一种利用生物发酵增质剂定向促进雪茄烟糖分转化的方法

1.本发明涉及雪茄烟技术领域，具体涉及一种利用生物发酵增质剂定向促进雪茄烟糖分转化的方法。


背景技术：

2.雪茄烟是一种以晾晒烟为原料、纯手工卷制的特殊烟草制品，经过原料预处理、发酵、卷制及醇养技术处理，具有香气馥郁、吸味丰满、劲头大、有害成分含量低等特点。其中，雪茄烟制备技术中的发酵过程是改善雪茄烟叶外观特征、物理特性、内在成分、吸食品质的重要工序，对雪茄烟原料品质提升具有至关重要的作用，是雪茄烟生产的技术核心。发酵过程被认为是氧化作用、无机催化剂催化作用、微生物和酶作用三者相互影响、共同作用的结果。发酵过程可以导致烟叶中的糖类、蛋白质等大分子物质进一步降解产生有机酸、挥发性羰基化合物等香气前体物质，进而改善烟叶的香气成分和评吸质量，同时去除烟叶含中的青杂气和土杂气，降低刺激性，使烟气细腻，增强烟叶弹性和燃烧性；雪茄烟叶发酵后，烟叶的总氮、还原糖、蛋白质、烟碱、淀粉、多酚、总氨基酸和类胡萝卜素含量等均出现不同幅度的下降，烟叶品质得到提升，可用性加强。
3.研究表明促进糖类转化有利于雪茄烟的增香提质，烟叶内的还原糖(主要为果糖和葡萄糖等)与氨基酸发生的拉美德反应是烟叶致香物质重要来源。因此，在发酵过程中，淀粉降解及糖分转化程度显著影响烟叶品质。在雪茄烟发酵过程中，淀粉降解与糖分转化的路径主要分为：淀粉在叶绿体内降解为麦芽糖，麦芽糖在细胞质内转化为蔗糖，蔗糖在液泡内转化为葡萄糖和果糖。其具体途径如图1所示。
4.实际过程中，可以通过人为控制发酵环境(如温度、湿度等)，控制烟叶细胞活性，从而促进糖分转化。促进雪茄烟大分子糖分降解和转化以及小分子香气物质的合成和积累是雪茄烟发酵的关键技术，然而，目前雪茄烟发酵质量和水平还需进一步提高。


技术实现要素：

5.鉴于目前存在的上述不足，本发明提供一种利用生物发酵增质剂定向促进雪茄烟糖分转化的方法，具有绿色环保、高效、作用时间短、选择性强、安全性高等优点。
6.为了达到上述目的，本发明提供一种利用生物发酵增质剂定向促进雪茄烟糖分转化的方法，包括以下步骤：
7.驯化完全适应烟叶环境且主产淀粉酶的枯草芽孢、巨大芽孢杆菌和酵母菌，得到优势促进糖分转化菌群；
8.将酶制剂与优势促进糖分转化菌群进行混合，制得生物发酵增质剂；
9.将生物发酵增质剂喷洒于雪茄烟叶表面进行发酵。
10.依照本发明的一个方面，所述酶制剂为食品级α-淀粉酶和蛋白酶。
11.依照本发明的一个方面，所述驯化过程为：将雪茄烟与pbs缓冲液充分混合、震荡、灭菌滤纸过滤、收集后，用芽孢杆菌培养基和酵母菌培养基进行传代培养分离。
12.依照本发明的一个方面，所述驯化完全适应烟叶环境且主产淀粉酶的枯草芽孢、巨大芽孢杆菌和酵母菌，得到优势促进糖分转化菌群的过程中，所述优势促进糖分转化菌群是通过菌株进行葡萄糖产酸和淀粉水解实验筛选出来的。
13.依照本发明的一个方面，所述发酵过程是在人工气候箱中进行的。
14.依照本发明的一个方面，所述芽孢杆菌培养基含有葡萄糖、硝酸钙、硫酸铵、氯化钾、七水硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、酵母提取物和琼脂。
15.依照本发明的一个方面，所述酵母菌含有酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖。
16.依照本发明的一个方面，所述喷洒方式为分批喷洒方式。
17.本发明的实施优点：
18.(1)绿色环保：本发明为雪茄烟生物发酵增质剂，其以生物菌剂为主体，酶制剂做辅助，减少物理化学方法施用，降低成本的同时，保证生产过程绿色环保；
19.(2)作用时间短、高效：本发明考虑生物产品作用时间长的问题，加入酶制剂促进雪茄烟生物发酵增质剂的作用效率，减少雪茄烟发酵过程的作用时间，且保证作用效果；
20.(3)选择性极强：本发明旨在提升雪茄烟发酵过程的糖分降解及转化，筛选针对淀粉降解及葡萄糖产酸菌株，结合淀粉酶和蛋白酶的施用，促进雪茄烟发酵过程的拉美德反应，促进糖分降解及转化为香气物质，提升雪茄烟品质；
21.(4)安全性高：采用具有生物安全性的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酵母菌，加入食品级α-淀粉酶和蛋白酶，降低施用风险，具有生物安全性。
附图说明
22.图1为本发明所述的雪茄烟发酵过程中淀粉降解与糖分转化的转化图。
具体实施方式
23.为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1
25.在本发明实施例中，本发明的具体步骤为：
26.(1)雪茄烟2.0g与灭菌pbs缓冲液100ml在20℃、170r/min条件下震荡120min，灭菌滤纸过滤后，12000rpm收集后用不同培养基进行传代培养分离；其中芽孢杆菌培养基：葡萄糖10g/l，硝酸钙5g/l，硫酸铵0.5g/l，氯化钾0.2g/l，七水硫酸镁0.1g/l，硫酸锰0.0001g/l，硫酸亚铁0.0001g/l，酵母提取物0.5g/l，琼脂20g/l，ph 7.0
±
0.2(25℃)；酵母菌培养基：酵母提取物10g/l，蛋白陈20g/l，葡萄糖20g/l。
27.(2)对筛选菌株进行葡萄糖产酸和淀粉水解实验，其菌株的生理生化特征如表1所示：
28.表1.菌株生理生化特征
[0029][0030]
(3)选择xj-3、xj-6和xj-7作为雪茄烟发酵增质剂的生物菌群对象，并对其进行生理生化及形态学鉴定：
[0031]
xj-3：革兰氏阳性菌，细胞宽度小于0.9μm，菌落表面粗糙不透明，呈污白色，液体培养基中可形成皱醭，vp反应呈阳性，鉴定为枯草芽孢杆菌(2
×
108cfu/ml)；
[0032]
xj-6：革兰氏阳性菌，细胞宽度大于0.9μm，菌落表面略有光泽，浅黄白色转浅灰白色至浅灰褐色，vp反应呈阴性，鉴定为巨大芽孢杆菌(2
×
108cfu/ml)；
[0033]
xj-7：细胞宽度4μm左右，群落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，乳白色且边缘、中央部位颜色均一，鉴定为酵母菌(2
×
108cfu/ml)。
[0034]
将上述生物菌群和酶制剂进行混合制成生物发酵增质剂，其中，上述菌群体积依次为0.3l、0.3l、0.4l；酶制剂包括食品级α-淀粉酶(4000u/g)和蛋白酶(4000u/g)，食品级α-淀粉酶(4000u/g)为10g，蛋白酶(4000u/g)为10g。
[0035]
(4)优化发酵培养基：
[0036]
通过单因素实验，确定功能菌株产淀粉酶效果最优的培养基配比为：玉米粉35g/l，豆粕30g/l，麸皮4g/l，烟草添加物10g/l，k2hpo
4 2g/l，mgso
4 0.6g/l，kcl 0.6g/l。
[0037]
(5)将雪茄烟生物发酵增质剂喷洒于雪茄烟叶表面，每吨雪茄烟叶喷洒生物发酵增质剂3l，采用分批施加方式，在50℃、相对湿度65％的人工气候箱中发酵开始时均匀喷洒2l，发酵一周后喷洒1l，共发酵18天后结束。
[0038]
性能测试：
[0039]
按照上述方法将雪茄烟生物发酵增质剂喷洒于雪茄烟叶表面，在50℃、相对湿度65％的人工气候箱中发酵18天，实施案例采用半叶法，以不接生物发酵增质剂的另一半叶作对照，发酵结束后分别测定施加雪茄烟生物发酵增质剂和不施加雪茄烟生物发酵增质剂烟叶的淀粉含量、总糖含量、拉美德反应产物、中性香气成分，结果如表2所示：
[0040]
表2.施用生物发酵增质剂雪茄烟成分变化
[0041][0042]
由本实施案例和上表可知，在雪茄烟发酵过程中施加生物发酵增质剂，降低烟叶淀粉含量可行，同时总糖含量增加，挥发性致香成分结果显示，中性香气组分中美拉德反应产物、挥发性致香成分含量增加，类胡萝卜素降解产物增加，有利于雪茄烟叶自身香气质和香气量的改善。
[0043]
实施例2
[0044]
将生物菌群按照实施例1的方式进行驯化和筛选，将筛选出的生物菌群和酶制剂进行混合制成生物发酵增质剂t1和t2，其中t1生物发酵增质剂的组成为：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酵母菌菌群体积依次为0.3l、0.3l、0.4l；酶制剂包括食品级α-淀粉酶(4000u/g)和蛋白酶(4000u/g)，食品级α-淀粉酶(4000u/g)为5g，蛋白酶(4000u/g)为15g。t2生物发酵增质剂的组成为：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酵母菌菌群体积依次为0.3l、0.3l、0.4l；酶制剂包括食品级α-淀粉酶(4000u/g)和蛋白酶(4000u/g)，食品级α-淀粉酶(4000u/g)为15g，蛋白酶(4000u/g)为5g。将雪茄烟生物发酵增质剂喷洒于雪茄烟叶表面，每吨雪茄烟叶喷洒生物发酵增质剂3l，采用分批施加方式，在50℃、相对湿度65％的人工气候箱中发酵开始时均匀喷洒2l，发酵一周后喷洒1l，共发酵18天后结束。
[0045]
按照上述方法将雪茄烟生物发酵增质剂喷洒于雪茄烟叶表面，在50℃、相对湿度65％的人工气候箱中发酵18天，实施案例采用半叶法，以不接生物发酵增质剂的另一半叶作对照，发酵结束后分别测定施加雪茄烟生物发酵增质剂和不施加雪茄烟生物发酵增质剂烟叶的淀粉含量、总糖含量、拉美德反应产物、中性香气成分，结果如表3所示：
[0046]
表3.施用生物发酵增质剂雪茄烟成分变化
[0047][0048]
由本实施案例和上表可知，施加t1、t2雪茄烟生物发酵增质剂均可促使雪茄烟叶淀粉含量降低、总糖含量增加、致香成分增加，增加α-淀粉酶含量尤其促进淀粉和总糖含量变化，苯甲醇、苯乙醇变化较小，依然有利于雪茄烟叶自身香气质和量的提升。
[0049]
实施例3
[0050]
将生物菌群按照实施例1的方式进行驯化和筛选，将筛选出的生物菌群和酶制剂进行混合制成生物发酵增质剂t3和t4，其中t3生物发酵增质剂的组成为：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酵母菌菌群体积依次为0.2l、0.4l、0.4l；酶制剂包括食品级α-淀粉酶(4000u/g)和蛋白酶(4000u/g)，食品级α-淀粉酶(4000u/g)为10g，蛋白酶(4000u/g)为10g。t4生物发酵增质剂的组成为：枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酵母菌菌群体积依次为0.4l、0.2l、0.4l；酶制剂包括食品级α-淀粉酶(4000u/g)和蛋白酶(4000u/g)，食品级α-淀粉酶(4000u/g)为10g，蛋白酶(4000u/g)为10g。将雪茄烟生物发酵增质剂喷洒于雪茄烟叶表面，每吨雪茄烟叶喷洒生物发酵增质剂3l，采用分批施加方式，在50℃、相对湿度65％的人工气候箱中发酵开始时均匀喷洒2l，发酵一周后喷洒1l，共发酵18天后结束。
[0051]
按照上述方法将雪茄烟生物发酵增质剂喷洒于雪茄烟叶表面，在50℃、相对湿度65％的人工气候箱中发酵18天，实施案例采用半叶法，以不接生物发酵增质剂的另一半叶作对照，发酵结束后分别测定施加雪茄烟生物发酵增质剂和不施加雪茄烟生物发酵增质剂烟叶的淀粉含量、总糖含量、拉美德反应产物、中性香气成分，结果如表3所示：
[0052]
表3.施用生物发酵增质剂雪茄烟成分变化
[0053][0054]
由本实施案例和上表可知，施加t3、t4雪茄烟生物发酵增质剂均可促使雪茄烟叶淀粉含量降低、总糖含量增加、致香成分增加，对淀粉和总糖含量影响不大，但改变雪茄烟发酵增质剂中功能菌的组成，可影响致香物质产生，促进雪茄烟发酵进程，提升雪茄烟品质。
[0055]
本发明实施的优点：本发明为雪茄烟生物发酵增质剂，其以生物菌剂为主体，酶制剂做辅助，减少物理化学方法施用，降低成本的同时，保证生产过程绿色环保；本发明加入酶制剂促进雪茄烟生物发酵增质剂的作用效率，减少雪茄烟发酵过程的作用时间，且保证作用效果；本发明通过雪茄烟发酵过程的糖分降解及转化，筛选针对淀粉降解及葡萄糖产酸菌株，结合淀粉酶和蛋白酶的施用，促进雪茄烟发酵过程的拉美德反应，促进糖分降解及转化为香气物质，提升雪茄烟品质；用具有生物安全性的枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和酵母菌，加入食品级α-淀粉酶和蛋白酶，降低施用风险，具有生物安全性。
[0056]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。