免疫组化染色的质控方法和质控品与流程

1.本发明涉及病理学检查领域，更具体地，涉及一种免疫组化染色的质控方法和质控品。


背景技术：

2.免疫组化染色是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。免疫组化染色在外科病理学以及其他形态学领域的应用越来越广泛，已成为病理学中疾病诊断不可或缺的工具。
3.免疫组化染色操作质量的好坏直接影响病理的诊断结果，因此，质量控制是检验免疫组化操作质量的必备程序，也是保证检测结果准确性的前提条件。实验室内或各实验室间为了监测和评价本室或室间工作质量，以决定检验报告能否发出所采取的一系列检查、控制手段称为室内/室间免疫组化染色的质控方法。
4.现有技术中，标准化的质控品，对于一般性的血液检测方法来说，已经非常广泛和普及了，但是，对于组织学样本检测的质控品，目前在临床应用中比较少见，且现有质控方法仅给出阴性或阳性的结果，缺乏定量性评价，不仅评价结果不准确，而且不能判断是何种原因导致的操作不当，不利于改进操作过程。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种免疫组化染色的质控方法和质控品，改善免疫组化染色的质控质量。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
7.一种免疫组化染色的质控方法，包括以下过程：
8.获得动物或可商业化的器官或组织，用所述器官或组织制作质控蜡块，对所述质控蜡块进行切片得质控片，所述质控片包括至少两种不同增殖细胞抗原密度的部位；
9.将待检人样本与所述质控片同步进行免疫组化染色，分别获取免疫组化后的所述待检人样本的病理图像和所述质控片的质控图像；
10.从所述质控图像中提取至少两种不同增殖细胞抗原密度的所述部位的增殖细胞抗原指数；
11.将各所述部位的所述增殖细胞抗原指数分别与其对应的增殖细胞抗原标准指数进行比较，判断所述免疫组化染色的质量。
12.本发明还提供了免疫组化染色的质控品，包括质控片，所述质控片为用动物或可商业化的器官或组织制作质控蜡块，对所述质控蜡块进行切片获得，所述质控片包括至少两种不同增殖细胞抗原密度的部位。
13.实施本发明实施例，将具有如下有益效果：
14.免疫组化过程中，分别采用不同颜色标记正常抗原(即未发生增殖分裂的细胞抗原)和增殖细胞抗原，增殖细胞抗原指数表示增殖细胞抗原占抗原总数量的比值，抗原总数量等于正常抗原和增殖细胞抗原的总和。从质控图像中提取增殖细胞抗原指数的过程，即为识别不同颜色标记的正常抗原和增殖细胞抗原的过程，若识别的增殖细胞抗原指数与该部位对应的增殖细胞抗原标准指数相近(在一定误差允许范围内)，则判断对正常抗原和增殖细胞抗原的染色均是合格的，且识别数量的过程(包括人工肉眼识别和计算机ai识别)也是合格的。
15.增殖细胞抗原的密度决定了增殖细胞抗原颜色点的密度值，颜色点的密度直接影响增殖细胞抗原指数，若染色过深，则会使提取的增殖细胞抗原指数较增殖细胞抗原标准指数偏大，对于密度大的组织或部位，则会使得到的增殖细胞抗原指数更加偏离增殖细胞抗原标准指数，若染色过浅，则会使提取的增殖细胞抗原指数较增殖细胞抗原标准指数偏小，对于密度小的组织或部位，则会使得到的增殖细胞抗原指数更加偏离增殖细胞抗原标准指数，本发明通过提取至少两种不同增殖细胞抗原密度的部位的增殖细胞抗原指数，分别与其对应的标准指数进行比较，可以准确评价染色深浅是否合格。若不同增殖细胞抗原密度的指数均与对应的标准指数相近，则不仅判断染色深浅是合格的，而且判断对正常抗原和增殖细胞抗原的染色以及识别数量的过程均是合格的。
16.另，增殖细胞抗原指数是一个定量的数值，能够反应出其偏离标准指数的幅度，根据其偏离标准指数的幅度可以给出例如优、良、差等不同等级的质控评价，能够定量评价质控质量，而且根据标准指数的偏离幅度还可以知晓染色不合格的原因，便于操作人员对操作过程进行改进。现有技术多采用阳性或阴性评价质控质量，缺乏定量性评价，不仅评价结果不准确，而且不能判断是何种原因导致的操作不当，不利于改进操作过程。
17.综上，本发明的质控方法可以更准确、更客观、更全面、更定性定量的评价免疫组化的质量，确保对待检人样本的病理图像提取的增殖细胞抗原指数是可靠的。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.其中：
20.图1是本发明一具体实施例的免疫组化染色的质控方法的流程示意图。
21.图2是本发明一具体实施例的质控蜡块的结构示意图。
22.图3是本发明一具体实施例的质控品的结构示意图。
23.图4是本发明一具体实施例的质控片染色后的质控图像的示意图。
24.图5是图4中a、b、c和d区域的增殖细胞抗原密度的示意图。
25.图6是本发明一具体实施例对ki67抗原染色后的质控图像。
26.图7是本发明一具体实施例对图6所示的质控图像采用深度学习的医学图像处理方法判读结果图。
27.图8是将图7和图6融合的结果图。
28.图9是本发明一具体实施例的m值分布图。
具体实施方式
29.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
30.参考图1，本发明公开了一种免疫组化染色的质控方法，包括以下步骤：
31.s1：获得动物或可商业化的器官或组织，用器官或组织制作质控蜡块10，参考图2，对质控蜡块进行切片得质控片20，质控片包括至少两种不同增殖细胞抗原密度的部位。
32.在本步骤中，动物或可商业化的器官或组织，动物可以包括猪、仓鼠、牛、羊等，可商业化的器官或组织可以包括克隆或体外培养的器官或组织。器官或组织可以包括肝、肺、肾、脾、大肠、小肠、阑尾、淋巴结、膀胱、胰腺、子宫、卵巢、垂体、胎衣、心脏和脑等3d类器官中的一种或多种，也可以包括肿瘤细胞模型等。本发明中的器官或组织优选为非病变的器官或组织(即工厂标准化的器官或组织的生物样本)，与标准指数比对时，数据更准确，且来源稳定。现有方案多数取材病患废弃的病理标本，来源不稳定。
33.动物或可商业化的器官或组织优选动物的小肠，因为小肠中含有多种腺体，分别具有不同的增殖细胞抗原密度，动物或可商业化的器官或组织还可以优选动物的肝脏，因为肝脏的组织结构较均匀。参考图2，在一具体实施例中，以猪的小肠11和肝脏12为生物样本，制作质控蜡块10，当然，在其它可施行的实施例中，也可以采用多种上述其它器官或组织。
34.增殖细胞抗原可以为ki67抗原、her2抗原、egfr抗原、er抗原或pd-l1等，本发明将针对病理日常临床工作中常见的ki67抗原的检测评价指标进行阐述。
35.s2：将待检人样本与质控片20同步进行免疫组化染色，分别获取免疫组化后的待检人样本的病理图像和质控片的质控图像。
36.参考图3，其为本发明一具体实施例的免疫组化染色的质控品，包括载玻片30和设置于载玻片30上的质控片20和信息标签40，载玻片30还设有用于设置待检人样本的空位，待检人样本可以是包埋待检人样本的蜡块切片，也可以是悬浮液、涂抹的分泌物等任意形式的样本。质控片20为步骤s1中提到的质控片，在此不再赘述。本发明的质控片采用工厂标准化的动物的器官或组织，不仅质检性能稳定，而且获取容易，来源稳定，成本低，可批量生产。
37.免疫组化染色的步骤通常包括：烤片、脱蜡、复水、抗原修复、pbs液清洗、去除h2o2酶、pbs液清洗、封闭、加一抗、pbs液清洗、加hrp标记的二抗、pbs液清洗、苏木素复染、脱水透明、封片等步骤。每种免疫组化染色的抗原、实验室和操作过程可能存在部分差异，以现有通用染色步骤为宜，只要保证同一载玻片上的待检人样本与质控片在完全相同的环境下进行免疫组化染色即可。
38.在本发明中，优选采用ar显微镜或wsi(全景数字病理图像)仪获得病理图像和质控图像，并采用深度学习的医学图像处理等计算机辅助识别方法从病理图像和质控图像中
提取增殖细胞抗原指数的相关信息，提高样本检测的效率。当然，也可以采用普通显微镜用肉眼观察颜色点的数量来获得增殖细胞抗原指数的信息。
39.在采用深度学习的医学图像处理方法提取信息时，机器读取颜色点，对染色的深浅提出更高的要求，机器只能读取色度处于一定范围的颜色点，颜色点过深或过浅都有不被机器识别的风险，本发明的质控方法可以确保染色深浅适当，检测结果准确。
40.s3：从质控图像中提取至少两种不同增殖细胞抗原密度的部位的增殖细胞抗原指数。
41.参考图4，其给出了质控片染色后的质控图像，右上方为小肠的染色图像，下方为肝脏的染色图像，从图像可以看到：小肠不同腺体部位的增殖细胞抗原密度不相同，肝脏组织中的增殖细胞抗原密度较均匀。从图4和图5还可以看到：增殖细胞抗原密度不同，则由颜色点构成的图像的颜色深浅也不相同，增殖细胞抗原密度大，颜色点密集，颜色深，反之，颜色点稀疏，颜色浅。
42.参考图4和图5，在一具体实施例中，至少两种不同增殖细胞抗原密度的部位至少包括增殖细胞抗原密度为50％～100％的部位和增殖细胞抗原密度为0～30％的部位，分别提取抗原密度较大和较小的部位的数据，有利于检查染色深浅是否妥当。
43.不同增殖细胞抗原密度的部位包括小肠的黏膜腺体部位(如图4和图5中的a所示)、小肠的黏膜下淋巴组织部位(如图4和图5中的b所示)、小肠的固有肌层组织部位(如图4和图5中的c所示)和肝脏组织部位(如图4和图5中的d所示)中的至少两种。小肠中含有多种腺体，分别具有不同的增殖细胞抗原密度，是优选的生物样本，肝脏的组织结构较均匀，也是优选的生物样本。通过选取不同增殖细胞抗原密度的部位来提取增殖细胞抗原指数进行校对，当不同增殖细胞抗原密度的部位的增殖细胞抗原指数均与其对应的标准指数相接近时，说明无论对于颜色点密度大或小的区域，染色深浅均是适当的。
44.具体的，以ki67抗原为例，小肠的黏膜腺体部位的ki67标准指数通常在10％～30％之间，小肠的黏膜下淋巴组织部位的ki67标准指数通常在50％～80％之间，小肠的固有肌层组织部位的ki67标准指数通常小于1％，肝脏组织部位的ki67标准指数通常在1％～10％之间。
45.在免疫组化染色过程中，分别采用不同颜色标记正常抗原(即未发生增殖分裂的细胞抗原，通常用蓝色标记)和增殖细胞抗原(通常用棕色标记)，如图6所示，增殖细胞抗原指数表示增殖细胞抗原占抗原总数量的比值，抗原总数量等于正常抗原和增殖细胞抗原的总和。
46.参考图7，其为采用深度学习的医学图像处理方法对图6所示的质控图像提取增殖细胞抗原指数得到的处理图像示意图，读取的增殖细胞抗原(ki67)指数为88％，从质控图像中提取增殖细胞抗原指数的过程，即为识别不同颜色标记的正常抗原和增殖细胞抗原的过程，若识别的增殖细胞抗原指数与该部位对应的增殖细胞抗原标准指数相近(在一定误差允许范围内)，则判断对正常抗原和增殖细胞抗原的染色均是合格的，且识别数量的过程(包括人工肉眼识别和计算机ai识别)也是合格的。
47.参考图8，将图7和图6的图像进行融合，可以看到：采用深度学习提取的如图7所示的处理图像的颜色点能够与图6所示的质控图像的颜色点很好的吻合，说明深度学习提取的增殖细胞抗原的空间位点也是可靠、准确的。
48.采用深度学习的计算机辅助判读方法提取病理图像的颜色点信息，是近年发展的病理学领域的新的ai技术，该技术能高效的准确获取病理图像的颜色点信息，本发明的质控方法可以和深度学习相兼容，提取病理图像的信息的同时也一并提取质控图像的信息，不会产生多余的质控工作，质控过程更简单。
49.s4：将各部位的增殖细胞抗原指数分别与其对应的增殖细胞抗原标准指数进行比较，如果各部位的增殖细胞抗原指数均接近其对应的增殖细胞抗原标准指数，则判断免疫组化染色的质量为合格，否则判断免疫组化染色的质量为不合格。
50.在本步骤中，增殖细胞抗原标准指数可以是采用标准的染色方法得到的器官或组织的增殖细胞抗原指数，也可以是其它分析手段得到的标准数值范围。
51.在一较优实施例中，选取小肠和肝脏制作质控蜡块，质控片包括小肠和肝脏，从质控图像中分别提取小肠的黏膜腺体部位、小肠的黏膜下淋巴组织部位、小肠的固有肌层组织部位以及肝脏组织部位的ki67指数，将其分别与上述的ki67标准指数相比较，若各ki67指数皆属于其对应的ki67标准指数的范围，则判断染色质量为合格，若超出ki67标准指数的范围，则判断染色质量为不合格，需要根据ki67指数较ki67标准指数偏离幅度进行失控原因分析及及时整改措施等。
52.具体的，在一具体实施例中，检测ki67抗原，从质控图像中提取小肠的黏膜腺体部位并检测其ki67指数k1，小肠的黏膜腺体部位的ki67标准指数k1’范围为10％～30％，将k1与k1’进行比较，如果k1∈[10％,30％]，则k1合格；如果则k1不合格。
[0053]
从质控图像中提取小肠的黏膜下淋巴组织部位并检测其ki67指数k2，小肠的黏膜下淋巴组织部位的ki67标准指数k2’范围为50％～80％，将k2与k2’进行比较，如果k2∈[50％,80％]，则k2合格，如果则k2不合格。
[0054]
从质控图像中提取小肠的固有肌层组织部位并检测其ki67指数k3，小肠的固有肌层组织部位的ki67标准指数k3’范围为≤1％，将k3与k3’进行比较，如果k3≤1％，则k3合格，如果k3＞1％，则k3不合格。
[0055]
从质控图像中提取肝脏组织部位并检测其ki67指数k4，肝脏组织部位的ki67标准指数k4’范围为1％～10％，将k3与k3’进行比较，如果k4∈[1％,10％]，则k4合格，如果则k4不合格。
[0056]
若k1、k2、k3和k4均合格，则判断免疫组化染色的质量为合格，否则判断免疫组化染色的质量为不合格。
[0057]
增殖细胞抗原的密度决定了增殖细胞抗原颜色点的密度值，颜色点的密度直接影响增殖细胞抗原指数，若染色过深，则会使提取的增殖细胞抗原指数较增殖细胞抗原标准指数偏大，对于密度大的组织或部位，则会使得到的增殖细胞抗原指数更加偏离增殖细胞抗原标准指数，若染色过浅，则会使提取的增殖细胞抗原指数较增殖细胞抗原标准指数偏小，对于密度小的组织或部位，则会使得到的增殖细胞抗原指数更加偏离增殖细胞抗原标准指数，本发明通过提取至少两种不同增殖细胞抗原密度的部位的增殖细胞抗原指数，分别与其对应的标准指数进行比较，可以准确评价染色深浅是否合格。若不同增殖细胞抗原密度的指数均与对应的标准指数相近，则不仅判断染色深浅是合格的，而且判断对正常抗原和增殖细胞抗原的染色以及识别数量的过程均是合格的。
[0058]
另，增殖细胞抗原指数是一个定量的数值，能够反应出其偏离标准指数的幅度，根据其偏离标准指数的幅度可以给出例如优、良、差等不同等级的质控评价，能够定量评价质控质量，而且根据标准指数的偏离幅度还可以知晓染色不合格的原因，便于操作人员对操作过程进行改进。现有技术多采用阳性或阴性评价质控质量，缺乏定量性评价，不仅评价结果不准确，而且不能判断是何种原因导致的操作不当，不利于改进操作过程。
[0059]
综上，本发明的质控方法可以更准确、更客观、更全面、更定性定量的评价免疫组化的质量，确保对待检人样本的病理图像提取的增殖细胞抗原指数是可靠的。
[0060]
本发明的质控方法还包括判断室内/室间免疫组化染色的质量的过程：
[0061]
s5：根据各部位的增殖细胞抗原指数与其对应的增殖细胞抗原标准指数的接近程度，分别对各部位的增殖细胞抗原指数进行打分；为免疫组化染色的质量进行打分，用m表示，m等于对各部位的增殖细胞抗原指数打分的总和；对同一批次的质控片的m值进行统计，如果各质控片的免疫组化染色的质量均为合格，则判断室内/室间免疫组化染色的质量为合格；否则判断室内/室间免疫组化染色的质量为不合格。
[0062]
分别根据k1、k2、k3和k4与其所对应的k1’、k2’、k3’和k4’的接近程度，分别对k1、k2、k3和k4进行打分，分别记为m1、m2、m3和m4，则m＝m1 m2 m3 m4。
[0063]
对k1、k2、k3和k4打分，可以分为合格、警戒以及不合格的三个等级，打三个等级的分数，当k1、k2、k3和k4分别位于k1’、k2’、k3’和k4’的中间数值区域，则判断k1、k2、k3和k4分别是合格的，较为满意，打分最高，当k1、k2、k3和k4分别接近k1’、k2’、k3’和k4’的上、下数值边界时，则判断k1、k2、k3和k4分别是基本合格，基本满意，打分稍低，提示当前处于合格边缘，应提高警戒，当k1、k2、k3和k4中有部分或全部超出k1’、k2’、k3’和k4’的范围，则判断k1、k2、k3和k4分别是不合格，不满意，打分更低。
[0064]
具体的，在一具体实施例中，如果k1∈[15％,25％]，则m1＝2，如果k1∈[10％,15％)或(25％,30％]，则m1＝1，如果则m1＝-2；如果k2∈[60％,70％]，则m2＝2，如果k2∈[50％,60％)或(70％,80％]，则m2＝1，如果则m2＝-2；如果k3小于等于1％，则m3＝2，如果k3大于1％，则m3＝-2；如果k4∈[4％,7％]，则m4＝2，如果k4∈[1％,4％)或(7％,10％]，则m4＝1，如果则m4＝-2。
[0065]
当m值为8时，可以评价染色质量优秀，当m值为6～7，则评价染色质量良，若m值为4～5，且k1、k2、k3和k4均合格，则评价染色质量中，需引起警戒注意，若m值小于4，则评价染色不合格，结果不可靠，建议重新制作或紧急改进相关措施，避免造成更大的错误诊断现象出现。
[0066]
上述具体的打分分值仅是举例，也可以采用其它分值来评价染色质量。
[0067]
对同一批次的质控片的m值进行统计，具体的，可以制作同一批次所有质控片的m值曲线，如图9所示，若曲线的m值均位于6～8之间，处于优秀和良的等级，表明室内/室间免疫组化染色的质量为优秀，如图9中的情况一。若曲线的部分m值位于4～5之间，如图9中的情况二，或曲线的部分m值位于4以下，如图9中的情况三，应提高警惕，寻找低分原因，并进行相应的整改措施。
[0068]
采用打分的方式评价染色质量，易定性、定量分析和统计，每一个病理图像上均有质控图像，因此，每个病理图像的质量被保证，通过对同一批次的所有质控片(包括室内和
室间)进行m值统计，能够精准评价实验室内或实验室之间所有操作人员的染色质量，便于及时发现问题，及时纠正与整改，更加适用于大范围的不同区域实验室的一致性评价。
[0069]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。