用于可调节细胞定位的重组多肽的制作方法

用于可调节细胞定位的重组多肽
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月11日提交的美国临时专利申请号62/914,310的权益，该专利申请以引用的方式整体并入本文。


技术实现要素：

3.提供了重组多肽，其包含感兴趣的蛋白质、蛋白质定位标签和位于所述感兴趣的蛋白质与所述蛋白质定位标签之间的蛋白酶切割位点。在某些实施方案中，重组多肽还包含蛋白酶，其中所述蛋白酶切割位点是蛋白酶的切割位点。还提供了编码所述重组多肽的核酸、包含此类核酸的细胞以及包含此类细胞的组合物(例如，药物组合物)。还提供了调节感兴趣的蛋白质的细胞定位的方法和向有需要的个体施用基于可调节细胞的疗法的方法。
附图说明
4.图1：小图a：根据本公开的实施方案的重组多肽的示意性图示。重组多肽包含感兴趣的蛋白质、蛋白酶切割位点(“切割位点”)和蛋白质定位标签(在图1中称为“保留信号”)。在该实例中，感兴趣的蛋白质是嵌合抗原受体(car)。同样在该实例中，重组多肽还包含蛋白酶，其中所述蛋白酶切割位点是掺入重组多肽中的蛋白酶的切割位点。蛋白酶切割位点和蛋白质定位标签(以及如果存在的话，切割蛋白酶切割位点的蛋白酶)的组合有时在本文中被称为“stash标签”，因为重组构建体被设计成通过靶向穿梭进行细胞内存储(intracellular storage by targeted shuttling)。小图b：小图a中所示的重组多肽的car的可调节细胞定位的示意性图示。在该实例中，蛋白质定位标签是将重组多肽的定位导向er的内质网(er)定位标签。在不存在蛋白酶抑制剂(
“‑
药物”，左侧)的情况下，蛋白酶会切割蛋白酶切割位点，从而将er定位标签从car除去并且使得car在细胞表面上的表达(和活性)成为可能。在存在蛋白酶抑制剂(“ 药物”，右侧)的情况下，蛋白酶不会切割蛋白酶切割位点，因此er定位标签保持与car附接并且car保留在er处。
5.图2：在存在和不存在蛋白酶抑制剂的情况下，包含靶向内质网(er变体1、er变体2)、高尔基体(golgi)或溶酶体(lysosome)的不同蛋白质定位标签的car的细胞表面表达，如通过流式细胞术所确定。
6.图3：小图a：显示通过流式细胞术在存在( )或不存在(-)蛋白酶抑制剂(“药物”)的情况下测试的car分子在细胞表面上的定量的图。小图b：显示在与蛋白酶抑制剂一起孵育之后car表面表达随时间推移降低的图。
7.图4：小图a：根据本公开的实施方案的重组多肽的示意性图示。重组多肽包含car作为感兴趣的蛋白质和er定位标签(“er标签”)作为蛋白质定位标签。小图b：用定位于各种细胞区室的荧光标记蛋白标记的细胞的示意性图示。
8.图5：用图4中所示的重组多肽(包含er定位标签)转导并在不存在(-药物)或存在( 药物)蛋白酶抑制剂的情况下孵育的人293t细胞(衍生自hek 293细胞系)的荧光显微镜图像。
9.图6：小图a：定位于细胞表面或定位于细胞内的含有car和gfp的重组多肽及其对应的染色的示意性图示，其中“ ”表示阳性染色，并且
“‑”
表示阴性染色。小图b：已与蛋白酶抑制剂一起孵育不同时间量的表达重组多肽的细胞的流式细胞术数据的定量图。
10.图7：小图a：显示也表达b7h3抗原的表达gfp的d425髓母细胞瘤细胞的gfp荧光的图。在存在( 药物)或不存在(-药物)蛋白酶抑制剂的情况下，将肿瘤细胞与b7h3-car-stash t细胞一起共培养。小图b：显示从图7小图a中所述的共培养物中获取的共培养物上清液中的干扰素γ(ifnγ)水平的定量。
11.图8：包含膜蛋白(在该实例中，car)和er定位标签的本公开的重组多肽的示意性图示。左侧显示的是重组多肽还包含蛋白酶的构型-在本文中称为“顺式”构型。右侧显示的是其中重组多肽不包含蛋白酶并且其中提供的蛋白酶以足够接近重组多肽的切割位点的方式拴系到膜上，使得在不存在蛋白酶抑制剂的情况下蛋白酶会切割蛋白酶切割位点的构型-在本文中称为“反式”构型。在这两种构型中，对蛋白酶切割位点的切割导致car在细胞表面上表达并且不再保留在er处。
12.图9：包含分泌的效应蛋白(例如，细胞因子、趋化因子、生长因子等)和er定位标签的本公开的重组多肽的示意性图示。在该实例中，在蛋白酶切割(“ 药物”)之前，分泌的效应蛋白、蛋白酶切割位点和蛋白酶位于er内腔中。左侧显示的是其中重组多肽还包含蛋白酶的顺式构型。右侧显示的是其中重组多肽不包含蛋白酶并且其中提供的蛋白酶在er内腔侧以足够接近重组多肽的切割位点的方式拴系到膜上，使得在不存在蛋白酶抑制剂的情况下蛋白酶会切割蛋白酶切割位点的反式构型。在这两种构型中，对蛋白酶切割位点的切割导致效应分子在er内腔中变得可溶，然后分泌到细胞外间隙中。
具体实施方式
13.在更详细地描述本公开的重组多肽、方法和其他方面之前，应理解本公开的重组多肽、方法和其他方面不限于本文所述的具体示例性实施方案，因为这些当然可以变化。还应当理解，本文中所用的术语仅用于描述特定的示例性实施方案的目的，并且不旨在是限制性的，因为重组多肽、方法和其他方面的范围将仅由所附权利要求限制。
14.在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确说明，在该范围的上限与下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一)以及在该陈述范围内的任何其他陈述值或中间值都涵盖在重组多肽、方法和其他方面内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也涵盖在重组多肽、方法和其他方面内，在所陈述范围内受到任何特别排除的界限。在所陈述范围包括一个或两个界限的情况下，排除包括界限的范围的任一个或两个界限的范围也包括在重组多肽、方法和其他方面中。
15.本文提供了某些范围，其中数值前面出现术语“约”。术语“约”在本文用于为其后面出现的精确数字以及接近或靠近所述术语后面的数字的数提供文字性支持。在确定数字是否接近或靠近具体叙述的数字时，接近或靠近的未叙述的数字可以为这样的数字，其在出现的上下文中，提供具体叙述的数字的基本等同形式。
16.除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与重组多肽、方法和其他方面所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的重组多肽、方法和其他方面相似或等同的任何重组多肽、方法和其他方面也可以用于重组多肽、方法和其他方
面的实践或测试，但是现在描述代表性的说明性重组多肽、方法和其他方面。
17.本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每篇单独的出版物或专利被具体和单独地指出通过引用并入本文一样，并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的材料和/或方法。任何出版物的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认本发明的重组多肽、方法和其他方面无权先于此类出版物，因为所提供的公开日期可能不同于可能需要单独确认的实际公开日期。
18.应当指出的是，除非上下文另外清楚地指明，否则如本文中以及所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物。另外注意，权利要求可以撰写为排除任何可选的要素。因此，本声明旨在充当对于此类与权利要求要素的叙述相结合的排除性术语(如“单独地”、“仅”等)的使用或“否定型”限制的使用的先行基础。
19.应当理解，为了清楚起见在单独实施方案的上下文中所描述的重组多肽、方法和其他方面的某些特征也可以在单个实施方案中以组合提供。相反地，为了清楚起见在单个实施方案的上下文中所描述的重组多肽、方法和其他方面的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。实施方案的所有组合由本公开具体包括，并且在本文中公开，就好像每一个组合被单独和明确地公开，在这个意义上这种组合包括可操作的方法和/或组合物。此外，在描述此类变量的实施方案中所列出的所有子组合也被本发明的重组多肽、方法和其他方面具体地包括，并且在本文中公开，就像每个这样的子组合在本文中被单独地和明确地公开一样。
20.本领域技术人员在阅读本公开时将理解，本文描述和示例的每个单独实施方案具有离散的组件和特征，其可以容易地与任何其他几个实施方案的特征分离或组合而不脱离本方法的范围或精神。任何叙述的方法可以以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序进行。
21.重组多肽
22.本公开的方面包括重组多肽。重组多肽包含感兴趣的蛋白质、蛋白质定位标签和位于感兴趣的蛋白质与蛋白质定位标签之间的蛋白酶切割位点。根据一些实施方案，重组多肽从n末端到c末端包含：感兴趣的蛋白质、蛋白酶切割位点和蛋白质定位标签。在某些实施方案中，重组多肽从n末端到c末端包含：蛋白质定位标签；蛋白酶切割位点；和感兴趣的蛋白质。
23.如本文令人惊讶地证明的，重组多肽能够根据蛋白酶抑制剂的存在或不存在来对感兴趣的蛋白质进行可调节细胞定位。也就是说，在存在蛋白酶抑制剂的情况下，蛋白酶不会切割蛋白酶切割位点，使得蛋白质定位标签不从感兴趣的蛋白质上除去，并且感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签所确定的细胞区室中。在不存在蛋白酶抑制剂的情况下，蛋白酶会切割蛋白酶切割位点，从而将蛋白质定位标签从感兴趣的蛋白质上除去，并且在不存在蛋白质定位标签的情况下，使得感兴趣的蛋白质在其正常目的地的表达(和活性)成为可能。
24.重组多肽可用于各种研究和临床应用中。举例来说，在过继细胞疗法(act)的上下文中，重组多肽使得细胞表面上的受体(例如，嵌合抗原受体(car)、工程化t细胞受体(tcr)等)的条件定位能够调节表达所述受体的细胞的活性，从而提供用于预防或延迟由细胞表面上的受体的活性引起的细胞耗竭(例如，由car活性引起的t细胞耗竭)的开始的改进方
法，在不良副作用(例如，由不受限制的抗原驱动的细胞增殖引起的细胞因子释放综合征)和/或类似物的情况下关闭细胞活性。
25.这种可调节细胞定位的一个实例在图1小图b中示意性地示出。在该实例中，重组多肽包含嵌合抗原受体(car)作为感兴趣的蛋白质和内质网(er)定位标签(图1，小图a)。如图1小图b的左侧所示，在不存在蛋白酶抑制剂的情况下，car最初定位于er，并且在切割位点被蛋白酶切割后，car不再保留在er，而是在细胞表面上表达(从而变得有功能)。如图1小图b的右侧所示，在存在蛋白酶抑制剂的情况下，car保持与er定位标签缔合，因此保留在er上。
26.在某些实施方案中，多肽还包含蛋白酶(本文中称为“顺式”构型)，其中所述蛋白酶切割位点是相同蛋白酶的切割位点。根据一些实施方案，所述多肽不包含切割蛋白酶切割位点的蛋白酶，但是这种能够切割蛋白酶切割位点的蛋白酶作为单独的分子提供-在本文中称为“反式”构型。顺式和反式构型的非限制性实例示意性地示于图8和9中。可以采用的蛋白酶和蛋白酶切割位点的实例在下面更详细地描述。
27.本公开的多肽是重组的。术语“重组的”是指包含两个或更多个彼此异源的结构域(即，在自然界中不存在于单一多肽中的两个或更多个结构域)的多肽。
28.除了感兴趣的蛋白质、蛋白质定位标签、蛋白酶切割位点和如果呈顺式构型的话蛋白酶之外，重组多肽还可以包括结构域。例如，重组多肽可以包括在一个或多个蛋白质定位标签、蛋白酶切割位点和如果呈顺式构型的话蛋白酶之间的间隔区结构域(spacer domain)。在一些实施方案中，间隔区结构域包括接头、报告子结构域或它们的组合。报告子结构域的非限制性实例包括荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白)和生物发光蛋白。在某些实施方案中，重组多肽包括生物发光蛋白(其本身是生物发光的或催化生物发光的产生的蛋白质)，并且生物发光蛋白是荧光素酶，例如纳米荧光素酶(nanoluciferase)。根据一些实施方案，当重组多肽包括报告子结构域时，报告子结构域位于感兴趣的蛋白质与蛋白酶切割位点之间。
29.本公开的重组多肽可以包括可用于纯化的一个或多个结构域(例如，纯化标签，如flag标签、his标签和/或类似物)、可用于检测/成像感兴趣的蛋白质的结构域(例如，荧光素酶或能够直接或间接检测/成像(例如，体内成像)感兴趣的蛋白质的其他蛋白质元件)和/或类似物。主题多肽的各种结构域彼此有效地连接，这意味着此类结构域彼此连接并且保留它们各自的功能。
30.蛋白质定位标签
31.如本文所用，术语“蛋白质定位标签”是指将重组多肽(以及进而感兴趣的蛋白质)的细胞定位导向特定细胞区室的氨基酸序列。在某些实施方案中，蛋白质定位标签选自内质网(er)定位标签、高尔基体(golgi)定位标签、溶酶体定位标签、质膜定位标签、线粒体定位标签、过氧化物酶体定位标签、细胞溶质定位标签和核定位标签。
32.重组多肽可以包括用于将重组多肽的定位导向到所需的细胞区室中的任何合适的蛋白质定位标签。合适的蛋白质定位标签是已知的。在某些实施方案中，本公开的重组多肽包括locsigdb(可在genome.unmc.edu/locsigdb/获得和在negi等人(2015)database,第2015卷:1-7中所描述的蛋白质定位信号/标签数据库)dbsubloc(蛋白质亚细胞定位数据库
–
可在bioinfo.tsinghua.edu.cn/dbsubloc.html获得)；locate(可在
locate.imb.uq.edu.au获得的哺乳动物蛋白质亚细胞定位数据库)；locdb(可在rostlab.org/services/locdb获得的蛋白质定位数据库)；esldb(可在gpcr.biocomp.unibo.it/esldb获得的真核生物亚细胞定位数据库)；和/或任何其他方便的蛋白质定位标签数据库中的蛋白质定位标签。根据一些实施方案，蛋白质定位标签位于重组多肽的n末端。例如，存在用于ii型膜蛋白(参见例如，schutz等人(1994)embo j.13(7):1696-1705)和其他蛋白质的天然存在的n末端蛋白质定位标签。
33.根据一些实施方案，蛋白质定位标签是er定位标签。可以包含在本公开的重组多肽中的er定位标签的非限制性实例是与氨基酸序列lykyksrrsfidekkmp(seq id no:1)具有85％或更高、90％或更高或100％的氨基酸序列同一性的er定位标签。可以包含在本公开的重组多肽中的er定位标签的另一个实例是包含氨基酸序列kkmp(seq id no:2)的er定位标签。可以包含在本公开的重组多肽中的er定位标签的另外的实例包括与以下er定位标签之一具有85％或更高、90％或更高或100％的氨基酸序列同一性的er定位标签：aekdel(seq id no:3)；eqkliseedlkdel(seq id no:4)；ggggsggggskdel(seq id no:5)；ggggsggggsggggsggggskdel(seq id no:6)；ggggsggggsggggsggggsaekdel(seq id no:7)；kyksrrsfieekkmp(seq id no:8)；lkyksrrsfieekkmp(seq id no:9)；lykyksrrsfieekkmp(seq id no:10)；lyckyksrrsfieekkmp(seq id no:11)；lycnkyksrrsfieekkmp(seq id no:12)；lykyksrrsfidekkmp(seq id no:13)；lycnkyksrrsfidekkmp(seq id no:14)；lyeqkliseedlkyksrrsfieekkmp(seq id no:15)；lycypydvpdyakyksrrsfieekkmp(seq id no:16)；lykkletfkktn(seq id no:17)；lyeqkliseedlkkletfkktn(seq id no:18)；lyyqrl(seq id no:19)；lyeqkliseedlyqrl(seq id no:20)；lykrkiiafalegkrskvtrrpkasdyqrl(seq id no:21)；lyrnikcd(seq id no:22)；和lyeqkliseedlrnikcd(seq id no:23)。
34.在某些实施方案中，蛋白质定位标签是高尔基体定位标签。可以包含在本公开的重组多肽中的高尔基体定位标签的非限制性实例是包含氨基酸序列yqrl(seq id no:24)的高尔基体定位标签。
35.根据一些实施方案，蛋白质定位标签是溶酶体定位标签。可以包含在本公开的重组多肽中的溶酶体定位标签的非限制性实例是包含氨基酸序列kferq(seq id no:25)的溶酶体定位标签。
36.感兴趣的蛋白质
37.重组多肽可以包含各种感兴趣的蛋白质中的任何一种。在某些实施方案中，重组多肽包含工程化的感兴趣的蛋白质。“工程化的”是指感兴趣的蛋白质不具有天然/野生型对应物，例如由于感兴趣的蛋白质包含一个或多个异源结构域、工程化或合成的结构域(例如，在细胞表面分子(例如，细胞表面受体)的情况下工程化细胞外结合结构域等)和/或类似物。在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质是工程化的细胞表面受体。工程化细胞表面受体的非限制性实例包括嵌合受体(例如，嵌合抗原受体(car))、工程化t细胞受体(tcr)(例如，与对应的野生型tcr相比对抗原具有改变的(或“工程化的”)特异性和/或亲和力、具有一种或多种彼此共价或非共价结合(例如，融合)的多肽和/或类似物)、嵌合细胞因子受体(ccr)、嵌合趋化因子受体、合成的notch受体(synnotch)等。
38.在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质不是工程化的，即感兴趣的蛋白质具有天然/
野生型对应物。根据一些实施方案，非工程化的感兴趣的蛋白质是非工程化细胞表面受体。具有天然/野生型对应物的细胞表面受体的非限制性实例包括干细胞受体、免疫细胞受体(例如，t细胞受体、b细胞受体等)、生长因子受体、细胞因子受体、激素受体、受体酪氨酸激酶、免疫受体(如cd28、cd80、icos、ctla4、pd1、pd-l1、btla、hvem、cd27、4-1bb、4-1bbl、ox40、ox40l、dr3、gitr、cd30、slam、cd2、2b4、tim1、tim2、tim3、tigit、cd226、cd160、lag3、lair1、b7-1、b7-h1和b7-h3)、i型细胞因子受体(如白介素1受体、白介素2受体、白介素3受体、白介素4受体、白介素5受体、白介素6受体、白介素7受体、白介素9受体、白介素11受体、白介素12受体、白介素13受体、白介素15受体、白介素18受体、白介素21受体、白介素23受体、白介素27受体)、促红细胞生成素受体、gm-csf受体、g-csf受体、生长激素受体、催乳素受体、瘦素受体、制瘤素m受体、白血病抑制因子、ii型细胞因子受体(如干扰素α/β受体、干扰素γ受体、干扰素iii型受体、白介素10受体、白介素20受体、白介素22受体、白介素28受体)、肿瘤坏死因子受体超家族中的受体(如肿瘤坏死因子受体2(1b)、肿瘤坏死因子受体1)、淋巴毒素β受体、ox40、cd40、fas受体、诱饵受体3、cd27、cd30、4-1bb、诱饵受体2、诱饵受体1、死亡受体5、死亡受体4、rank、骨保护素、tweak受体、taci、baff受体、疱疹病毒进入介质、神经生长因子受体、b细胞成熟抗原、糖皮质激素诱导的tnfr相关受体、troy、死亡受体6、死亡受体3、外异蛋白(ectodysplasin)a2受体、趋化因子受体(如ccr1、ccr2、ccr3、ccr4、ccr5、ccr6、ccr7、ccr8、ccr9、ccr10、cxcr1、cxcr2、cxcr3、cxcr4、cxcr5、cxcr6、cx3cr1、xcr1、ackr1、ackr2、ackr3、ackr4、ccrl2)、表皮生长因子受体(egfr)家族中的受体、成纤维细胞生长因子受体(fgfr)家族中的受体、血管内皮生长因子受体(vegfr)家族中的受体、转染期间重排(ret)受体家族中的受体、eph受体家族中的受体、可诱导细胞分化的受体(例如，notch受体)、细胞粘附分子(cam)、粘附受体(如整联蛋白受体)、钙粘蛋白、选择素、以及盘状结构域受体(ddr)家族中的受体、转化生长因子β受体1和转化生长因子β受体2。在一些实施方案中，这样的受体是选自以下的免疫细胞受体：t细胞受体、b细胞受体、天然杀伤(nk)细胞受体、巨噬细胞受体、单核细胞受体、嗜中性粒细胞受体、树突细胞受体、肥大细胞受体、嗜碱性粒细胞受体和嗜酸性粒细胞受体。
39.根据一些实施方案，感兴趣的蛋白质是工程化细胞表面受体，并且工程化细胞表面受体是嵌合抗原受体(car)。在某些实施方案中，当感兴趣的蛋白质是car时，car的胞外结合结构域包含单链抗体。单链抗体可以是单克隆单链抗体、嵌合单链抗体、人源化单链抗体、完全人单链抗体和/或类似物。在一个非限制性实例中，单链抗体是单链可变片段(scfv)。合适的car胞外结合结构域包括在labanieh等人(2018)nature biomedical engineering2:377-391中所述的那些。在一些实施方案中，car的胞外结合结构域是由美国食品和药品管理局(united states food and drug administration)和/或欧洲药品管理局(european medicines agency，ema)批准用作治疗性抗体(例如用于诱导患者中某些疾病相关细胞的抗体依赖性细胞毒性(adcc)等)的抗体的单链形式(例如，scfv形式)。当感兴趣的蛋白质是car时可以采用的单链抗体的非限制性实例包括以下抗体的单链形式(例如，scfv形式)：阿德木单抗(adecatumumab)、阿伐苏单抗(ascrinvacumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、可那木单抗(conatumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、曲齐妥单抗(drozitumab)、杜利妥单抗(duligotumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、杜斯吉妥单抗(dusigitumab)、恩诺单抗(enfortumab)、依诺苏单抗(enoticumab)、芬妥木单抗
(figitumumab)、加尼妥单抗(ganitumab)、格巴妥木单抗(glembatumumab)、英妥木单抗(intetumumab)、伊匹木单抗、伊妥木单抗(iratumumab)、艾芦库单抗(icrucumab)、来沙木单抗(lexatumumab)、鲁卡木单抗(lucatumumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、那呐妥单抗(narnatumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、奈弗库单抗(nesvacumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、帕木单抗(panitumumab)、帕曲妥单抗(patritumab)、普立木单抗(pritumumab)、达雷妥尤单抗(radretumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、罗妥木单抗(robatumumab)、塞巴坦单抗(seribantumab)、他瑞妥单抗(tarextumab)、替妥木单抗(teprotumumab)、托维妥单抗(tovetumab)、万替妥单抗(vantictumab)、维森库单抗(vesencumab)、伏妥木单抗(votumumab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、法兰妥单抗(flanvotumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、安那妥莫单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、兰妥莫单抗(blinatumomab)、地莫单抗(detumomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、明瑞莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫塞妥莫单抗(moxetumomab)、那普妥莫单抗(naptumomab)、诺非单抗(nofetumomab)、培妥莫单抗(pemtumomab)、帕尼单抗(pintumomab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、沙妥莫单抗(satumomab)、索利托单抗(solitomab)、他利妥莫单抗(taplitumomab)、替妥莫单抗(tenatumomab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲美木单抗(tremelimumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、伊戈伏单抗(igovomab)、奥戈伏单抗(oregovomab)、卡罗单抗(capromab)、依屈洛单抗(edrecolomab)、纳可洛单抗(nacolomab)、阿麦妥昔单抗(amatuximab)、巴维昔单抗(bavituximab)、本妥昔单抗(brentuximab)、西妥昔单抗、德尔罗妥单抗(derlotuximab)、地努图希单抗(dinutuximab)、恩妥昔单抗(ensituximab)、伏妥昔单抗(futuximab)、吉瑞昔单抗(girentuximab)、英达妥昔单抗(indatuximab)、伊沙妥昔单抗(isatuximab)、马格妥昔单抗(margetuximab)、利妥昔单抗、司妥昔单抗(siltuximab)、乌妥昔单抗(ublituximab)、依美昔单抗(ecromeximab)、阿比妥珠单抗(abituzumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、布隆妥珠单抗(brontictuzumab)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、坎妥珠单抗、西他珠单抗(citatuzumab)、克利伐珠单抗(clivatuzumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)、登赛珠单抗(demcizumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、地宁妥珠单抗(denintuzumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾玛曲单抗(emactuzumab)、艾米贝妥珠单抗(emibetuzumab)、依诺妥珠单抗(enoblituzumab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、法利珠单抗(farletuzumab)、非克拉珠单抗(ficlatuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、伊马珠单抗(imgatuzumab)、英妥珠单抗(inotuzumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、利法妥珠单抗(lifastuzumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、洛沃妥珠单抗(lorvotuzumab)、鲁妥珠单抗(lumretuzumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、奥卡珠单抗(ocaratuzumab)、奥乐妥珠单抗(otlertuzumab)、奥纳妥珠单抗(onartuzumab)、奥泼妥珠单抗(oportuzumab)、帕沙妥珠单抗(parsatuzumab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、匹那妥珠单抗(pinatuzumab)、泊洛妥珠单抗(polatuzumab)、西罗珠单抗(sibrotuzumab)、辛妥珠单抗(simtuzumab)、他珠单抗(tacatuzumab)、替加珠单抗(tigatuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、西莫白介素单抗(tucotuzumab)、万多妥珠单
抗(vandortuzumab)、伐努赛珠单抗(vanucizumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)、索非妥珠单抗(sofituzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、厄马索单抗(ertumaxomab)、达妥昔单抗(depatuxizumab)、昂妥昔珠单抗(ontuxizumab)、布隆妥维单抗(blontuvetmab)、坦妥维单抗(tamtuvetmab)、或它们的抗原结合变体。根据一些实施方案，当感兴趣的蛋白质是car时，car的胞外结合结构域特异性地结合癌细胞表面上表达的抗原。例如，胞外结合结构域可以结合选自b7-h3(cd276)、cd19、gd2、cd22和her2的癌细胞表面抗原。
40.在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质是在不同结构域之间包含一个或多个接头序列的car。“可变区连接序列”是如下氨基酸序列，其将重链可变区与轻链可变区连接并且提供与两个亚结合结构域的相互作用相容的间隔区功能，使得所得的多肽与包含相同轻链和重链可变区的抗体对相同靶分子保持特异性结合亲和力。可变区连接序列的非限制性实例是丝氨酸-甘氨酸接头，如包含氨基酸序列ggggsggggsggggs(g4s)3(seq id no:26)的丝氨酸-甘氨酸接头。在某些方面，接头分隔一个或多个重链或轻链可变结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和/或初级信号传导结构域。在特定实施方案中，car包含一个、两个、三个、四个或五个或更多个接头。在特定的实施方案中，接头的长度为约1个至约25个氨基酸、约5个至约20个氨基酸、或约10个至约20个氨基酸、或任何氨基酸插入长度。在一些实施方案中，接头为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个或更多个氨基酸长。
41.在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质是包含后面有一个或多个间隔区结构域的抗原结合结构域的car，所述间隔区结构域移动抗原结合结构域远离效应细胞表面(例如，表达car的t细胞表面)以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和/或激活。间隔区结构域(和本文所述的任何其他间隔区结构域、接头和/或类似物)可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在某些实施方案中，间隔区结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区，例如ch2和ch3。间隔区结构域可以包含天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一个实施方案中，间隔区结构域包含igg1、igg4或igd的ch2和/或ch3。适合用于本文所述的car的说明性间隔区结构域包含衍生自1型膜蛋白(如cd8α和cd4)的胞外区的铰链区，其可以是来自这些分子或它们的变体的野生型铰链区。在某些方面，铰链结构域包含cd8α铰链区。在一些实施方案中，铰链是pd-1铰链或cd152铰链。
[0042]“跨膜结构域”(tm结构域)是融合了胞外结合部分和胞内信号传导结构域并且将car锚定到细胞(例如，免疫效应细胞)质膜上的car部分。tm结构域可以源自天然、合成、半合成或重组来源。在一些实施方案中，tm结构域衍生自t细胞受体的α或β链、cd35、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd4、cd5、cd8α、cd9、cd16、cd22、cd27、cd28、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154和pd-1的(例如，包含至少跨膜区或其功能部分)。
[0043]
在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质是包含衍生自cd8α的tm结构域的car。根据一些实施方案，car包含衍生自cd8α的tm结构域和连接car的tm结构域和胞内信号传导结构域的短的寡肽或多肽接头(例如长度在1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸之间)。例如，甘氨酸-丝氨酸接头可以用作这样的接头。
[0044]
car的“胞内信号传导”结构域是指参与将来自与靶分子/抗原结合的car的信号转
导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能(例如，激活、细胞因子产生、增殖和/或细胞毒性活性(包括细胞毒性因子释放到结合car的靶细胞中)或由靶分子/抗原与胞外car结构域结合引发的其他细胞反应)的car部分。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特化功能的蛋白质部分或结构域。就使用胞内信号传导结构域的截短部分而言，可以使用这种截短部分代替全长胞内信号传导结构域，只要其转导效应子功能信号即可。术语胞内信号传导结构域意在包括胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
[0045]
通过单独的t细胞受体(tcr)产生的信号不足以完全激活t细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，t细胞激活由两种不同类别的信号传导结构域介导：通过tcr(例如tcr/cd3复合物)启动抗原依赖性初级激活的初级信号传导结构域和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的共刺激信号传导结构域。因此，当感兴趣的蛋白质是car时，car可以包含胞内信号传导结构域，其包含一个或多个“共刺激信号传导结构域”和“初级信号传导结构域”。
[0046]
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级信号传导结构域可以含有信号传导基序，其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(或“itam”)。适合用于car的含有itam的初级信号传导结构域的非限制性实例包括衍生自fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79α、cd79β和cd66δ的那些。在某些实施方案中，car包括cd3ζ初级信号传导结构域和一个或多个共刺激信号传导结构域。胞内初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域有效地连接到跨膜结构域的羧基末端。
[0047]
在一些实施方案中，当感兴趣的蛋白质是car时，car包含一个或多个共刺激信号传导结构域以增强表达car的t细胞的效力和扩增。如本文所用，术语“共刺激信号传导结构域”或“共刺激结构域”是指共刺激分子或其活性片段的胞内信号传导结构域。特定实施方案中预期的适合用于car的示例性共刺激分子包括tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd54(icam)、cd83、cd134(ox40)、cd137(4-1bb)、cd278(icos)、dap10、lat、kd2c、slp76、trim和zap70。在一些实施方案中，car包含选自由4-1bb、cd28、cd137和cd134组成的组的一个或多个共刺激信号传导结构域和cd3ζ初级信号传导结构域。在某些实施方案中，car包含两个或更多个细胞内信号传导结构域。例如，car可以包含独立地选自cd3ζ胞内信号传导结构域、cd28胞内信号传导结构域、4-1bb胞内信号传导结构域、ox-40胞内信号传导结构域、诱导型共刺激因子(icos)胞内信号传导结构域、cd27胞内信号传导结构域和myd88/cd40胞内信号传导结构域的第一信号传导结构域和第二信号传导结构域或它们的片段。举例来说，car可以包含为cd3ζ胞内信号传导结构域的第一胞内信号传导结构域或其片段和为cd28胞内信号传导结构域的第二胞内信号传导结构域或其片段。再次举例来说，car可以包含为cd3ζ胞内信号传导结构域的第一胞内信号传导结构域或其片段和为4-1bb胞内信号传导结构域的第二胞内信号传导结构域或其片段。
[0048]
根据一些实施方案，当感兴趣的蛋白质是car时，car包含与感兴趣的抗原结合的抗原结合部分(例如，单链抗体，如scfv)；来自选自由cd4、cd8α、cd154和pd-1组成的组的多肽的跨膜结构域；来自选自由4-1bb、cd28、cd134和cd137组成的组的多肽的一个或多个胞内共刺激信号传导结构域；和来自选自由fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79
α、cd79β和cd66δ组成的组的多肽的胞内信号传导结构域。这样的car还可以包含在抗原结合部分与跨膜结构域之间的间隔区结构域，例如cd8α铰链。
[0049]
在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质是细胞表面分子，例如细胞表面受体。根据一些实施方案，细胞表面分子选自细胞因子受体、趋化因子受体、粘附分子、整联蛋白、抑制性受体、抑制性细胞表面配体、刺激性受体、刺激性细胞表面配体、含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的受体和含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的受体。
[0050]
当感兴趣的蛋白质是细胞表面分子(例如，细胞表面受体如car、工程化或非工程化tcr等)时，细胞表面分子可以包含特异性地结合靶细胞表面上的分子的胞外结合结构域。靶细胞可以是任何感兴趣的细胞类型。例如，靶细胞可以是遗传和/或表型正常的细胞。在其他实施方案中，靶细胞是遗传和/或表型异常的细胞。感兴趣的异常细胞包括但不限于癌细胞、肿瘤微环境中的细胞(例如，肿瘤基质细胞)(如癌症相关成纤维细胞(caf)、骨髓来源的抑制细胞(mdsc)、肿瘤相关巨噬细胞(tam)、肿瘤内皮细胞(tec)等)。参见例如labanieh等人(2018)nature biomedical engineering 2:377-391。“癌细胞”意指表现出赘生性细胞表型的细胞，其特征可在于以下示例性特征中的一个或多个：异常细胞生长、异常细胞增殖、密度依赖性生长抑制的丧失、不依赖固着的生长潜力、在免疫受损的非人动物模型中促进肿瘤生长和/或发育的能力、和/或任何适当的细胞转化指标。“癌细胞(cancer cell)”在本文中可以与“肿瘤细胞”、“恶性细胞”或“癌细胞(cancerous cell)”互换使用，并且涵盖实体瘤、半实体瘤、恶性血液肿瘤(例如，白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞等)、原发性肿瘤、转移性肿瘤等的癌细胞。根据一些实施方案，感兴趣的蛋白质是tcr，其识别癌细胞表面上展示的与主要组织相容性复合物(mhc)分子复合的抗原肽。
[0051]
在某些实施方案中，当靶细胞是癌细胞时，细胞表面分子(例如，car、tcr等)特异性地结合癌细胞表面上的肿瘤抗原。细胞表面分子可以特异性地结合的肿瘤抗原的非限制性实例包括5t4、axl受体酪氨酸激酶(axl)、b细胞成熟抗原(bcma)、c-met、c4.4a、碳酸酐酶6(ca6)、碳酸酐酶9(ca9)、钙粘蛋白6、cd19、cd22、cd25、cd27l、cd30、cd33、cd37、cd44v6、cd56、cd70、cd74、cd79b、cd123、cd138、癌胚抗原(cea)、ckit、cripto蛋白、cs1、δ样规范notch配体3(dll3)、内皮素受体b型(ednrb)、肝配蛋白(ephrin)a4(efna4)、表皮生长因子受体(egfr)、egfrviii、外切核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3(enpp3)、eph受体a2(epha2)、成纤维细胞生长因子受体2(fgfr2)、成纤维细胞生长因子受体3(fgfr3)、fms样酪氨酸激酶3(flt3)、叶酸受体1(folr1)、非转移性糖蛋白b(gpnmb)、鸟苷酸环化酶2c(gucy2c)、人表皮生长因子受体2(her2)、人表皮生长因子受体3(her3)、整联蛋白α、溶酶体相关膜蛋白1(lamp-1)、lewis y、liv-1、含富亮氨酸集重复蛋白15(lrrc15)、间皮素(msln)、粘蛋白1(muc1)、粘蛋白16(muc16)、钠依赖性磷酸盐转运蛋白2b(napi2b)、连接素4、nmb、notch3、p-钙粘蛋白(p-cad)、前列腺特异性膜抗原(psma)、蛋白质酪氨酸激酶7(ptk7)、溶质载体家族44成员4(slc44a4)、slit样家族成员6(slitrk6)、steap家族成员1(steap1)、组织因子(tf)、t细胞免疫球蛋白和粘蛋白蛋白1(tim-1)、滋养层细胞表面抗原(trop-2)和wilms肿瘤1(wt1)。
[0052]
当感兴趣的蛋白质是细胞表面分子(例如，细胞表面受体如car、工程化或非工程化tcr等)时，细胞表面分子可以包含特异性地结合抗原(例如，细胞表面抗原(如癌细胞表面上的抗原)或与mhc分子相关的抗原性肽)的胞外结合结构域。如果胞外结合结构域以例
如大于或等于约105m-1
的亲和力或ka(即，以1/m为单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)与抗原结合或缔合，则该胞外结合结构域“特异性地结合”抗原。在某些实施方案中，胞外结合结构域结合以大于或等于约106m-1
、107m-1
、108m-1
、109m-1
、10
10
m-1
、10
11
m-1
、10
12
m-1
或10
13
m-1
的ka结合抗原。“高亲和力”结合是指以至少107m-1
、至少108m-1
、至少109m-1
、至少10
10
m-1
、至少10
11
m-1
、至少10
12
m-1
、至少10
13
m-1
或更大的ka进行结合。替代地，亲和力可以定义为以m为单位(例如，10-5
m至10-13
m，或更小)进行的特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)。在一些实施方案中，特异性结合意指胞外结合结构域以小于或等于约10-5
m、小于或等于约10-6
m、小于或等于约10-7
m、小于或等于约10-8
m、或小于或等于约10-9
m、10-10
m、10-11
m或10-12
m或更小的kd结合靶分子。使用常规技术(例如，通过竞争性elisa(酶联免疫吸附测定)；平衡透析；通过使用表面等离子共振(spr)技术(例如biacore 2000仪器，使用制造商概述的一般程序)；通过放射免疫测定；等等)可以容易地确定胞外结合结构域对靶抗原的结合亲和力。
[0053]
根据一些实施方案，本公开的重组多肽的感兴趣的蛋白质组分是转录因子。例如，当需要通过调节转录因子定位到细胞核的能力来通过转录因子调节靶基因的表达时，此类重组多肽是有用的。例如，当存在蛋白酶抑制剂时，蛋白质定位标签可以导致转录因子保留在除细胞核以外的细胞区室中，然而当不存在蛋白酶抑制剂时，转录因子定位到细胞核中。
[0054]
在某些实施方案中，本公开的重组多肽的感兴趣的蛋白质是分泌型效应分子。“分泌型效应分子”意指当蛋白质定位标签从效应分子切割下时由细胞分泌的效应分子(例如，刺激性配体、抑制性配体、细胞因子、趋化因子、生长因子、蛋白酶等)。根据一些实施方案，当感兴趣的蛋白质是分泌型效应分子时，蛋白质定位标签是er定位标签。包含分泌型效应分子和er定位标签的重组多肽的非限制性示例性构型示意性地示于图9中。
[0055]
蛋白酶和蛋白酶切割位点
[0056]
重组多肽包含位于感兴趣的蛋白质与蛋白质定位标签之间的蛋白酶切割位点。术语“切割位点”是指被药剂(例如蛋白酶)切割的键(例如，易切键)。蛋白酶的切割位点包含在蛋白水解切割期间被蛋白酶识别的特定氨基酸序列，并且可以包含在易切键的任一侧的周围氨基酸(例如，1个至6个氨基酸)，其结合至蛋白酶的活性位点并且是作为底物进行识别所必需的。在一些实施方案中，切割位点作为可切割接头提供，其中“可切割接头”是指包含蛋白酶切割位点的接头。可切割接头通常在生理条件下是可切割的。
[0057]
在某些实施方案中，多肽还包含蛋白酶(本文中称为“顺式”构型)，其中所述蛋白酶切割位点是所述蛋白酶的切割位点。根据一些实施方案，当重组多肽包含蛋白酶时，所述多肽从n末端到c末端包含：感兴趣的蛋白质；蛋白酶切割位点；蛋白酶；和蛋白质定位标签。在某些实施方案中，当重组多肽包含蛋白酶时，所述多肽从n末端到c末端包含：蛋白质定位标签；蛋白酶；蛋白酶切割位点；和感兴趣的蛋白质。在某些实施方案中，所述多肽不包含切割蛋白酶切割位点的蛋白酶，但是这种能够切割蛋白酶切割位点的蛋白酶作为单独的分子表达-在本文中称为“反式”构型。顺式和反式构型的非限制性实例示意性地示于图8和9中。
[0058]
在一些实施方案中，蛋白酶对细胞表面受体中的切割位点具有高度选择性。另外，蛋白酶活性优选能够被已知的小分子抑制剂抑制，所述小分子抑制剂是细胞可渗透的并且对所研究或治疗的细胞或个体没有毒性。关于蛋白酶的论述，参见例如v.y.h.hook,proteolytic and cellular mechanisms in prohormone and proprotein processing,rg landes company,austin,tex.,usa(1998)；n.m.hooper等人,biochem.j.321:265-279
(1997)；z.werb,cell 91:439-442(1997)；t.g.wolfsberg等人,j.cell biol.131:275-278(1995)；t.berg等人,biochem.j.307:313-326(1995)；m.j.smyth和j.a.trapani,immunology today 16:202-206(1995)；r.v.talanian等人,j.biol.chem.272:9677-9682(1997)；以及n.a.thornberry等人,j.biol.chem.272:17907-17911(1997)，所述文献的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文。
[0059]
在一些实施方案中，所采用的蛋白酶是序列特异性非人蛋白酶，fda批准的药理学抑制剂可用于该序列特异性非人蛋白酶。在一些实施方案中，所采用的蛋白酶是病毒蛋白酶。可以与本文提供的系统、组合物和方法一起使用的病毒蛋白酶的非限制性实例包括丙型肝炎病毒(hcv)蛋白酶、鼻病毒蛋白酶、柯萨奇病毒蛋白酶、登革热病毒蛋白酶和tev蛋白酶。根据一些实施方案，病毒蛋白酶是hcv蛋白酶。在某些实施方案中，病毒蛋白酶衍生自hcv非结构蛋白3(ns3)。ns3由n末端丝氨酸蛋白酶结构域和c末端解旋酶结构域组成。“衍生自hcv ns3”意指蛋白酶是hcv ns3的丝氨酸蛋白酶结构域或其能够切割hcv ns3的丝氨酸蛋白酶结构域的切割位点的蛋白水解活性变体。ns3的蛋白酶结构域与激活蛋白水解活性的hcv非结构蛋白4a(ns4a)形成异二聚体。衍生自hcv ns3的蛋白酶可以包含完整ns3蛋白或其蛋白水解活性片段，并且还可以包含辅因子多肽，如衍生自hcv非结构蛋白4a(ns4a)的辅因子多肽，例如激活ns4a区。ns3蛋白酶具有高度选择性，并且可以被许多目前可用于供人类使用的无毒的细胞可渗透药物抑制。可以被采用的ns3蛋白酶抑制剂包括但不限于西咪匹韦(simeprevir)、丹诺普韦(danoprevir)、阿舒瑞韦(asunaprevir)、西鲁瑞韦(ciluprevir)、波普瑞韦(boceprevir)、索伐瑞韦(sovaprevir)、帕利普韦(paritaprevir)、特拉匹韦(telaprevir)、格拉瑞韦(grazoprevir)及它们的任何组合。下面提供了衍生自hcv ns3的蛋白酶的非限制性实例。
[0060]
衍生自hcv ns3的示例性蛋白酶
[0061]
apitayaqqtrgllgciitsltgrdknqvegevqivstatqtflatcingvcwavyhgagtrtiaspkgpviqmytnvdqdlvgwpapqgsrsltpctcgssdlylvtrhadvipvrrrgdsrgsllsprpisylkgssggpllcpaghavglfraavctrgvakavdfipvenlettmrspvftd(seq id no:27)
[0062]
apitayaqqtrgllgciitsltgrdknqvegevqimstatqtflatcingvcwtvyhgagtrtiaspkgpviqmytnvdqdlvgwpapqgsrsltpctcgssdlylvtrhadvipvrrrgdgrgsllsprpisylkgssggpllcpaghavglfraavctrgvakavdfipvenlettmrspvftd(seq id no:28)
[0063]
apitayaqqtrgllgciitsltgrdknqvegevqivstatqtflatcingvcwavyhgagtrtiaspkgpviqmytnvdqdlvgwpapqgsrsltpctcgssdlylvtrhadvipvrrrgdsrgsllsprpisylkgssggpllcpaghavglfraavctrgvakavdfipvenlettmrspvftd(seq id no:29)
[0064]
apitayaqqtrgllgciitsltgrdknqvegevqivstatqtflatcingvcwtvyhgagtrtiaspkgpviqmytnvdqdlvgwpapqgsrsltpctcgssdlylvtrhadvipvrrrgdsrgsllsprpisylkgssggpllcpaghavglfraavctrgvakavdfipvenlettmrspvftd(seq id no:30)
[0065]
在一些实施方案中，蛋白酶包含seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30中所示的序列，或者是其与seq id no:27、seq id no:28、seq id no:29或seq id no:30具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、或99％或更高的氨基酸序列同一性的功能(蛋白水解)变体、和/或其功能(蛋白水解)片段(如长度为100个至185个、120个至185个、140个至185个、160个至185个、170个至185
个、180个至185个、182个至185个、或184个至185个氨基酸的片段)。
[0066]
在一些实施方案中，蛋白酶切割位点是病毒蛋白酶切割位点。例如，当采用衍生自hcv ns3的蛋白酶时，切割位点应包含ns3蛋白酶切割位点。ns3蛋白酶切割位点可以包含在hcv感染期间通常被ns3蛋白酶切割的hcv多聚蛋白的非结构(ns)蛋白之间的四个连接处，包括ns3/ns4a、ns4a/ns4b、ns4b/ns5a和ns5a/ns5b连接处切割位点。关于对各种hcv株的ns3蛋白酶及其切割位点的代表性序列的描述，参见例如hepatitis c viruses:genomes and molecular biology(s.l.tan编辑,taylor&francis,2006),第6章,第163-206页；其公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0067]
在一些实施方案中，蛋白酶衍生自hcv ns3并且被工程化以包括相对于seq id no:27中所示氨基酸序列的一个或多个氨基酸置换。例如，蛋白酶可以包含在与seq id no:27中所示氨基酸序列的位置54对应的位置处的置换。在一些实施方案中，这种置换是苏氨酸到丙氨酸的置换。
[0068]
ns3核酸和蛋白质序列可以衍生自hcv，包括具有任何基因型(例如，基因型1-7)或亚型的hcv的任何分离物。许多ns3核酸和蛋白质序列是已知的并且描述于例如ussn15/737,712(其公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文)中。在国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)数据库中列出了另外的代表性ns3序列。参见例如ncbi条目：登录号yp_001491553、yp_001469631、yp_001469632、np_803144、np_671491、yp_001469634、yp_001469630、yp_001469633、ada68311、ada68307、afp99000、afp98987、ada68322、afp99033、ada68330、afp99056、afp99041、cbf60982、cbf60817、ahh29575、aiz00747、aiz00744、abi36969、abn05226、kf516075、kf516074、kf516056、ab826684、ab826683、jx171009、jx171008、jx171000、eu847455、ef154714、gu085487、jx171065和jx171063；所有这些序列以引用的方式并入本文。可以采用与这些序列或其蛋白水解片段中的任一者具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、或99％或更高的氨基酸序列同一性的这些序列或其功能变体中的任一者。
[0069]
ns4a核酸和蛋白质序列可以衍生自hcv，包括具有任何基因型(例如，七种基因型1-7)或亚型的hcv的任何分离物。许多ns4a核酸和蛋白质序列是已知的。在国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)数据库中列出了代表性ns4a序列。参见例如ncbi条目：登录号np_751925、yp_001491554、gu945462、hq822054、fj932208、fj932207、fj932205和fj932199；所有这些序列(在本技术的申请日之前输入的)以引用的方式并入本文。可以采用与这些序列或其蛋白水解片段中的任一者具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、或99％或更高的氨基酸序列同一性的这些序列或其功能变体中的任一者。
[0070]
hcv多聚蛋白核酸和蛋白质序列可以衍生自hcv，包括具有任何基因型(例如，基因型1-7)或亚型的hcv的任何分离物。许多hcv多聚蛋白核酸和蛋白质序列是已知的。在国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information，ncbi)数据库中列出了代表性hcv多聚蛋白序列。参见例如ncbi条目：登录号yp_001469631、np_671491、yp_001469633、yp_001469630、yp_001469634、yp_001469632、nc_009824、nc_004102、nc_009825、nc_009827、nc_009823、nc_009826和ef108306；所有这些序列(在本技术的申请日
之前输入的)以引用的方式并入本文。可以采用与这些序列或其蛋白水解片段中的任一者具有70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、或99％或更高的氨基酸序列同一性的这些序列或其功能变体中的任一者。
[0071]
在一些实施方案中，蛋白酶衍生自hcv ns3并且切割位点包含ns3蛋白酶切割位点。ns3蛋白酶切割位点可以包括hcv多聚蛋白ns3/ns4a、ns4a/ns4b、ns4b/ns5a和ns5a/ns5b连接处切割位点。代表性的hcv ns4a/4b蛋白酶切割位点包含demeecsqh(seq id no:31)和demeecsqh(seq id no:32)。代表性的hcv ns5a/5b蛋白酶切割位点包含edvvpcsmg(seq id no:33)和edvvpcsmgs(seq id no:34)。代表性的ns4b/5a蛋白酶切割位点是ecttpcsgswl(seq id no:35)。可以包括在本公开的重组多肽中的另外的ns3蛋白酶切割位点包括在shiryaev等人(2012)plos one 7(4):e35759中所描述的那些。
[0072]
核酸
[0073]
本公开还提供了编码本公开的任何重组多肽和/或蛋白酶(例如，细胞外或细胞内栓系的蛋白酶构建体)的核酸，包括具有上文所述的任何特征(例如，结构域等)及其组合的任何重组多肽和/或蛋白酶。因为遗传密码是简并的，所以有许多核苷酸序列可以编码本公开的重组多肽和/或蛋白酶。这些多核苷酸中的一些可以与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。在特定的实施方案中特别考虑了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸，例如针对人和/或灵长类动物密码子选择而优化的多核苷酸。
[0074]
下表1中显示了本公开的示例性重组多肽和蛋白酶的氨基酸序列(从n末端到c末端显示)。这些实例中包括以下实验部分中所采用的重组多肽。未显示最初存在于多肽n末端处的信号序列。多肽的区段/结构域由下划线和非下划线文本的交替延伸段表示，并且区段/结构域的同一性提供在左列中。
[0075]
表1-示例性重组多肽和蛋白酶序列
[0076]
[0077]
[0078]
[0079][0080]
还提供了包含本公开的任何核酸的表达载体。“载体”是能够将核酸序列转移至靶细胞的核酸分子(例如，病毒载体、非病毒载体、颗粒载剂和脂质体)。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导感兴趣的核酸的表达并且能够将核酸序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。
[0081]
为了表达所需的重组多肽和/或蛋白酶，可以例如使用本领域已知的重组dna技术将编码重组多肽和/或蛋白酶的核苷酸序列插入适当的载体中。示例性病毒载体包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，sv40)。表达载体的说明性实例包括但不限于用于在哺乳动物细胞中表达的pclneo载体(promega)；用于在哺乳动物细胞中进行慢病毒介导的基因转移和表达的plenti4/v 5-dest
tm
、plenti6/v 5-dest
tm
、鼠干细胞病毒(mscv)、msgv、莫洛尼(moloney)鼠白血病病毒(mmlv)和plenti6.2/v5-gw/lacz(invitrogen)。在某些实施方案中，可以将编码本公开的重组多肽和/或蛋白酶的核酸序列连接到任何此类表达载体
中用于在哺乳动物细胞中表达所述重组多肽和/或蛋白酶。
[0082]
在一些实施方案中，当重组多肽和蛋白酶以反式使用时，重组多肽和蛋白酶由单独的表达载体表达。在一些实施方案中，当重组多肽和蛋白酶以反式使用时，细胞表面受体和蛋白酶由相同的表达载体表达。在一些实施方案中，这样的表达载体是双顺反子表达载体，其中所述重组多肽和蛋白酶在相同的启动子下表达。例如，表达载体可以在重组多肽编码区和蛋白酶编码区之间包括内部核糖体进入位点(ires)或核糖体跳跃位点(有时称为自切割肽序列)，如猪捷申病毒1 2a(p2a)序列、明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)2a(t2a)序列、口蹄疫病毒2a(f2a)序列和马鼻炎a病毒2a(e2a)序列，从而允许重组多肽和蛋白酶作为与相同启动子分开的多肽进行表达。关于用于多顺反子载体的核糖体跳跃位点的进一步细节可以在例如liu等人(2017)scientific reports 7:2193中找到。
[0083]
表达载体中存在的表达控制序列、控制元件或调节序列是与宿主细胞蛋白质发生相互作用以进行转录和翻译的那些载体非翻译区，例如复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(shine dalgarno序列或kozak序列)、内含子、聚腺苷酸化序列、5'和3'非翻译区和/或类似物。此类元件的强度和特异性可以不同，并且可以由本领域技术人员根据用于每个特定构建体的载体系统和宿主来选择。根据所利用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的合适的转录和翻译元件，包括普遍存在的启动子和诱导型启动子。
[0084]
表达载体的组分有效地连接，使得它们处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。在一些实施方案中，该术语是指在核酸表达控制序列(如启动子和/或增强子)与第二多核苷酸序列(例如编码重组多肽和/或蛋白酶的核酸)之间的功能连接，其中所述表达控制序列指导编码重组多肽和/或蛋白酶的核酸的转录。
[0085]
在一些实施方案中，表达载体是附加型载体或保持在染色体外的载体。如本文所用，术语“附加型”是指能够复制而不整合到宿主细胞的染色体dna中并且不从正在分裂的宿主细胞逐渐遗失的载体，也意指载体在染色体外或游离地复制。这样的载体可以被工程化以具有编码来自α、β或γ疱疹病毒、腺病毒、sv40、牛乳头瘤病毒、酵母等的dna复制起点或“ori”的序列。宿主细胞可以包含激活复制的病毒复制反式激活蛋白。α疱疹病毒具有相对短的生殖周期、可变的宿主范围，有效地破坏受感染的细胞并主要在感觉神经节中建立潜伏感染。α疱疹病毒的说明性实例包括hsv1、hsv2和vzv。β疱疹病毒具有长的生殖周期和有限的宿主范围。受感染的细胞通常会扩大。β疱疹病毒的非限制性实例包括cmv、hhv-6和hhv-7。γ疱疹病毒对t或b淋巴细胞具有特异性，并且通常在淋巴组织中表现出潜伏期。γ疱疹病毒的说明性实例包括ebv和hhv-8。
[0086]
可以使用的其他基因递送系统包括mrna电穿孔、crispr-cas9、talen、锌指、转座酶载体等。参见例如labanieh等人(2018)nature biomedical engineering 2:377-391。
[0087]
细胞
[0088]
还提供了包含本公开的任何重组多肽、蛋白酶、核酸和/或表达载体的细胞(例如，重组宿主细胞)。
[0089]
在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。感兴趣的真核细胞包括但不限于酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。感兴趣的哺乳动物细胞包括例如鼠细胞、非人灵长类动物细胞、人细胞等。
[0090]
术语“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他此类
术语是指可以用作或已经用作重组载体或其他转移dna的接受者的细胞，并且包括已经转染的细胞的后代。可以将宿主细胞作为包含本公开的表达载体的单细胞或多细胞实体(例如，组织、器官或类器官)进行培养。
[0091]
在一个方面，本文提供的细胞包括免疫细胞。可以包含本公开的任何重组多肽、蛋白酶、核酸和/或表达载体的免疫细胞的非限制性实例包括t细胞、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞包含t细胞。示例性t细胞类型包括原初t细胞(tn)、细胞毒性t细胞(t
ctl
)、记忆t细胞(t
mem
)、t记忆干细胞(t
scm
)、中央记忆t细胞(t
cm
)、效应记忆t细胞(t
em
)、组织驻留记忆t细胞(t
rm
)、效应t细胞(t
eff
)、调节性t细胞(t
regs
)、辅助t细胞(th、th1、th2、th17)、cd4 t细胞、cd8 t细胞、病毒特异性t细胞、αβt细胞(t
αβ
)和γδt细胞(t
γδ
)。在一些实施方案中，细胞是t细胞，并且感兴趣的蛋白质是car，例如本文所述的任何car。在另一个方面，本文提供的细胞包括干细胞，例如胚胎干细胞或成体干细胞。
[0092]
在一个方面，本文提供的细胞包括干细胞和祖细胞。可以包含本公开的任何重组多肽、蛋白酶、核酸和/或表达载体的干细胞的非限制性实例包括造血干细胞(hsc)、诱导性多能干细胞(ipsc)、间充质干细胞(msc)和神经干细胞(nsc)。
[0093]
当本公开的细胞包括能够在不存在抑制剂的情况下切割蛋白酶切割位点的蛋白酶时，所述蛋白酶可以是可溶性细胞溶质蛋白酶(即，不与膜缔合/拴系)，或者所述蛋白酶可以在细胞内或细胞外拴系到细胞膜上。在一些实施方案中，当本公开的细胞包含蛋白酶时，重组多肽包含蛋白酶。
[0094]
还提供了制备本公开的细胞的方法。在一些实施方案中，此类方法包括用本公开的核酸或表达载体转染或转导细胞。术语“转染”或“转导”用于指将外源dna引入细胞中。当外源dna被引入细胞膜内部时，细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域通常是已知的。参见例如，sambrook等人(2001)molecular cloning,a laboratory manual,第3版,cold spring harbor laboratories,new york；davis等人(1995)basic methods in molecular biology,第2版,mcgraw-hill；以及chu等人(1981)gene 13:197。此类技术可以用于将一种或多种外源dna部分引入合适的宿主细胞中。该术语是指遗传物质的稳定和瞬时摄取两者。
[0095]
在一些实施方案中，通过用编码重组多肽的病毒载体转染细胞来产生本公开的细胞。在一些实施方案中，重组多肽的感兴趣的蛋白质是car，并且细胞是t细胞，因此提供了产生car t细胞的方法，其中所述car的细胞表面表达是可调节的。“细胞表面表达”或“在细胞表面上表达”意指细胞表面分子当不再与蛋白质定位标签(例如，er定位标签、高尔基体定位标签等)缔合时已经被运输至细胞膜，使得在细胞表面受体(例如，car、tcr等)的情况下胞外结合结构域展示在细胞表面上，跨膜部分穿过细胞膜，并且所述一个或多个胞内信号传导结构域邻近所述细胞膜的细胞内侧设置。当胞外结合结构域与靶配体/抗原结合时，细胞表面受体的胞内信号传导结构域参与将结合的信号转导到细胞内部(例如，效应细胞(如t细胞)，以引发效应细胞功能)。
[0096]
在一些实施方案中，当感兴趣的蛋白质是car时，产生car t细胞的方法包括激活t细胞群(例如，从将施用car t细胞疗法的个体获得的t细胞)，刺激t细胞群增殖，和用编码car的病毒载体转导t细胞。在某些实施方案中，用编码car的逆转录病毒载体(例如γ逆转录病毒载体或慢病毒载体)转导t细胞。在一些实施方案中，用编码car的慢病毒载体转导t
细胞。
[0097]
本公开的细胞可以是自体的/自体同源的(“自身的”)或非自体的(“非自身的”，例如同种异体的、同基因的或异种的)。如本文所用的“自体的”是指源自随后施用它们的同一个体的细胞。如本文所用的“同种异体”是指与对比细胞在遗传上不同的、相同物种的细胞。如本文所用的“同基因的”是指与对比细胞在遗传上相同的、不同个体的细胞。在一些实施方案中，细胞是从哺乳动物获得的t细胞。在一些实施方案中，哺乳动物是灵长类动物。在一些实施方案中，灵长类动物是人。
[0098]
t细胞可以从许多来源获得，所述来源包括但不限于外周血、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织和肿瘤。在某些实施方案中，可以使用任何数量的已知技术(如沉降，例如ficoll
tm
分离)从采集自个体的血液单位获得t细胞。
[0099]
在一些实施方案中，使用分离的或纯化的t细胞群。在一些实施方案中，从pbmc纯化t
ctl
和th淋巴细胞。在一些实施方案中，在激活、扩增和/或遗传修饰之前或之后，将t
ctl
和th淋巴细胞分选为原初(tn)、记忆(t
mem
)、干细胞记忆(t
scm
)、中央记忆(t
cm
)、效应记忆(t
em
)和效应(t
eff
)t细胞亚群。用于这种分选的合适方法是已知的并且包括例如磁激活细胞分选(macs)，其中tn是cd45ra

cd62l

cd95
–
；tscm是cd45ra

cd62l

cd95

；tcm是cd45ro

cd62l cd95

；并且tem是cd45ro

cd62l
–
cd95

。wang等人(2016)blood 127(24):2980-90中描述了这种分选的示例性方法。
[0100]
可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达以下标志物中的一种或多种的t细胞的特定亚群：cd3、cd4、cd8、cd28、cd45ra、cd45ro、cd62、cd127和hla-dr。在一些实施方案中，可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离表达一种或多种标志物的t细胞的特定亚群，所述标志物选自由以下组成的组：cd62l、ccr7、cd28、cd27、cd122、cd127、cd197；或cd38或cd62l、cd127、cd197和cd38。在一些实施方案中，制备的t细胞组合物不表达以下标志物中的一种或多种：cd57、cd244、cd 160、pd-1、ctla4、tiμ3和lag3。在一些实施方案中，制备的t细胞组合物基本上不表达以下标志物中的一种或多种：cd57、cd244、cd 160、pd-1、ctla4、tiμ3和lag3。
[0101]
为了获得治疗有效剂量的t细胞组合物，可以对t细胞进行一轮或多轮的刺激、激活和/或扩增。通常可以使用例如在以下美国专利中所描述的方法来激活和扩增t细胞：美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；和6,867,041，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，t细胞被激活并扩增约1天至21天，例如约5天至21天。在一些实施方案中，在将编码多肽的核酸(例如表达载体)引入t细胞中之前，将t细胞激活和扩增约1天至约4天、约1天至约3天、约1天至约2天、约2天至约3天、约2天至约4天、约3天至约4天、或约1天、约2天、约3天或约4天。
[0102]
在一些实施方案中，在将编码细胞表面受体的核酸(例如表达载体)引入t细胞中之前，将t细胞激活和扩增约6小时、约12小时、约18小时或约24小时。在一些实施方案中，在将编码细胞表面受体的核酸(例如表达载体)引入t细胞中的同时激活t细胞。
[0103]
在一些实施方案中，适合于t细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基(minimal essential media)或rpmi培养基1640或x-vivo 15(lonza))以及一种或
多种对于增殖和生存力所需的因子，包括但不限于血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素2(il-2)、胰岛素、ifn-γ、il-4、il-7、il-21、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgfβ和tnf-α或本领域技术人员已知的适合于细胞生长的任何其他添加剂。细胞培养基的另外的说明性实例包括但不限于rpmi 1640、clicks、aevi-v、dmem、mem、a-mem、f-12、x-vivo 15和x-vivo 20、optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，是无血清的或补充有适当量的血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以让t细胞生长和扩增的量的细胞因子。
[0104]
在一些实施方案中，通过显微注射、转染、脂质转染、热激、电穿孔、转导、基因枪、显微注射、deae-葡聚糖介导的转移等将编码细胞表面受体的核酸(例如，表达载体)引入细胞(例如，t细胞)中。在一些实施方案中，通过aav转导将编码细胞表面受体的核酸(例如，表达载体)引入细胞(例如，t细胞)中。aav载体可以包含来自aav2的itr和来自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav 10中任一者的血清型。在一些实施方案中，aav载体包含来自aav2的itr和来自aav6的血清型。在一些实施方案中，通过慢病毒转导将编码细胞表面受体的核酸(例如，表达载体)引入细胞(例如，t细胞)中。慢病毒载体骨架可以衍生自hiv-1、hiv-2、维士那-梅地病毒(visna-maedi virus，vmv)、山羊关节炎脑炎病毒(caev)、马传染性贫血病毒(eiav)、猫免疫缺陷病毒(fiv)、牛免疫缺陷病毒(biv)或猴免疫缺陷病毒(siv)。慢病毒载体可以是整合感受态或整合酶缺陷型慢病毒载体(tdlv)。在一个实施方案中，使用包含基于hiv的载体骨架(即hiv顺式作用序列元件)的idlv载体。
[0105]
还提供了包含本公开的任何重组多肽、核酸和/或表达载体的病毒。
[0106]
组合物
[0107]
还提供了包含本文所述的任何重组多肽、蛋白酶、核酸、表达载体和/或细胞的组合物。
[0108]
在一些实施方案中，组合物包含存在于液体培养基中的本公开的任何重组多肽、蛋白酶、核酸、表达载体和/或细胞。液体介质可以是水性液体介质，例如水、缓冲溶液等。一种或多种添加剂，如盐(例如nacl、mgcl2、kcl、mgso4)、缓冲剂(tris缓冲剂、n-(2-羟乙基)哌嗪-n'-(2-乙磺酸)(hepes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸钠盐(mes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、n-三[羟基甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(taps)等)、增溶剂、洗涤剂(例如，非离子型洗涤剂，如吐温(tween)-20等)、核酸酶抑制剂、甘油、螯合剂等可以存在于此类组合物中。
[0109]
还提供了药物组合物。药物组合物可以包含本公开的任何细胞和药学上可接受的载剂。药物组合物通常包含治疗有效量的细胞。“治疗有效量”意指足以产生所需结果的细胞数量，例如足以实现有益或所需治疗(包括预防)结果(如与对照相比与例如靶细胞或其群体(例如癌细胞)相关的疾病(例如癌症)或病症的症状减轻)的量。可以以一次或多次施用的方式来施用有效量。
[0110]
可以将本公开的细胞掺入多种制剂中用于治疗性施用。更具体地，本公开的细胞可以通过与适当的药学上可接受的赋形剂或稀释剂组合而配制成药物组合物。
[0111]
适合于向患者施用(例如，适合于人类施用)的细胞制剂通常是无菌的，并且可以进一步不含可检测的热原或其他根据所选择的施用途径禁止向患者施用的污染物。
[0112]
可以将细胞配制用于肠胃外(例如，静脉内、动脉内、骨内、肌内、脑内、脑室内、鞘内、皮下等)施用或任何其他合适的施用途径。
[0113]
包含本公开的细胞的药物组合物可以通过将具有所需纯度的细胞与任选的生理学上可接受的载剂、赋形剂、稳定剂、表面活性剂、缓冲剂和/或张力剂混合来制备。可接受的载剂、赋形剂和/或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包含：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、蛋氨酸和柠檬酸；防腐剂(如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵或它们的组合)；氨基酸，如精氨酸、甘氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、脯氨酸及其组合；单糖、二糖和其他碳水化合物；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如明胶或血清白蛋白；螯合剂，如edta；糖，如海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麦芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、葡糖胺、n-甲基葡糖胺、半乳糖胺和神经氨酸；和/或非离子表面活性剂，如tween、brij pluronics、triton-x或聚乙二醇(peg)。
[0114]
重组多肽、蛋白酶、核酸、表达载体和/或细胞的水性制剂可以在ph缓冲溶液(例如，ph范围为约4.0至约7.0、或约5.0至约6.0、或可替代地约5.5)中制备。适于此范围内的ph的缓冲剂的实例包括磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和其他有机酸缓冲剂。缓冲剂浓度可为约1mm至约100mm，或约5mm至约50mm，这取决于例如缓冲剂和制剂的所需张力。
[0115]
制剂中可包含张力剂以调节制剂的张力。张力剂实例包括氯化钠、氯化钾、甘油和来自氨基酸、糖以及其组合的群组的任何组分。在一些实施方案中，水性制剂是等渗的，尽管高渗或低渗溶液可能是合适的。术语“等渗的”表示具有与其所比较的一些其他溶液相同张力的溶液，如生理盐溶液或血清。可以以约5mm到约350mm的量使用张力剂，例如以100mm到350mm的量使用。
[0116]
还可以将表面活性剂添加到制剂中以减少聚集和/或使所述制剂中颗粒的形成最小化和/或减少吸附。表面活性剂实例包含聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(tween)、聚氧乙烯烷基醚(brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，pluronic)和十二烷基硫酸钠(sds)。合适的聚氧乙烯山梨糖醇酐-脂肪酸酯的实例是聚山梨醇酯20(以商标tween 20
tm
销售)和聚山梨醇酯80(以商标tween 80
tm
销售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物的实例是以名称f68或poloxamer 188
tm
销售的聚乙烯-聚丙烯共聚物。合适的聚氧乙烯烷基醚的实例是以商标brij
tm
销售的聚氧乙烯烷基醚。表面活性剂的实例浓度范围可以为约0.001％到约1％w/v。
[0117]
在一些实施方案中，药物组合物包含本公开的细胞和一种或多种上述药剂(例如，表面活性剂、缓冲剂、稳定剂、张力剂)，并且基本上不含一种或多种防腐剂(如乙醇、苯甲醇、苯酚、间甲酚、对氯间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵及它们的组合。在其他实施方案中，制剂中包含防腐剂，例如，以约0.001到约2％(w/v)的浓度范围。
[0118]
在某些方面，提供了包含治疗有效量的本公开的细胞(例如，t细胞，如car t细胞)的药物组合物。此类细胞的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及细胞在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过细胞的任何毒性或有害效果的量。术语“治疗有效量”包括对“治疗”个体(例如，患者)有效的量。当指示治疗量时，在特定实施方案中预期被施用的组合物的精确量可以由医师根据说明书并考虑患者(个体)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度和病状的个体差
异来确定。在一些实施方案中，本公开的药物组合物包含1
×
106至5
×
10
10
个本公开的细胞。
[0119]
使用方法
[0120]
在另一个方面，本文提供了使用本文所述的重组多肽、蛋白酶、核酸、表达载体和/或细胞的方法。
[0121]
在某些实施方案中，提供了调节感兴趣的蛋白质的细胞定位的方法。此类方法包括当需要将感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中时，使表达重组多肽和蛋白酶(其中所述蛋白酶切割位点是蛋白酶的切割位点)的细胞与蛋白酶抑制剂接触。根据一些实施方案，由蛋白质定位标签确定的细胞区室选自er、高尔基体、溶酶体、质膜、线粒体、过氧化物酶体、细胞溶质和细胞核。
[0122]
根据一些实施方案，感兴趣的蛋白质是工程化的。例如，感兴趣的蛋白质可以是工程化受体(例如，car、工程化tcr等)，并且所述方法包括调节工程化受体在由蛋白质定位标签确定的细胞区室与细胞表面之间的细胞定位。由蛋白质定位标签确定的细胞区室可以是例如er、高尔基体或溶酶体。在某些实施方案中，由蛋白质定位标签确定的细胞区室是er。根据一些实施方案，由蛋白质定位标签确定的细胞区室是高尔基体。
[0123]
根据一些实施方案，感兴趣的蛋白质是转录因子，例如工程化或非工程化的转录因子。当感兴趣的蛋白质是转录因子时，在某些实施方案中，所述方法包括调节转录因子在由蛋白质定位标签确定的细胞区室与细胞核之间的细胞定位。由蛋白质定位标签确定的细胞区室可以是例如er、高尔基体或溶酶体。在某些实施方案中，由蛋白质定位标签确定的细胞区室是er。根据一些实施方案，由蛋白质定位标签确定的细胞区室是高尔基体。在某些实施方案中，由蛋白质定位标签确定的细胞区室是质膜。根据一些实施方案，由蛋白质定位标签确定的细胞区室是细胞溶质。
[0124]
在某些实施方案中，感兴趣的蛋白质是分泌型效应分子，其非限制性实例包括刺激性配体、抑制性配体、细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白酶。根据一些实施方案，当感兴趣的蛋白质是分泌型效应分子时，蛋白质定位标签是er定位标签。例如，作为er定位标签的结果，分泌型效应分子可以是不溶性的，并且在存在蛋白酶抑制剂的情况下定位于er内腔中，并且在停止接触(例如，撤消蛋白酶抑制剂)后，分泌型效应分子从er定位标签上切割下，变得可溶于er内腔中，并且分泌到细胞外间隙中。
[0125]
在某些实施方案中，蛋白酶衍生自hcv ns3，并且蛋白酶抑制剂选自imeprevir、丹诺普韦、阿舒瑞韦、格拉瑞韦、西咪匹韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利普韦、特拉匹韦及它们的任何组合。所述方法可以在体外或离体(例如，在培养的细胞中)或体内(例如，在治疗背景下的个体(例如，接受本公开的基于可调节细胞的疗法的个体)中)进行。在一些实施方案中，调节感兴趣的蛋白质的细胞定位的方法还包括当不再需要将感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中时停止所述接触。
[0126]
在一些实施方案中，提供了向有需要的个体施用基于可调节细胞的疗法(例如，基于car t细胞的疗法)的方法。在一些实施方案中，有需要的个体患有癌症，并且感兴趣的蛋白质(例如car)结合癌细胞表面上的分子。向个体施用基于可调节细胞的疗法的方法包括向个体施用药物组合物，所述药物组合物包含在不存在蛋白酶抑制剂的情况下从感兴趣的细胞表面受体蛋白质上切割下蛋白质定位标签后在细胞表面上可调节地表达本公开的感兴趣的细胞表面受体蛋白质(car、tcr等)中的任一者的细胞。药物组合物通常包含治疗有
效量的如上文所述的此类细胞。所述细胞可以是能够实现所需疗法的任何细胞。在一些实施方案中，所述细胞是免疫细胞。可以施用的免疫细胞的非限制性实例包括t细胞、b细胞、天然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。在某些实施方案中，所述细胞是t细胞。根据一些实施方案，所述细胞是t细胞并且所述感兴趣的蛋白质是car，使得所述细胞是car t细胞。在某些实施方案中，细胞是干细胞，例如胚胎干细胞或成体干细胞。在一些实施方案中，药物组合物是通过包括从个体中取出细胞并将所需核酸或表达载体引入所取出的细胞或其后代的方法产生的自体组合物。
[0127]
向个体施用基于可调节细胞的疗法的方法还可以包括当需要将感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中时，使所施用的细胞或其后代与蛋白酶抑制剂接触，其中所述接触包括向所述个体施用蛋白酶抑制剂。由于多种原因，可能需要将感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中。例如，在其中感兴趣的蛋白质是car的car t细胞的情况下，car保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中(与在细胞表面上表达和功能/活性相反)对于预防或延迟由car活性引起的细胞耗竭(例如，t细胞耗竭)的开始可能是期望的。因此，可以施用蛋白酶抑制剂以预防或延迟由car活性引起的细胞耗竭的开始。作为另一个实例，为了减少由细胞或其后代引起的不良副作用(例如，与在细胞或其后代表面上表达的car的活性相关的副作用)，可能需要car保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中。
[0128]
使所施用的细胞或其后代与蛋白酶抑制剂接触可以包括向所述个体施用可有效抑制蛋白酶的量的抑制剂。仅作为一个实例，当蛋白酶源自如本文别处所述的hcv ns3时，所述接触可以包括通过合适的施用途径向个体施用可有效抑制由所施用的细胞或其后代表达的蛋白酶的量的西咪匹韦、丹诺普韦、阿舒瑞韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利普韦、特拉匹韦、格拉瑞韦或它们的任何组合。根据向个体施用基于可调节细胞的疗法的方法，可以在向所述个体施用药物组合物之前、同时(即共同施用)和/或之后向所述个体施用蛋白酶抑制剂。
[0129]
向个体施用基于可调节细胞的疗法的方法还可以包括当不再需要感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中时停止施用蛋白酶抑制剂。
[0130]
在一些实施方案中，以产生以下受体(例如car)激活谱(activation profile)的这样的方式调节蛋白酶抑制剂的施用：(1)促进包含受体的细胞(例如，car-t细胞)的持久性；(2)促进记忆t细胞(t
mem
)、t记忆干细胞(t
scm
)、中央记忆t细胞(t
cm
)和/或效应记忆t细胞(t
em
)的形成；(3)促进t细胞的长期功能和增殖潜力；和/或减少t细胞的激活诱导的细胞死亡(aicd)。提供具有休止期的car-t细胞的有益效果描述于例如viaud等人(2018)pnas 115(46):e10898-e10906中。
[0131]
根据施用基于可调节细胞的疗法(例如，基于car t细胞的疗法)的方法，所述方法可以包括在阻止蛋白酶抑制剂以允许细胞表面受体在个体中的细胞或其后代上进行细胞表面表达(和活性/信号传导)的条件下向个体施用药物组合物，并且随后当不再需要细胞表面受体在细胞或其后代上进行细胞表面表达(和活性/信号传导)时施用蛋白酶抑制剂。由于一个或多个原因，可能不再需要细胞表面表达(和活性/信号传导)。例如，可能不再需要在t细胞表面上表达car以延迟或防止由car信号传导引起的细胞耗竭。因此，所述方法可
以包括施用蛋白酶抑制剂以延迟或防止由car活性引起的细胞耗竭。在一些实施方案中，由car的细胞表面表达引起的t细胞耗竭可能是由于抗原非依赖性增强信号传导和/或通过抗原接合的延长的抗原依赖性信号传导。可替代地或另外地，car的细胞表面表达可能因为由细胞或其后代引起的不良副作用而不再是期望的，使得所述方法可以包括施用蛋白酶抑制剂以减少由细胞或其后代引起的不良副作用。不良副作用可以包括但不限于肿瘤外效应(例如，car的中靶、肿瘤外活性)、由例如不受限制的抗原驱动的细胞增殖引起的毒性等。这种毒性可以包括细胞因子释放综合征和/或神经毒性。因此，在一些实施方案中，所述方法还可以包括施用蛋白酶抑制剂以减少由细胞或其后代引起的不良副作用。
[0132]
在一些实施方案中，调节受体(例如car)的细胞表面表达以优化包含受体的细胞(例如，car t细胞)的激活谱。优化激活谱可用于例如保持高功能性和持久性。例如，就car t细胞而言，“始终在”car-t细胞上可能倾向于具有较高分数的短寿效应t细胞亚群，然而调节性car-t细胞可以被微调使得它们具有较高分数的长寿记忆t细胞亚群。在它们的生产期间，调节性car t细胞也可能比未调节的car-t细胞经历更多轮的扩增。
[0133]
在一些实施方案中，通过选择具有特定“强度”的蛋白酶切割位点(其中“较强的”切割位点被蛋白酶切割比“较弱的”切割位点被蛋白酶切割更有效)、向个体施用的蛋白酶抑制剂的量或它们的组合来微调受体的细胞表面表达的量。举例来说，当蛋白酶源自hcv ns3时，具有不同强度的蛋白酶切割位点的非限制性实例是包含seq id no:31-35中所示的氨基酸序列的那些。
[0134]
当蛋白酶源自hcv ns3时，向个体施用基于可调节细胞的疗法的方法可以包括当需要感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中时，施用有效量的蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂选自imeprevir、丹诺普韦、阿舒瑞韦、格拉瑞韦、西咪匹韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利普韦、特拉匹韦及它们的任何组合。
[0135]
向个体施用基于可调节细胞的疗法的方法还可以包括产生药物组合物。产生药物组合物可以包括将本公开的表达载体引入从个体获得的细胞或其后代中(例如，以产生自体组合物)或引入从供体获得的细胞中(例如，以产生同种异体组合物)。
[0136]
试剂盒
[0137]
本公开还提供试剂盒。在某些实施方案中，提供了试剂盒，所述试剂盒包含本公开的任何核酸和/或表达载体、以及用于将核酸或表达载体引入细胞中的说明书。根据一些实施方案，当表达载体编码不包含蛋白酶(反式构型)的重组多肽时，表达载体还编码蛋白酶。在某些实施方案中，表达载体被配置成从相同的启动子表达重组多肽和蛋白酶。例如，表达载体可以是双顺反子表达载体，用于在细胞中在相同启动子下表达单独的重组多肽和蛋白酶分子。
[0138]
试剂盒可用于多种体外、离体和体内应用。此类试剂盒的说明书还可以包括用于调节感兴趣的蛋白质的细胞定位的说明书。例如，此类试剂盒的说明书还可以包括含当需要将感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中时使细胞或其后代与蛋白酶抑制剂接触的说明书。此类试剂盒的说明书还可以包括当不再需要将感兴趣的蛋白质保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中时停止所述接触的说明书。
[0139]
本公开的试剂盒还可以包含可用于调节细胞表面受体信号传导的任何其他试剂，诸如可用于将核酸或表达载体引入感兴趣的细胞(例如，免疫细胞(例如t细胞)或其他感兴
趣的细胞)中的转染/转导试剂。
[0140]
在一些实施方案中，试剂盒还包含蛋白酶抑制剂。例如，当使用如本文别处所述的源自hcv ns3的蛋白酶时，试剂盒可以包含合适的蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂包括但不限于imeprevir、丹诺普韦、阿舒瑞韦、格拉瑞韦、西咪匹韦、西鲁瑞韦、波普瑞韦、索伐瑞韦、帕利普韦、特拉匹韦或它们的任何组合。
[0141]
试剂盒的组分可以存在于不同容器中，或者多个组分可以存在于单一容器中。合适的容器包括单管(例如，小瓶)、板的一个或多个孔(例如，96孔板、384孔板等)等。
[0142]
试剂盒的说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在基材上，如纸或塑料等。因此，说明书可以作为包装说明书存在于试剂盒中、在试剂盒的容器或其组分的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。在其他实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，例如，便携式闪存驱动器、dvd、cd-rom、磁盘等。在另外其他实施方案中，试剂盒中不存在实际的说明书，但提供了从远程来源，例如通过因特网获得说明书的方式。该实施方案的一个实例是包括网址的试剂盒，在该网址上可以查看说明书和/或可以从该网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
[0143]
以下实施例以说明性方式而不是以限制性方式提供。
[0144]
实验
[0145]
实施例1-细胞表面受体的可调节细胞定位
[0146]
在该实施例中，测试了其中感兴趣的蛋白质是car并且重组多肽包含蛋白酶切割位点、蛋白酶和蛋白质定位标签(有时在本文中称为“stash标签”)的重组多肽调节car的细胞定位的能力。重组多肽如图1小图a中示意性地示出，但不包括绿色荧光蛋白(gfp)结构域。
[0147]
图2示出了显示针对具有各种保留信号并在存在( )或不存在(-)hcv ns3蛋白酶抑制剂(3μm格拉瑞韦)的情况下测试的一组b7h3 car-stash设计通过流式细胞术对原代人t细胞上的car表面分子的定量的图。使用荧光标记的b7h3-fc对表面car分子染色。命名为“95”、“96”、“97”和“98”的重组多肽分别包含seq id no:36、37、38和39中所示的氨基酸序列。如图2所示，与存在蛋白酶抑制剂相比，在不存在蛋白酶抑制剂的情况下car的细胞表面表达显著更高。换句话说，在存在蛋白酶抑制剂的情况下，减少的定位标签切割使得car保留在由蛋白质定位标签确定的细胞区室中，然而在不存在抑制剂的情况下，蛋白质定位标签从car上切割下，从而使得car能够在细胞表面表达。
[0148]
图3小图a中示出了显示针对在存在( )或不存在(-)hcv ns3蛋白酶抑制剂(3μm格拉瑞韦)的情况下测试的b7h3 car-smash和b7h3 car-stash(er)通过流式细胞术对原代人t细胞上的car表面分子的定量的图。使用荧光标记的b7h3-fc对car表面分子染色。“smash”意指car用包含蛋白酶、降解决定子(degron)(如果不从car切割指导car降解的序列)和位于car与降解决定子之间的蛋白酶切割位点的标签标记。参见国际申请号pct/us2019/040572。图3小图b中示出了显示与药物(3μm格拉瑞韦)一起孵育不同时间长度后b7h3 car表面表达降低的图。
[0149]
数据证明了具有er保留标签的car构建体在不存在药物的情况下表现出高表面表达，在存在药物的情况下表现出低表面表达，并且在添加药物后表现出快速降低的表面表
达。
[0150]
实施例2-通过荧光显微术和流式细胞术确定的car定位
[0151]
在该实施例中，通过荧光显微术可视化其中感兴趣的蛋白质是car并且重组多肽包含荧光报告子(gfp)结构域和stash标签(如图4小图a中示意性示出)的重组多肽。图4小图b是用定位于各种细胞区室的荧光标记的蛋白质标记的293t细胞的示意图。
[0152]
图5显示了用b7h3-stash(er)转导并在不存在(-药物)或存在( 药物)3μm格拉瑞韦的情况下孵育的293t细胞的显微术图像。从图像中可以看出，用gfp(绿色)标记的b7h3-stash er分子在不存在药物的情况下主要在细胞表面上表达，然而car分子在存在药物的情况下主要储存在细胞内区室中。
[0153]
接下来，使用流式细胞术评估在不存在蛋白酶抑制剂的情况下car分子的细胞内保留(而不是降解)。图6小图a是显示定位于表面或细胞内的car-gfp-stash分子及其对应染色的示意图，其中“ ”表示阳性染色并且
“‑”
表示阴性染色。图6小图b是与药物(3μm格拉瑞韦)一起孵育不同时间量的b7h3-car-stash t细胞的流式细胞术数据的定量图。从图中可以看出，car表面染色在与药物一起孵育后减弱，然而不管gfp的定位如何都可以检测到的gfp信号保持相对恒定。这些数据表明car分子在与药物一起孵育后保留在细胞内，而不仅仅被降解。
[0154]
实施例3-stash car-t细胞在与肿瘤细胞一起共培养期间分泌ifnγ
[0155]
图7小图a中示出了显示还表达b7h3抗原的表达gfp的d425髓母细胞瘤细胞的gfp荧光的图。将肿瘤细胞在存在( 药物)或不存在(-药物)3μm格拉瑞韦的情况下与b7h3-car-stash t细胞一起共培养。b7h3-car-stash t细胞的细胞毒性能力可以通过添加药物来控制，如通过肿瘤gfp荧光所确定。缺乏stash标签的组成型b7h3 car t细胞和模拟物未转导的t细胞分别用作阳性和阴性对照。
[0156]
图7小图b中示出了显示从图7小图a中所述的共培养物获取的共培养物上清液中的干扰素γ(ifnγ)水平的定量。从在小图b中可以看出，共培养物中分泌的ifnγ的水平可以通过添加药物来控制。
[0157]
因此，以上仅说明本公开的原理。应当理解的是，本领域技术人员能够设计各种布置，尽管未在本文明确描述或示出，但所述各种布置体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域的发展而贡献的概念，并且被解释为不限于这些具体列举的实例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，预期此类等同物包括当前已知的等同物以及未来开发的等同物，即，开发的不论结构如何执行相同功能的任何要素。因此，本发明的范围并不旨在限于本文示出和描述的示范性实施方案。