基与fkbp5的多个氨基酸残基(tyr57、asp68、ser70、val86与lys88)形成氢键相互作用，同时，与黄酮母核苯基相连的五碳糖部分还占据了蛋白的疏水区域(由ile122，gly59和phe130形成)，从而使得va牢牢占据fkbp5的活性位点。
[0100]
将经va处理后的fkbp5在42、47、52、57和62℃的温度下进行细胞热转移实验(cetsa)，结果如图22所示。从图22可以看出，经va处理后的fkbp5在52、57和62℃的温度下的稳定性显著提高。表明va可能直接与fkbp5蛋白结合来发挥抗炎保护作用。
[0101]
综上所述，经实验证明，va在脓毒症疾病中可发挥重要的抗炎作用，且对脓毒症所致的组织器官的损伤具有明显的保护作用。因此，该药物有望成为脓毒症防治的关键药物。
[0102]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施
例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。