一种胸窗萤SSR分子标记及其引物组合和应用的制作方法

一种胸窗萤ssr分子标记及其引物组合和应用
技术领域
本发明涉及dna分子标记技术领域，具体涉及胸窗萤ssr分子标记，尤其涉及一种胸窗萤ssr分子标记及其引物组合和应用。


背景技术：

简单重复序列(ssrs，simplesequencerepeats)，又叫做微卫星位点(microsatellites)，是由1～6bp的重复单元串联重复而成的序列(sharmaetal.2007)。它们在原核、真核基因组中广泛分布，在基因编码区及非编码区都能找到(lietal.2004)。作为分子标记，ssr有许多优点：在整个基因组中分布广泛、均匀且数量充足，因而多态性很高；ssr标记呈孟德尔共显性遗传，可以区分纯合、杂合基因型；pcr扩增仅需要少量dna，且对dna的质量要求不高。近年来还发现ssr在基因组中可能发挥着一些功能，例如影响基因调控、基因组系统组成等。因此从基因组水平上了解ssr的分布是非常重要的。传统获得ssr标记的方法需通过建立、筛选基因组文库、克隆测序、引物设计等一系列实验，耗费许多人力、物力。而现在，随着基因组测序越来越便捷，由基因组数据中直接开发ssr标记的方法也被运用得越来越多。胸窗萤(pyrocoelia pectoralis olivier)普遍分布于中国湖北省，幼虫陆生。成虫性二型，雌萤翅退化，体型较雄萤大。雌虫能与不同雄虫多次交配，形成一雌多雄的交配格局。胸窗萤生活史存在一年生(以卵越冬，生活史一年)和二年生(以10.67％越冬幼虫发育形成的，生活史二年)，是目前在萤火虫的研究中特殊的一个物种。通过研究胸窗萤的ssr分子标记技术，可以用于萤火虫子代父权、遗传多样性、群体遗传学及种质进行鉴定分析，同时可被用于萤科昆虫的性选择及进化研究，以及胸窗萤的人工饲养、复育及保护的评估，然而，到目前为止，尚没有萤火虫ssr分子标记开发的相关报道。


技术实现要素：

本发明提供的一种胸窗萤ssr分子标记及其引物组合和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。为了实现上述技术目的，本发明主要采用以下技术方案：一种胸窗萤ssr分子标记，包括13组ssr分子标记中的一种或多种，所述13组ssr分子标记编号分别为：ssr308、ssr311、ssr313、ssr319、ssr320、ssr323、ssr324、ssr325、ssr405、ssr406、ssr501、ssr503、ssr504；且所述13组ssr分子标记位点的核苷酸序列如seq id no.1～13所示。具体的，ssr308由seq id no.1所示的核苷酸序列组成，seq id no.1的核苷酸序列为：atttcaaatctcaaactttattgttttcaaaataaaaatgatacaaaatctaactgcaaataggaatttcagaccaaatcgattatttttgttacaacaataacactatttttttttatttttgttgctttttcgaagtcattt
cactccacacgttcctctatttaaaaaggttcaactgacggaaggacggaaaaaccatccgattcttttgaaatcgaggatagcataatatattttgaaaaatggaacaaaccatttccatataggtacatagatatattaattgaaaaatgaaaactaaagtacctactcaccgttttcaattaagactcgataataatcgtcaaagcggaacttcaaactaaacattaatttcaaaaattactgaggatgtaataaaacatcttactgttactgcgttcaataataataataataataataattagtgttatatcattaaaaacaagtgcaagtggaggtaatcatgttttatagatacttattcaaaaaataaactgaaaaaaaactccaatcgttaaaagaatcgctacctttacctggtttcattaaaggcaaaataacttgtttggtgacgttaagtcaaggtgaccgtattagcttcgttggtattcgtaaacattgaattaattatcttacgtaattacgtttacgttattgaataaagttcgtaaataataatgacgtctttgaaaatattagatttctcagaaaaaagacgttttatatagcgaaaaactgtataagactgcgaaacgtcgttcgtccattttgtttcgtacctacgccaaaatggcggtatatgcatttatctcctaattaatatttaataaaaactgtttactggagtgaaatgatttttaagtatgtgtcaaagtacacctttgataagatgctaatgcaagatggattataggtaggtata；ssr311由seq id no.2所示的核苷酸序列组成，seq id no.2的核苷酸序列为：ttcaagtgtgcttatacaatctgccaaattcatactacagaacagtaataataatattaatattatttagtgatattaatacgcgtagtgtttacattcgacgctataacattgtatctaatatttggcaatactttaaggcttttgttagtccaataaaattgtaaaacatttattttcaaaattgttcagtattaatgtaattaagccgtttatggcgccaatactggaaaaataacgcagaaaaccgtgttgttggattgattgcagtcgtctaagctttaatagtattttctggaaaggataaattaatagaaatgatgcagttttttgttataaattgtattataaccatgactaatttcaatcctttgcaaatatcttcttgtatgctgaacaaatggttgaaaggaaaaactgtgctaaattttaaaaacgtatttgtgaattttattttgtgtcatactacagtagtttgttatgacttatgagatgacagtaataataataataataataataataataataataatgaaaccttcacagtagacgttgagcaaataacctttaacatacaaaacattagattctcatagcaaccggcgttattgctcattataattgtacctctgacattgagagttgataattacgcaacattgcaaaaatgaggaatatataggaaaagtgactttgaaattaataattatgtatatatattctaaattgaaaatggccgtggttgctcaaatacatacttaccttgtatattcaaatttctaaggtgtctctgaattgttaacgataattttaaattctttgctgctttaaatctatggctttatttagctcaaatgcctgtggtaactcctctaataactgcgagactcatcagaagagtaacgtttgttttactataactgaaacatcaccaacatagacaaataattttatattatacacattacaattgtttactattttcattacgtggatactttaaacatattgcttaagtggtagatggccttg；ssr313由seq id no.3所示的核苷酸序列组成，seq id no.3的核苷酸序列为：ctaaatacacattgatgtggtttgagggaagaaaatgatattggatggaccgaatggggatgcaaattcagaacacgatagacgaaacggaggagaagtaatgatcatgggcgatgtaaatggtagggtagaaaatcatcagtttaaacagaaaaatatacactagataacatgggaaaaagaaggaaaaatcaatgatacactactttctgatagacaaataagtgcatatggaggagtatggaagacgtaccaccacttattaaaagctagagtgatactagataagagagtgaaagagaaagaaacaaaaatgaaaaaaataagaagctataaattgaagaaataccaagaactagaaaactaataaaaacagtcgtcgacttgtgctacgacgacaaggcaaacagagcattatcaggattaaaggcatagtaagggaaaaagaggaaatacttaaagatgagaggcgagtacgaaagaaaatctcgaccaaaatgaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaagaggaaaacgttatcatgggagaaattcgaggaaagacgaaaataaaaaaaaagcttccagggaaacaagagcaataagggaaaagtattgacggagatgatcgaagcaaacatttcgtaaggatctctctttttttaagttgtgattaatattgatatcggcatttataacaattttttttctttcaggcacactcgggacaaatataacgttacagtgcctttacaaatcaactggaagcgaatgtgattcaccatcagttacttataacgtgaccatgtgcagattatgccaagaaaatttgtgtaaccattcggtaattcccaaccaattcatatcatatcagctgacttgtt
tttatatttttacaatgttaattaagttgataagtttttattttttgtaaaactttatcactatttttattgtaagtataataagtgcgattacgtagtaaatttattgtatagccaatgtacgtaaattatcaaataaataa；ssr319由seq id no.4所示的核苷酸序列组成，seq id no.4的核苷酸序列为：cttaaaagctcggttttccctatcgaggcaatatgtttggcctataaacagaaattatttaagctaaaatattacatgggactattgggtactcccaaaaacatacgtgtagtaagtgtgacacaaattaatcaacacgtgcagatgtcactaatgtcaaaacgattcttcaggaagtaatccgcagaggagcccgaccctatttaaacacaaacttttaaagatcgcctcgaagatattcaaggtgaaaaagtgccttctctataaattccattgcgcaagggcctctagcattgattcaagttccttgggtccaccttgcataaaaatatattttcgaatacgttcatttgttattttccatttggtcaatgaaatacgatctaattatgaaattagatgcattagttacgccagacagtgtgacatcgtgtaaagtttcatttgggttagtttaggcccacgacctacaactgtgtgtcttaacacctctattaaatattattattattattattattattattattattattataccgaaaatttccaacacaagtaggagttaatcgagattaattaaactggggcgtgtttgcagaaatctcgagttatttttaattaatattaatcttgtttgtttcacttgtgtccatagtttaaagattaatgtatttgtaaaattggaatttatttacttttacgtcttggtctgtatctccacttcttgcgtgggccagtacactttggtccttatttatttccaccggctccaaaaacagctcctgtagatacaactaccgcagtaatcgatgaccagctgtttgtatcacaaataaggcttattgatgtgccattaaccgtttttattgtattttatttttgtttgcttaataaggaatttattattattattatcattgacggttaaaagcaaatgtatgttcaaaataggaacattcgcttccttgcaaagcggaataatctctgcagcacttgtgcaccaggatattacagtaatttcaatcacaaaaagaa；ssr320由seq id no.5所示的核苷酸序列组成，seq id no.5的核苷酸序列为：ttttattcgtatagtagatgtcactattataatattctacaaatttaaataaaattaccgcctggatatacgcattcacattttttcctaaaataatataattgtatgtttacggtgctatttaacatttacatatttttatcaaggttgttagttacagttcaatatacctactgataatttcttaaatcccaaagtcccccttctatacctactaataaagtaatgtttgtgttggaataataaatttacacacggaaatgtaaactttaaatagtgtcgtacgaccatgatttttcatgttggacgatatgtaaatattaaactttattggcatctaaaaaattcaaaattgtcatagcataaattataaaggagaaagtaattataaagttaaaaatttgaccaaagatattcgtatcacgtttttgcgcatgaaacaaaatttctaactgtaatccgcgactgttttgttgtagtcaaaaatattaatattgatataataataataataataataataataataataataatgaaatttaatcatgtgaagcagaaggtacaatacattcgtccatacttacctacttacagaaccactacgaattataataatactatactaacttagaatatactttttttccacggtacttatgattaaatacagagaggtgcggtagagtcaatccttcaccaatttactacttccaattaaatgtgttcattgtgtatgtactaaatttagtgaaattactcgtttttattatttattagttacttacggagttccacaaagtaaattcaaagaacattaataaaactgtgcttactttacagacagttatgagacaaaaaaaatatttaaaaatgaagatgacttaccagtcaacaattcgatgtttgttagtttctcgtagaaaggtgttgtgagaacgtctgagcgatttatatatttaaatttgattatacatatattaggtatacacattattgtatttcctgtcccattaattgtttttcgcaaacttt；ssr323由seq id no.6所示的核苷酸序列组成，seq id no.6的核苷酸序列为：actagagtcactgtagggattactaataaaactttactgccagcagttttgtttgtgcgagcgtcaaagatggacactagcaaagagaaaatacgccatattttacagtttttcttggttaaaggagaaaactggtggtggattctgcattacgataggagggtggacatagtccacgcgtacataggcctcaaattcgggtcctgactagggccgtccgaccccgccacgtcactcaagccattccacacttgaaatgaacctgaggatccagccatcacgtgcaattttggtttcgtcgattccgttccggtaaattcagatgcaccgattgaaggtcgattgtcgataacatcatgaaaattgccgagttcgaccgtcgtgtaaacactgtttcgattgcccaaaaaaccgtttggtatagtgttccatcaggacagggcactca
catcgatagtaactcgccagaagctctgggaggttcttatgcatccaccttataataataataataataataataataataataataataataatagatttattgcccaacagaaaaaatttccaattaacggacattcagctgcaaaaaagtaaggttaagtacttatatatacaacttaataaagtacaaaggcggatccaaggagggtcaagattatatataaacaatagtgattgcgatgtccaccgaatgtggtagagagtgatagatcctaatcatgctgagtcgaataggcgaggtgcttagcatgttggtatgaggtgcaggatgataaaaagttcgatggtgtcgttatacaggataactaataagtgataataactcagtacaatcaattaagttattcaacagtttgtacagaaacgtaacagatattttcctacgcctagaccctaataatatgaaattaaaacgaggcagcaataactgatggtcaaatcctctgggaggataaatagagtcagcattatacagtagatattttaaaaatgtacgctgcactatctcaagtttgtctatctggtttctttgcg；ssr324由seq id no.7所示的核苷酸序列组成，seq id no.7的核苷酸序列为：atcatgtacgtactttcggttactctctgttatttccctctacttcctaatatttccttacacttccctataattgtacgttaaagttgtttaaataaaacattaaacaatgttgtttaaataaaattaatatttgtcaagaaactcaaacacgagagacattttataataagaaatataaactatgatatcttcacagagtacctatttgataattccatatgtaccatatgtgtaaaatagagtatatctcaacccacttcttatcttttgtttattttagttaattaggcatcgttaaaaaaattgtttttcattgtgttactttggttctgatggatcacgctgagttagaaatacacgtgttacagttgcacttatgtttgtgagcttcaagcgatgcaacacaggtatgtgctttggcttgtgacgttaagagtcttaacttttgtttacgctttttatgtagatattttactaactgcttatataatattactattattattattattattattattattattattattttggaagtgattttaaagtgtaaggctcttaactttttctctttttattcgtcagtattattgaaatctattaatttttttaaggacgaccttgaaagcttcagacattccagtgcaagagatttggctgcattagcatccgaacttgcaaaaagtgaagaggaaaggcgccacttaacagatttagttaccgtactaagacagagaagtttgtcgaattctgaagagaatagtcaagaaaatgctgaattgaaactgctagagcagagacttgaggaagcccatttacatttagccgatattaaaacatcgtggagtgataaaattgcttctttagaaactcaggtataatattcattgatattgcactatttgtgatcagtaacatgttcttaggttggtagattgagccgacaagccgcagaagaaagtgcggaaaggagaagagcggtacaagagaaaggtgtattgtccgaaaaggtaaaacaaatggagtgcg；ssr325由seq id no.8所示的核苷酸序列组成，seq id no.8的核苷酸序列为：tgcaaaagtgagctatttatactaggtaggtacttaaagtggaagtggcataactagtttataaattctgataagactaaaggacctgaatcatcagcatttactacagaaagcgtttcttgttgagaatttctaaactttcataacagtcaagtttccttcttattattaactatttgcgtaataactaaagaaatttttaatatgtagggtaacggcagatttatcccaagaattgtacctatttgaggtgagccaagtgctccttgaaacaaattttgaatgatcttttagtttgcccaatatacactcggttacagtttttacaatcggttttatatattccgaacttatcgttcatatctactgggcctttaggattacctaaaagcttttgtaaactacattctgaagttgtgaccgtttgcacattttcattgcgctttttagcaccttcaactgaggacttttgtaaaggttgtgtaatgggaaagcaaacaataataataataataataataataataataataataataataataaactgtgaacaatttgaataggtattggccagagtgggcgaagtatgtaaagccaaatctcaaatcttattctcaaagaaactctgtttcaaagatttatttttattttttattttacctttttaaacattaaaaatataaattttcatttatgtttttgttgctaatgttactagatttttttaatttttggttttgtttagagaacacaaaattatttcttattgcaaatgtagttctcaaatgggaataaaacattctgtttttaaataataaaattatttgagcgacaaatgcatttattttattatcccctatcttcgtaataacaacagatagtttttgaaccacttttggcaaaattagataattcatgtaatagagggttaagactaagagacacaaatgcatttgttgacattgtgacaaatgtgggaataaaattcaaataattaaacgaaaaccaataaagaacttgataaatattcacatgatgacc；ssr405由seq id no.9所示的核苷酸序列组成，seq id no.9的核苷酸序列为：
tttttcttttcttccaatttcattcctcttcttttcatttcttctcccccttctcttctccttaatctcgacgttttggcgcatgagttttacataattttcttcctttgtccattcttctacttcttcacatatcgttctccttttatttactgcaaacggtgaggctctgacttgacactgtatttttttccattctataaacctctgctattttcttttacttcttcccatttctttctctttcttttcctgctcctctttatcttaatctgatgtccatataatcatatttatttatttatttatttatttatttcttcttttgtccgtccctttctgtctttcgccttttcttattctgttcccattatattccttttctttttatttcttctccttcttttcttaaacatcattacaccaacgcgtaagactttgagttcag；ssr406由seq id no.10所示的核苷酸序列组成，seq id no.10的核苷酸序列为：atctagaattcgcaattactataactagttgatgactttgtcttaaacataagcgtaaatttattctgaaacaaggtatattcctaccgaattacgtgactccgtaggtacctttcatttatgcctataaatttttcgttaatttcttagagaaattaacaaaaacacgacatacttttttagcgaaattaaaacaaatttcttgaatggacggacctagtttgagtgaaactgtcattcacaaccataagtttatgacattattaacaatgtaattgagcgtgagaaagtcatgcaaaaaaataaataaataaataaattatacaccttatggttaaaatcgacctttcacaatcatcaaaatatcaaagtaggtattaacagcgttcaaggatagaaattttgtagagcgtcg；ssr501由seq id no.11所示的核苷酸序列组成，seq id no.11的核苷酸序列为：cctacgcctaacacaactcctgcaagagctcccccagaatacgaaatcctgctagaaaatgcaccctactccatccgttaacatctgttagctcagcgcggaaaacaaatacataaccaacagattactgcctatgccatttcttttccagagttagcagaaaaccgcccaaccagtcacctgaaaacactgaattataattcagtgcctgaaacccactttccaaccacctatttgcaacgatgcgaacgatgatgaccacagcaatgataaggacaacgattaaacatatttctatttataggtacatatctcaaaaactttattttgttttttttgtaaataacttattaccatgtacatccaaaaataataatgtaactactaacataaaacaaccggcgtgggctgaagaggataataatcctgagcagtccaaacaacacttaggtactaacccaaaatgaattgtaaatactccttataataataaacatttttgaattgaattgaattgaattgaattgaattgaagttaggtgtaaagtaaacgtttttaacccgaattctcactatgtgccaaataagacgttgacagtgaatccacgtccttcgccacctccacaaggagcaattctagaggtttttggttttcctaaaacaatacaactctgtcgacgtttttgttttcaagattacttaagataacaggttaagataacatataagttttacaaagaatcgtttcacctcttttttggatatgagagttaatactgttactaacgtaagtaatgaacttataaaagactgtatatgtagttagacactaaatgttcatcatggcgtaattccaacgaaacaactaaatcagatttttttgttaaagtaacaagaagaaagacatttttgcgtgaagtgaaaagtaagatacgaaacagactgattaaaaattaaatcctcgttagtttgca；ssr503由seq id no.12所示的核苷酸序列组成，seq id no.12的核苷酸序列为：cagacgccacttccttcatagtgactttgacttaaacgacataattagctggaattgtgaaatcgaaagctgtcgatcagaatataatagtggattgtatattttttaatttacttaccaactttccgcttcaaattgttaaaaacgaaatgtagtaaatagaatggagggggagaatgttttaatactcaaattttacctctcacggcaaaatttgaaaattaagatattcttcctctttcattactggaaccgatgcactaaaattacaactaaaaatgtccaatatttcttattatattttggaaaacatttgtatctaaagattcatcgatcttctccgtattaatcaattagataataataataatttaaattgtaatgtttggacacagtagtaacactacatttcaatttaaatcagacatgggaggctagttagtaacttcaggaatgagcatatatcgaacgtaagagagaagactatattcaatgaaggtacaatacaatacaatacaatacaatacaaaatacaatacaaaatacaatacaaaatacaatacaaaatacaatacaatacagtacagtacagtacagtacagtacagtacagtacaatacaatacaatacaatacaacaatacaacaatacaatacaatacaacaatacaacaatacaatacaatacaatacaacaataagtgttaacaaagtattcgatttctacaacaatacaatttattttcccccatatatttcaccaaccacctttgttctctccaacacctccttcgtccaatccttctcttccccctttcccctagtatat
gccgcctttttctcctgtccctccgcagttcttcacacttcaccgtcatatgctgccaactttgatacccttccctgcacaacctgcaccttcttgctccctccagtacttattcccattttcctcatttccacatctaaaccgtgctatcattcctttcacctactgtactacagtgtagtacaggttttgaagttcaacaacataatagaaacgccccaaggtaatctacataacagttacccaactgccgtcaggcagaagacacgaaataacgttaagccgcatagaggaacaagaagcagaccg；ssr504由seq id no.13所示的核苷酸序列组成，seq id no.13的核苷酸序列为：cgagttaacagagaaaaactatatggtcgatttatgaaagaaagagtatatttgacccatgtactcatggcaatataaagtttatgtaaatgtcaaaaggaaaacgaaccccaaagaggtgtctcttaataaagaaggatttggggaaaattacgacatgaaaatatctaaaaacaaaacaaaagtacacaataacaacaaaaactgatattcaccataagatcttaaagcagatagttgaactatctgggatgcagcatctcttaatgaacaaaacagagacatacaaaggattgatcaaagggccatatgcaaaaccttatggagctgggctaaaaccaggccgtaaaaaaacctatgccatttgatagatctttttgcatagactaaaagtgctgctggcgacaaagctcgatttcatttacttaggtgacttcagcctccaaagttatcattatacattatattatattatattatattatacattattattattattattatccattgatttcagattatacatagatacatgttccattataaaataaaacaatatcaatgtaatttctatggaatgtaatagtaataagatgtttaaaatatatttttttctttttaacatgatttttgcttagaccattgtatttgaaacatatttgggtattaccattgggtaaataatgttaatggtattacgtaataaaatatgtaaagtataatgcctcctagatgtttgctataatacaaatgataactttggaggccgaaaagtcacctaagcaaatgaaatcgagctttgccgcctacttctaatctacgcaaaaagatctatcaaatggcatcggtctctttacggcctggtcttagtccagctcaaataaggcctttggacgtacgtgtagaactttcaaccgaaatttaagaaagaaaacacaccaaaaattccatgagcgtagcagttcgcactcttatgggtggtaactggtaaatgagagaaaa。本发明还提供了用于扩增上述胸窗萤ssr分子标记位点的引物组合，所述ssr分子标记的正向引物组合的核苷酸序列如seq id no.14～26所示，反向引物组合的核苷酸序列如seq id no.27～39所示。具体的：
其中，优选的，所述ssr分子标记的引物组合设计的条件如下：以被检测到的ssr上下游100bp侧翼序列进行引物设计，引物长度为20bp～28bp；退火温度为60℃～65℃；且每组引物的正向引物组合与反向引物组合之间的退火温度差的最大值为1℃；扩增序列时，核心单位包含3-5个碱基的串联重复。优选的，引物长度为25bp；退火温度为63℃。本发明还提供了一种胸窗萤ssr分子标记的获得方法，包括以下步骤：s1胸窗萤基因组dna的提取和检测；
s2对胸窗萤的基因组dna样本进行pcr扩增：反应体系为：ddh2o,5.28μl；dntp,0.8μl；buffer,1μl；mg
2
,0.8μl；bsa,0.2μl；primer forward,0.2μl；primer reverse,0.2μl；taq,0.2μl；dna模板,1μl；pcr扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec；60℃退火30sec，72℃延伸30sec；8个循环，每循环降1℃；然后94℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸30sec；27个循环；72℃延伸5min；4℃保存，得到pcr产物。本发明的另一个目的是提供了胸窗萤ssr分子标记在萤火虫遗传分析或人工饲养中的应用。同时，本发明还提供了胸窗萤ssr分子标记位点的引物组合在萤火虫遗传分析或人工饲养中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：通过胸窗萤ssr分子标记，建立技术体系，弥补了胸窗萤特异性分子标记的空白，可以用于萤火虫子代父权、遗传多样性、群体遗传学及种质进行鉴定分析，结果可被用于萤科昆虫的性选择及进化研究，以及胸窗萤的人工饲养、复育及保护的评估。
附图说明
图1为13个ssr分子标记pcr扩增结果电泳图；图2为不同交配次数亲子关系分布百分比的线箱图，其中，星号表示最大值和最小值，线体上边缘和下边缘表示内限和外限，箱体上边缘和下边缘分别表示上四分位数和下四分位数，箱体中线表示中位数，箱体中黑点表示平均值；其中，a为一只雌虫与两只雄虫交配；b为一只雌虫与三只雄虫交配。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。实施例11、胸窗萤全基因组ssr分析及引物设计将胸窗萤基因组从头测序，拼装得到的scaffold文件作为输入文件，利用misa进行全基因组ssr扫描,运用primer3，以被检测到的ssr上下游100bp侧翼序列进行引物设计。引物设计的条件如下：最适长度24bp；最短长度20bp；最长长度28bp；最适退火温度63℃；最低退火温度60℃；最高退火温度65℃；一对引物退火温度差的最大值为1℃。分析了ssr位点数量和类型,之后设计开发可用于不同雄性父权鉴定的高效ssr引物。考虑到保守性和稳定性,申请人主要用的是三碱基、四碱基及五碱基重复8～15次的微卫星。共设计了44对鉴定ssr的引物2、胸窗萤基因组dna的提取和检测取胸窗萤标本(约0.1克)，置于1.5ml的离心管中，采用改进过的ctab法提取基因
组dna：1( )向上述加入标本的离心管中加入少许石英砂，再加入250μl的2
×
ctab裂解液，用研磨棒进行充分研磨，直至呈匀浆状，再加入600μl的2
×
ctab裂解液，颠倒混匀。(2)将装有研磨充分标本液的离心管置于65℃水浴1小时(其间每10分钟翻转离心管1次)。(3)加入苯酚和氯仿各300μl，翻转离心管几次，13000rpm离心10分钟。(4)收集上层水相，转至新的1.5ml离心管中。(5)重复(3)
–
(4)步2至3次，直至两相界面上无沉淀为止。(6)加入等体积的氯仿抽提一次，收集上层水相。(7)加入0.5
–
1倍体积预冷的异丙醇(或2倍体积的无水乙醇)，4℃下13000rpm离心10分钟。(8)小心倒去上清液，将离心管扣压在干净的面巾纸上，吸干残留的上清液。(9)加入1ml预冷的75％乙醇，翻转离心管几次，13000rpm离心10分钟，弃除上清液，重复两次。(10)置于室温或真空系统中干燥。(11)加入50μl无菌水室温溶解，于-20℃保存备用。
11.电泳检测基因组dna的提取情况：将提取的dna样品与10
×
loadingbuffer(已加溴酚蓝)按10:1混合上样于1％的琼脂糖凝胶，于150v电压下电泳10分钟，并于紫外灯下检测。3、ssr片段的pcr扩增反应对60只雄成虫基因组dna样本进行pcr扩增,反应体系为：ddh2o,5.28μl；dntp,0.8μl；buffer,1μl；mg
2
,0.8μl；bsa,0.2μl；primer forward,0.2μl；primer reverse,0.2μl；taq,0.2μl；dna模板,1μl；pcr扩增条件为pcr扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30sec；60℃退火30sec，72℃延伸30sec；8个循环，每循环降1℃；然后94℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸30sec；27个循环(根据每个座位情况对其进行调整)；72℃延伸5min；4℃保存，pcr产物加5ul loading buffer,pcr仪器上94℃变性5min,点样于4300电泳槽上,琼脂糖凝胶电泳1.5-2h。电泳完成后根据胶图统计每个座位每个样品的多态性数据。挑选number of different alleles》4的ssr位点进行多态性评估。以60只不同雄性亲本dna为模板进行pcr扩增和筛选,根据电泳结果选择特异性好、胶图带型漂亮,易分辨、群体多态性好,等位基因多且分散的引物扩增结果,最终选择了本发明公开的13对ssr引物，用于雄性个体父权研究，如图1所示。该13对ssr引物如下所示：
4、基于ssr数据的遗传多样性分析使用遗传分析软件genalex【peakall,r.and smouse p.e.(2006)genalex 6:genetic analysis in excel.population genetic software for teaching and research.molecular ecology notes.6,288-295.】计算不同等位基因的数量(n),有效等位基因数(ne),shannon's信息指数(i)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he),无偏期望杂合度(uhe),平均多态信息含量(pic),并进行哈代-温伯格平衡卡方检验。从结果看，在本研究的60个个体中，每个ssr等位基因数在4到34之间，平均为
13.692
±
2.052。观察到的杂合性水平(ho)从0.400到0.900，平均值为0.718
±
0.047.期望杂合度he从0.594到0.940,平均值为0.862
±
0.028.ho是群体中每个位点杂合子个体的实际比例，而he是每个hwe估计的期望值。ho和he是估计群体遗传多样性最广泛使用的参数之一。个体成员组成结构甚至种群进化信息可以从ho和he处获得。当ho＝he时，这意味着种群是随机交配的。当ho《he时，这意味着人口正在近亲繁殖。当ho》he时，这意味着人口正在异交。13个位点的ho均小于he，这可能是由于采集的胸窗萤来源地均为湖北武汉，而胸窗萤雌虫无翅，活动能力较弱，因此导致了种群数量较小，种群中存在近交和漂变。多态性信息含量(power of information content，pic)是衡量ssr标记遗传变异相对能力的指标。标记基因型多态性越高，pic值越高【pan,y.-b.highly polymorphic microsatellite dna markers for sugarcane germplasm evaluation and variety identity testing.sugar tech.8,246
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256(2006).】.pic》0.50表明多态性标记信息量大，0.50》pic》0.25表明信息量适中，pic《0.25表明信息量较小。检测结果表明pic水平在0.516至0.937之间，平均值为0.845
±
0.119.表明开发的13个ssr标记多态性标记信息量大。有三个ssr位点不符合哈温平衡(p《0.01)【rodriguez,s.,gaunt,t.r.&day,i.n.hardy-weinberg equilibrium testing of biological ascertainment for mendelian randomization studies.am.j.epidemiol.169,505
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514(2009).】,分别是ssr loci:ssr325、ssr406和ssr503.hwe描述，在理想条件下，不存在突变、自然选择、个体进出、种群无限大、种群内随机交配。因此，基因频率不会随时间或世代而改变。然而，总会有一个或多个干扰因素(例如遗传漂变、自然选择、突变、基因流动、种群瓶颈、创始人效应和近亲繁殖)影响自然界中的基因频率【masel,j.rethinking hardy-weinberg and genetic drift in undergraduate biology.bioessays 34,701
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710(2012).】.因此，hwe在本质上很难实现。在本研究中，13个标记中有3个位点偏离hwet平衡。上述参数结果表明，选择的13个ssr位点的多态性强，在胸窗萤雄虫个体中是高度可变的。实施例2胸窗萤子代父权鉴定挑选体长为24.20
±
2.78mm,体宽为7.27
±
0.59mm,体重为0.34
±
0.09g的雌虫,以及体长为17.73
±
1.35mm,体宽为6.78
±
0.59mm,体重为0.07
±
0.02g的雄虫进行交配,选取一只雌萤和2只雄萤交配(n＝16),另一组设计为一只雌萤和3只雄萤交配(n＝9),并产卵孵化为幼虫,分别收集每只雌虫和对应交配雄虫以及所有成功孵化的子代幼虫,进行ssr分析,利用荧光标记的pcr引物对多个微卫星多态位点进行扩增，然后采用高分辨率胶电泳对扩增片断进行分离，通过荧光检测系统(licor 4300)确定扩增片断的长度，实现对微卫星多态位点的分型。利用软件cervus3.0【kalinowski s t,taper m l,marshall t c.revising how the computer program cervus accommodates genotyping error increases success in paternity assignment[j].molecular ecology,2007,16(5):1099-1106.】根据基因的分离定律和自由组合定律进行父权鉴定和计算，统计每一个雄虫后代的比例，结果如图2所示。结果表明当雌虫与两只雄虫交配后,第二只雄性父权(the second male patriarchy)的均值为0.4618
±
0.0824(n＝16,检测子代萤火虫个数1346只)；第一只和第
二只之间无显著差异,当雌虫与三只雄虫交配后,p1(第一只雄性父权the second male patriarchy)均值为0.1459
±
0.0677,p2均值为0.2530
±
0.0986,p3(第三只雄性父权the second male patriarchy)均值为0.6012
±
0.1013(n＝9,检测子代萤火虫个数656只),第一只、第二只以及第三只之间存在显著差异(p《0.05)。上述结果表明,交配次数对父权分配影响显著,在交配次数中,交配两次对父权分配的影响不显著；交配三次对父权分配的影响显著,最后交配的雄萤父权所占比例最大。上述结果主要是由于胸窗萤最后交配的雄萤通过将精液注入雌萤储精囊,挤压排除之前交配雄萤精子的方式,完成精子竞争行为所导致，且ssr的结果验证了上述推测。通过上述结果，有助于理解萤科昆虫的交配后性选择及进化,也可以为改进胸窗萤的人工饲养、复育及保护提供基础理论依据。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。