菰黑粉菌T-DNA突变体库的构建和插入位点分析方法

菰黑粉菌t-dna突变体库的构建和插入位点分析方法
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及菰黑粉菌t-dna突变体库的构建和插入位点分析方法。


背景技术：

2.菰黑粉菌（ustilago esculenta）属于担子菌门黑粉菌纲黑粉菌科，其侵染菰草（zizania latifolia）导致茎部组织细胞大量增殖膨大，最终形成可食用的茭白。茭白是我国的第二大水生蔬菜，其不仅味道鲜美，还含有丰富的蛋白质、维生素、粗纤维等，具有较高的营养价值和药用价值。然而，在茭白的种植过程中，由于栽培管理措施的不当、品种退化和外界环境条件的影响，田间经常出现不可孕茭的雄茭，严重影响了茭白的产量。研究认为，菰黑粉菌的侵染能力减弱或者丧失是造成田间雄茭形成的重要原因。因此，亟需对菰黑粉菌侵染能力的分子调控机制进行研究。目前，构建病原菌功能缺失突变体库是研究病原菌致病分子机理的有效手段，但菰黑粉菌中尚未见有相关报道。所以，构建并筛选分析菰黑粉菌功能缺失突变体库对研究其侵染能力的分子调控机制具有重要意义。
3.菰黑粉菌是典型的二型态真菌（dimorphism），其营养体可以在单倍体酵母型（yeast form）和二倍体菌丝型（mycelium form）两种形态间转换，只有通过有性配合，其才能从不致病的酵母型才能融合转变为具有侵染能力的二倍体菌丝型。说明菰黑粉菌的二形态转变与侵染能力紧密相关。在同为四极性异宗配合且与菰黑粉菌亲缘关系较近的玉米黑粉菌（u. maydis）中，关于二型态转换融合的分子机制有较为深入的研究。研究结果表明，玉米黑粉菌的有性配合过程由交配型位点a和b控制，a位点主要编码信息素基因（mfa1和mfa2）和信息素受体基因（pra1和pra2），负责不同交配型菌株的识别；b位点编码的基因主要参与调控细胞周期、有丝分裂和dna复制，负责二倍体菌丝生长和侵染能力的维持。而这种有性配合的信号传递则被证明受到丝裂原活化蛋白激酶（mapk）途径和环腺苷酸-蛋白酶（camp/pka）信号通路调控。转录因子prf1则可以整合mapk和camp/pka两个通路的信号，并且通过变换自身的磷酸化位点来调控不同的转录反应，从而影响单倍体的融合和二倍体菌丝的生长。虽然mapk和camp/pka两个信号通路的部分基因在菰黑粉菌中已被验证参与调控二型态转换的过程，但是二型态转换过程中的分子机理尚不明确，以及该过程中是否还有其它信号通路和基因参与调控和整个二型态调控的网络仍有待进一步解析。根癌农杆菌介导的遗传转化技术（agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, atmt）是一种有效介导真菌遗传转化的方法。根癌农杆菌可以将自身tumor-inducing（ti）质粒的一段dna（t-dna）随机插入到真菌的基因组中，从而导致基因的突变。atmt的方法转化真菌具有受体材料限制性较小和转化效率高的优点，受体可以是原生质体、菌丝或者分生孢子，并且实验证明其转化效率比常规的原生质体转化方法高出百倍以上。目前，atmt的方法已经被报道成功应用于酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）、稻瘟菌（magnaportheoryzae）、粗糙脉孢霉（neurospora crassa）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）等100余种真菌的遗传转化。基于t-dna突变体库，大量植物病原真菌的生长和致病相关基因被发现和研究，为真
菌生长和致病分子机理研究提供了理论支持。因此，基于atmt方法构建t-dna突变体库，已成为研究真菌基因功能的重要方法之一。
4.由于菰黑粉菌属于典型的四极性异宗配合真菌，需要两种不同交配型的单倍体菌株才能融合形成双核的二倍体菌丝。这极大地增加了突变体库的筛选难度。因此，本发明前期通过在一个单倍型菰黑粉菌中表达另一种交配型单倍体菌株的a、b遗传交配型位点基因，获得了菰黑粉菌自融合菌株tsp。为研究菰黑粉菌二型态转换的调控机制提供了很好的材料。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供菰黑粉菌t-dna突变体库的构建和插入位点分析方法的技术方案。
6.本发明具体通过以下技术方案实现：所述的菰黑粉菌t-dna突变体库的构建和插入位点分析方法，其包括以下步骤：1）从含50 μg/ml的利福平、卡那霉素和链霉素的三抗lb平板上挑取农杆菌单菌落接种于1ml三抗lb液体培养基中，于28℃、180rpm/min振荡培养2d后，按照1:100的比例重新接种于含100 μg/ml的as 的im液体培养基中，继续震荡培养5h，至农杆菌od
600
为0.3-0.5，备用；2）将液体摇培的菰黑粉菌tsp于2000 rpm/min离心收集菌体，并用无菌水洗涤3次，用血球计数板计数，调节浓度，将步骤1）中诱导培养后的农杆菌与菰黑粉菌tsp悬浮液1：1混匀，取100μl的混合液均匀涂布于含有as的固体co-im培养基上，于28℃黑暗下培养；3）将co-im培养基上所长出的菌体用300μl无菌蒸馏水洗下，涂布于到含有g418的yeps平板上，吹干，28℃培养2-5d，直至平板上长出转化子菌落，将转化子分别转移到新的含有g418的yeps平板上，继代培养2-3d后，构建得到菰黑粉菌t-dna突变体库；4）取步骤3）构建得到的突变体菌株进行插入位点分析。
7.进一步，所述的步骤1）中农杆菌为农杆菌eha105，带有双元载体pneo3300，该质粒携带遗传霉素g418抗性基因。
8.进一步，所述的步骤1）中as浓度为100μg/ml。
9.进一步，所述的步骤1）中农杆菌培养至浓度od
600
为0.3。
10.进一步，所述的步骤2）中菰黑粉菌tsp悬浮液中芽孢子浓度为1
×
105个/ml。
11.进一步，所述的步骤2）中农杆菌与菰黑粉菌tsp共培养时间为24h。
12.进一步，所述的步骤3）中g418浓度为75μg/ml。
13.进一步，所述的步骤4）中插入位点分析步骤为：a取步骤3）构建得到的突变体菌株的基因组dna经过琼脂糖凝胶电泳和nanodrop检测合格后，使用covaris超声波破碎仪随机打断成350 bp的片段，再经末端修复、加a尾、加测序接头、纯化、pcr扩增步骤完成整个文库制备工作；b使用illumina pe150平台novaseq 6000对各个菌株的文库进行测序，对获得的下机数据进行低质量数据去除和接头去除，生成cleandata进行下一步分析，使用pandaseq软件对双端测序的reads进行拼接，然后将拼接完成的reads与插入的载体pneo3300序列用blastn进行比对，在比对结果中筛选出5’端或者3’端部分比对到载体序列的reads，再把这
些reads与菰黑粉菌基因组进行比对，找到其在基因组scaffold上的位置，确定插入位点，再针对插入位点的上下游序列，分析该位点的相关基因。
14.本发明以tsp为出发菌株，筛选最优的抗生素浓度、共培养时间、共培养的农杆菌浓度等条件，构建高质量的t-dna突变体库。针对性地筛选出融合和二倍体菌丝生长缺陷型突变体，并通过基因组重测序的手段明确相关突变体的t-dna插入位点。为后续菰黑粉菌二型态转换的调控机理研究奠定基础。
附图说明
15.图1不同浓度g418对菰黑粉菌tsp生长的抑制；图2as浓度对菰黑粉菌转化效率的影响；图3共培养时间对菰黑粉菌转化效率的影响；图4孢子悬浮液对菰黑粉菌转化效率的影响；图5农杆菌浓度对菰黑粉菌转化效率的影响；图6t-dna突变体的插入片段的pcr检测图7t-dna插入突变体的融合能力测定；图8融合缺陷型突变体t-dna插入位点。
具体实施方式
16.以下结合实施例来进一步说明本发明。
17.菰黑粉菌tsp为现有菌株，其在公开号为cn109136099a的中国发明中已经公开，其具体为该专利中涉及的菰黑粉菌（ustilagoesculenta）单倍体菌株uetsp，该菌株于2018年06月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为cgmccno.15929，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例
18.1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌株菰黑粉菌自融合菌株tsp由中国计量大学生物计量与检验检疫技术重点实验室构建保存。农杆菌菌株eha105，带有双元载体pneo3300，该质粒携带遗传霉素g418抗性基因。
19.1.1.2化学试剂乙酰丁香酮（acetosy-ringone，简称as）、2-（n-吗啡啉）乙磺酸（简称mes）、利福平、硫酸链霉素、硫酸卡那霉素、头孢噻肟钠、和遗传霉素（g418）均购自北京索莱宝科技有限公司；taq酶、琼脂糖及其它化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
20.1.1.3药品和培养基0.1m乙酰丁香酮：as196.2g，二甲亚砜（dmso）定容至10ml；100mg/mlmes：mes1.5g，蒸馏水定容至15ml；100mg/ml头孢霉素：头孢霉素1g，蒸馏水定容至10ml，细菌过滤器除菌；10mg/ml卡那霉素：卡那霉素1g，蒸馏水定容至10ml，细菌过滤器除菌；10mg/ml利福平：利福平1g，蒸馏水定容至10ml，细菌过滤器除菌；10mg/ml链霉素：链霉素1g，蒸馏水定
容至10ml，细菌过滤器除菌；50%甘油：250ml甘油，蒸馏水250ml；磷酸氢钾缓冲液（k-buffer）：kh2po472.5g，k2po4100g，蒸馏水定容至500ml；1%氯化钙：氯化钙1g，蒸馏水100ml；10
×
im母液：mgso4·
7h2o3g，nacl1.5g，葡萄糖：10g，kh2po4：0.58g，nh4no3：0.8g，feso4：0.002g，50%甘油：25ml，蒸馏水定容至500ml；60
×
co-im母液：mgso4·
7h2o18g，nacl9g，葡萄糖30g，kh2po43.48g，k2hpo44.8g，nh4no315g，蒸馏水定容至500ml；yeps液体培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，蔗糖20g，蒸馏水定容至1000ml；yeps固体培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，蔗糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1000ml；lb液体培养基：酵母粉5g，蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000ml；lb固体培养基：酵母粉5g，蛋白10g，氯化钠10g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1000ml；im液体培养基：10
×
im25ml，k-buffer200μl，1%氯化钙250μl，蒸馏水定容至250ml；co-im固体培养基：60
×
co-im母液2.5ml，k-buffer120μl，1%氯化钙150μl，蒸馏水定容至150ml。
21.1.2试验方法1.2.1遗传霉素g418对菰黑粉菌的抑菌浓度测定将保存的tsp菌株在yeps固体培养基上进行活化，2d后挑取单菌落进行继代培养，继续培养2d后挑取单菌落接种于50mlyeps液体培养基中进行摇瓶培养。当菌液od
600
值达到0.15后，吸取100μl分别涂布于含有不同浓度g418（0、25、50、75、100、125μg/ml）的yeps固体培养基上，每个浓度设3次重复，28℃黑暗培养，每天观察菌落生长情况。确定g418的抑菌浓度。
22.1.2.2菰黑粉菌tsp农杆菌介导转化体系的优化与突变体库构建从lb平板（利福平、卡那霉素和链霉素各浓度均为50μg/ml）上挑取农杆菌单菌落接种于1ml三抗lb液体培养基中，于28℃、180rpm/min振荡培养2d后，按照1:100的比例重新接种于im液体培养基（含100μg/ml的as）中，继续震荡培养5h，至农杆菌od
600
为0.3-0.5左右备用。将液体摇培的菰黑粉菌于2000rpm/min离心收集菌体，并用无菌水洗涤3次，用血球计数板计数，调节浓度。将诱导培养后的农杆菌与制备好的菰黑粉菌悬浮液1：1混匀，取100μl的混合液均匀涂布于含有as的固体co-im培养基上，于28℃黑暗下培养。将co-im培养基上所长出的菌体用300μl无菌蒸馏水洗下，涂布于到含有浓度为75μg/mlg418的yeps平板上，吹干，28℃培养2-5d，直至平板上长出转化子菌落。将转化子分别转移到新的含有浓度为75μg/mlg418的yeps平板上，继代培养2-3d后进行菌种保藏，保存于-80℃。
23.按照上述方法进行转化，并对其转化条件进行单因素条件试验，其中包括as浓度（0，100，200，300，400，500μmol/ml）、共培养时间（24，36，48，60，72h）和菰黑粉菌孢子悬浮液浓度（104，105，106，107，108，109个/ml）等影响因子。每个处理重复3次，并采用lsd法进行差异显著性分析。并按筛选到的最优条件进行突变体库的构建。
24.1.2.3菰黑粉菌转化子的pcr鉴定和融合能力测定随机挑选7个菰黑粉菌转化子接种到不含有g418的yeps平板上，培养2d后转到另一个不含g418的yeps平板上，如此培养5代后，再转移至含有浓度为75μg/mlg418的抗性yeps平板上，观察其生长情况。并用真菌基因组提取试剂盒提取7个转化子和tsp菌株的基因组dna。以tsp菌株的基因组dna为阴性对照，以质粒pneo3300为阳性对照，用g418抗性基因（氨基糖苷磷酸转移酶基因，neo基因）的特异性引物（neo检测f：5
’‑
ggtgccctgaatgaactcc-3’；neo检测r：5
’‑
atatcacgggtagccaacg-3’）进行pcr扩增，扩增体
系为25μl，dna或者质粒100ng，10μm的上下游引物，greentaqmix12.5μl，加ddh2o至25μl，扩增程序：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃30s，34个循环；72℃5min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物，染色并拍照，将对应的pcr产物送杭州有康生物科技有限公司进行测序。
25.将tsp菌株和转化子用液体yeps培养基在28℃，180rpm/min摇培至od
600
=0.8，离心收集并用yeps液体培养基重悬至0d
600
=2.0，取2μl稀释的菌液在yeps固体平板上点样，设置3个重复，28℃下黑暗培养。每隔12h进行取样并在光学显微镜和体视显微镜下观察单倍体的融合和二倍体菌丝的生长情况。
26.1.2.4转化子的基因组重测序与插入位点分析突变体菌株的基因组dna经过琼脂糖凝胶电泳和nanodrop检测合格后，使用covaris超声波破碎仪随机打断成350bp的片段，再经末端修复、加a尾、加测序接头、纯化、pcr扩增等步骤完成整个文库制备工作（具体采用nebnextultraiidnalibraryprepkitforillumina试剂盒完成）。使用illuminape150平台novaseq6000对各个菌株的文库进行测序。对获得的下机数据（rawdata）进行低质量数据去除和接头去除，生成cleandata进行下一步分析。使用pandaseq软件对双端测序的reads进行拼接，然后将拼接完成的reads与插入的载体pneo3300序列用blastn（ncbi-blast （2.9.0-3））进行比对（e-value《1e-5）。在比对结果中筛选出5’端或者3’端部分比对到载体序列的reads，再把这些reads与菰黑粉菌基因组进行比对，找到其在基因组scaffold上的位置，确定插入位点，再针对插入位点的上下游序列，分析该位点的相关基因。
27.2结果2.1供试菌株对抗生素敏感性的测定结果菰黑粉菌tsp在含有不同浓度g418的yeps培养基上培养后，其生长受到了不同程度的抑制（图1）。当g418浓度为0时，菰黑粉菌培养4天后菌落已覆盖全皿；当g418浓度在25μg/ml时，菌株生产受到明显的抑制；而在g418浓度在75μg/ml及以上时，菰黑粉菌的生长被完全抑制。因此，本发明以75μg/mlg418为抗生素筛选浓度。
28.2.2农杆菌介导转化体系的优化2.2.1最佳as浓度筛选as作为atmt体系中农杆菌侵染重要的诱导剂，是激活农杆菌进行侵染转化的关键。因此通过设置0、100、200、300、400、500μg/ml的as浓度梯度筛选最适的转化as浓度。研究结果表明，在共培养阶段不添加as，转化子数量为0（图2a）。随着as浓度的逐渐增加，转化效率明显增高，最后在筛选培养平板上长出的转化子菌落面积比例（菌落面积/培养平板面积
×
100%）也相应增大。在as浓度达到400μg/ml以上时，菌落面积比例达到83%以上（图2b）。但是，当一个平板上转化子数量增长到一定程度时，菌落过于密集而相互黏连，从而无法挑取单个菌落。当as浓度为100μg/ml时，可以在一个平板上挑取单菌落的个数达到800个以上，效率最高。因此，在菰粉菌atmt转化体系中，选取100μg/ml的as作为最佳浓度。
29.2.2.2最佳共培养时间筛选共培养时间是atmt中的重要转化条件，因此通过设置12、24、36、48、60、72h的共培养时间梯度来筛选最适合的共培养时间。研究结果表明，随着共培养时间的逐渐增长，转化子菌落面积比例逐渐增加，且在36h时的菌落面积比例就达到了53.27%（图3），出现了大量
菌落黏连的情况。在24h时，可以挑取的单菌落数量最多，达到每个平板700个以上。因此，在菰黑粉菌atmt转化体系中，选取24h为最佳培养浓度。
30.2.2.3最佳共培养芽孢子浓度的筛选在进行atmt转化时，用于转化的菰黑粉菌芽孢子浓度是影响转化效率的重要因素之一。设置不同的芽孢子浓度梯度（1
×
104个/ml、1
×
105个/ml、1
×
106个/ml、1
×
107个/ml、1
×
108个/ml、1
×
109个/ml）进行最佳浓度筛选，如图4。当孢子浓度达到1
×
106个/ml时，菌落面积比例就达到65%，此时的菌落黏连，可挑取的单菌落数量只有50个左右。随着浓度增加，菌落面积比例逐渐升高，基本无法挑取单菌落。而当芽孢子浓度为1
×
105个/ml时，可以挑取的单菌落数量达到800个以上，效率最高。因此，综上所述，在菰黑粉菌atmt转化体系中，选取1
×
105个/ml为最佳芽孢子浓度。
31.2.2.4最佳共培养农杆菌浓度的筛选在atmt转化过程中，农杆菌的浓度同样对对菰黑粉菌转化效率起着重要的作用。因此设置了不同的农杆菌浓度（od
600
=0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1）来进行最佳筛选。当农杆菌od
600
达到0.5时，此时的菌落面积占比达到了66%，随着农杆菌od
600
逐渐升高，菌落面积占比逐渐升高，在od
600
=1.1时，菌落面积占比甚至达到了96%（图5b），无法挑取单菌落。而在农杆菌od
600
=0.3时，可用来挑取的单菌落数量有644个左右（图5a），表明农杆菌在此浓度下，菰黑粉菌的转化效率最高。因此，在菰黑粉菌atmt转化体系中，选取od
600
=0.3为最佳农杆菌浓度。
32.2.3菰黑粉菌转化子生物学性状的测定2.3.1转化子t-dna插入片段及其遗传稳定性的检测以筛选到的最优条件组合对菰黑粉菌进行atmt转化，从获得的转化子中随机选取7个转化子，活化之后，在yeps固体平板上继代培养10次。提取相应转化的基因组dna，用pcr检测基因组上插入的抗性靶标基因片段。结果表明，7个转化子和载体质粒（阳性对照）均扩增出856bp的目标条带，而野生菌株tsp中没有扩增到目标条带（图6）。这表明外源t-dna片段成功插入到tsp菌株的基因组中，且可以稳定遗传。
33.2.3.2转化子自融合能力筛选针对获得的部分转化子（184个）进行自融合能力测定。将活化的tsp菌株和转化子用yeps液体培养基进行摇培，收集菌体并将芽孢子浓度调整为od
600
=2.0，吸取10μl的芽孢子液，点在yeps固体培养基上，观察其融合情况。结果表明，其中培养3d后，tsp菌株的边缘长出了明显的菌丝，而其中5个转化子tsp-1、tsp-3、tsp-5、tsp-15和tsp-23菌落边缘没有形成菌丝，说明这5个转化子自融合形成菌丝的能力丧失（图7）。2.3.3基因组重测序解析转化子的t-dna插入位点为了验证t-dna插入的拷贝数和插入位点，对其中两个自融合缺陷型转化子（tsp-1和tsp-23）进行基因组重测序，分别获得1.23gb（tsp-1）和1.53gb（tsp-23）的cleandata。将拼接后的reads与pneo3300载体序列进行blastn比对。比对结果显示，两个转化子均为单拷贝插入，其中tsp-1插入位点位于其交配型位点（genbank:mk097140.1）mfa2.1基因的外显子区域（图8a）；tsp-23的插入位点位于scaffold8的8800bp左右，基因预测结果显示其位于两个假定蛋白基因之间（图8b）。
34.讨论
菰黑粉菌是一种典型的二型态异宗结合真菌，异质单倍体能相互交配融合生成双核菌丝。而双核菌丝是菰黑粉菌侵染茭白植株形成膨大可食用肉质茎的关键。因此，明确菰黑粉菌交配融合形成双核菌丝的分子调控机制对于研究茭白形成具有重要意义。基于atmt技术的真菌t-dna插入突变体库构建是真菌中广泛应用的基因功能研究手段。目前在菰黑粉菌中尚未见相关t-dna插入突变体库构建的报道。但是，由于菰黑粉菌的异宗结合特性，分别构建两种交配型菌株的突变体库，再将两个库的突变体进行配对融合筛选，在筛选工作量和插入位点分析等方面具有很大的难度。而本研究创新性地使用人工改造的自融合菌株tsp来构建突变体库，极大地简化了筛选工作，并且单倍体的状态更加容易进行插入位点的分析。
35.在突变体库构建方面，由于tsp菌株在人工改造时引入了潮霉素抗性，因此在突变体库构建时使用遗传霉素g418为抗性标记。本发明中，对菰黑粉菌的g418抑制浓度、共培养时间、as浓度、菰黑粉菌芽孢子浓度以及农杆菌浓度这些atmt转化过程中的重要条件参数进行筛选，综合转化效率和单菌落获得概率，得到g418浓度75μg/ml、as浓度100μg/ml、共培养时间24h、芽孢子浓度1
×
105个/ml以及农杆菌浓度od
600
=0.3优化了的最佳转化条件。通过对获得的部分转化子进行融合能力测定，筛选到5株融合缺陷型转化子，并采取二代测序的方法对其中的2个转化子进行基因组重测序。在测序结果的reads中找到同时含有插入片段和菰黑粉菌基因组片段的reads，再与野生型菌株的基因组进行比对，就可以确定t-dna插入位点以及拷贝数。这相比于通过southern杂交结合tail-pcr确定插入拷贝数和插入位点的方法具有快速、准确和稳定的优点。
36.在tsp-1转化子中发现t-dna插入在mfa2.1基因的外显子区域，而mfa2.1基因已被证明调控菰黑粉菌的融合，这说明本研究构建的t-dna插入突变体库在基因功能研究方面具有较高的可信度。另一个转化子tsp-23的t-dna插入在两个假定蛋白基因间的非编码区，推测有可能影响到了相关基因的表达，后续需要通过qrt-pcr来验证基因的表达量。综上所述，本发明明确了构建菰黑粉菌t-dna突变体库最优条件，并正在进一步扩大菰黑粉菌t-dna插入突变体库，为进一步探索菰黑粉菌融合相关基因功能和分子调控机制打下了基础。
37.3结论本发明优化了菰黑粉菌的atmt遗传转化体系，构建了菰黑粉菌的突变体库，且得到了稳定遗传的突变株。随机挑取部分转化子进行融合能力测定，获得了菰黑粉菌自融合缺陷型转化子，并通过基因组重测序确定了其中两株转化子t-dna的插入位点，为后续菰黑粉菌二型态转换的调控机理研究奠定了一定的基础。