一种高浓度胶体金的标记方法与流程

1.本发明涉及免疫金标记方法，具体地涉及一种高浓度的胶体金的标记方法。


背景技术：

2.目前，市场上高浓度的胶体金产品很少，相应的标记蛋白的方法也少有研究。通常情况下，试验人员仍是将高浓度的胶体金稀释至常规的浓度，如100od的胶体金稀释至1od下，再调整ph后，与蛋白进行偶联。但是，常规的标记工艺不能最大效率的开发高浓度金的优势，并会在一定程度上增加工作时长，降低工作效率。
3.1.高浓度的胶体金对盐浓度更加敏感，在标记蛋白的过程中，因为胶体金的浓度高，用常规的ph试纸不能正确检测合适的ph。而且胶体金的吸附性，又易损伤ph试剂的探头。常规的标记工艺很难调整合适的标记缓冲液。
4.2.就常规技术而言，低浓度胶体金的标记工艺，会增加工作量，如1l的100od胶体金，如果稀释至常规浓度，则体积会放大至100l，对于生产企业而言，100l胶体金的处理需要配套大型的离心设备，至少需要3～5个工作人员配合操作。相应地，能源损耗，人力成本，材料成本以及设备折旧，供货周期等均会收到影响。
5.3.常规的标记工艺对于数量众多的抗体的选择往往是确定一个工艺，来标记不同厂家，不同来源，以及不同批次的抗体或者抗原，但这样的结果往往工作量大，甚至会因为标记条件的限制，而筛选不出最适的抗体，造成工作效率低下。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种高浓度胶体金的标记方法，旨在创造全新的工艺，适配高浓度胶体金的特点，开发高浓度胶体金的优势，满足低能耗以及低成本大批量生产需求的同时，更加灵活以及简便，符合市场需求，适用于推广。
7.本发明通过以下技术方案实现：一种高浓度胶体金的标记方法，包括以下步骤：
8.(1)确定最适标记ph：取不同ph的缓冲液分别对浓度不低于100od的胶体金溶液进行稀释，形成不同ph的胶体金溶液，在各胶体金溶液中分别加入待标记蛋白，混匀，反应得不同ph值缓冲液的标记物混合溶液a，纯水稀释各标记物混合溶液a至胶体金终浓度为1od，然后分别加入氯化钠溶液至氯化钠的终浓度为1％，盐破坏反应完成后，胶体金的颜色不发生变化，或者变化最小的即为最适的标记ph，相应的缓冲液为最适的标记缓冲液；
9.(2)确定最适蛋白质标记量：取确定的最适的标记缓冲液对浓度不低于100od的胶体金溶液进行稀释，然后分成若干等份，分别加入待标记蛋白质溶液，形成不同蛋白质终浓度的标记物混合溶液b，纯水稀释各标记物混合溶液b至胶体金终浓度为1od，然后分别加入氯化钠溶液至氯化钠的终浓度为1％，盐破坏反应完成后，胶体金的颜色未发生变化，或者变化最小的蛋白质浓度即为最适蛋白质标记量；
10.(3)以确定的最适标记ph和最适抗体标记量，取最适的标记缓冲液和蛋白质配置蛋白质稀释液，然后加入浓度不低于100od的胶体金溶液中，反应得标记物混合液c，而后加
入封闭剂进行封闭反应，即得胶体金标记蛋白复合物。
11.本发明中，待标记蛋白可以是抗原、抗体或者其他蛋白质分子以及基因序列。
12.本发明中，缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、磷酸盐缓冲液(pb)、硼酸-硼砂缓冲液或碳酸盐缓冲液等。在步骤(1)中，缓冲液可以选择相同的，也可以选择不相同的，可以根据实际情况进行选择，缓冲液浓度为0.01m。
13.步骤(1)中，胶体金浓度在200～100od情况下，不同ph的胶体金溶液的浓度在10-60od范围内，否则缓冲液体积占比低，会造成缓冲能力下降。
14.步骤(1)中，标记物混合溶液a常温下振荡反应15-120min，之后再加入纯水稀释。盐破坏反应时间为1-30min。
15.步骤(2)中，最适的标记缓冲液将浓度不低于100od的胶体金溶液稀释至10-60od。
16.步骤(2)中，标记物混合溶液b常温下振荡反应15-120min，之后再加入纯水稀释。盐破坏反应时间为1-30min。
17.步骤(3)中，标记物混合溶液c常温下振荡反应15-120min，封闭反应时间为15-60min。
18.步骤(3)中，所述封闭剂为大分子物质，如牛血清白蛋白(bsa)、酪蛋白(casein)、聚丙二醇(peg)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)等。
19.本发明还包括步骤(4)，即对胶体金标记蛋白复合物进行纯化，在本发明中主要采用离心机进行离心纯化。
20.与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
21.1.本发明提供的方法，可以快速将抗原抗体等蛋白标记至高浓度胶体金表面，首先通过高盐破坏试验确定最适标记ph的缓冲液，再利用确定的最适标记ph的缓冲液配置胶体金标记蛋白，高盐破坏反应后确定最适标记蛋白质浓度，然后依据最适标记ph的缓冲液和最适标记蛋白质浓度进行最终的标记蛋白的制备。通过本发明提供的方法，高浓度胶体金标记过程全程金颗粒不聚集，反应体系体积小，节省60％的人工，以及可以最高节省80％的蛋白材料，甚至在离心纯化过程中，无需投入过多的大型设备，也能完成大批量的生产。
22.2.本发明提供的方法满足在高浓度胶体金的情况下，仍然可以完成胶体金与蛋白的标记，充分开发利用了高浓度胶体金的优势，减少标记时长，以及标记蛋白的用量，无需大型离心设备的投入，降低能源损耗，更能节省生产周期，同时增加了胶体金标记蛋白物的性能，并且该方法操作简便，方便推广。
23.3.本发明提供的方法避免使用ph计探头即可完成精准最适ph确定的同时，也能提升抗原抗体反应检测灵敏度。
24.4.本发明提供的方法筛选条件灵活快捷，更利于在侧向层析领域高通量高精准地确定最适抗原或者抗体。
25.5.本发明提供的方法操作过程比较简便，与常规的低浓度标记方法相比，没有增加操作复杂度，并且在蛋白标记过程中，更能精准定位最适标记ph，方便后续的扩大生产，减少调试过程。
26.6.本发明优化了标记方法的灵活性，可针对不同厂家不同批次甚至同一厂家不同批次的抗原或者抗体，可以灵活地改变标记缓冲液或者标记量，实现实时在最优的情况下判断活材是否最适，减少因标记条件的不匹配而漏选最适活材。
27.7.本发明提供的方法，使用高浓度胶体金进行标记，在生产过程中，缩短30％供货周期，并且批间差小，可以减少大型离心设备的投入，降低能源损耗，尤其是针对大批量的生产，更值得推广。
28.本发明的方法在实际的批量生产过程中，已经体现非常显著的优势，例如200万人份的生产，仅需1l 100od的高浓度胶体金，搭配本发明的标记方法，仅需一位研发人员，一台每孔50ml台式离心机，耗费3个小时的时间就能完成标记工作。与常规的标记工作相比，效率大大提升：
[0029][0030]
8.本发明提供的方法在提升标记效率，生产效率的同时，在性能上，由于使用了高浓度胶体金标记灵敏度以及特异性液得到提升。
具体实施方式
[0031]
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0032]
在本发明中，胶体金的浓度值以od表示，100od的胶体金浓度为含1％的氯金酸。
[0033]
实施例一 高浓度胶体金与抗体的标记方法
[0034]
1.确定最适标记ph缓冲液
[0035]
(1)选择0.01m pb缓冲液，配置成为ph6.2、ph7.4以及ph8.0三种不同ph值的pb缓冲液。
[0036]
(2)取三支40ul 100od高浓度胶体金，分别用以上缓冲液稀释至10～60od，常温振荡混匀。
[0037]
(3)加入待标记抗体，终浓度在20～200ug/ml，常温震荡反应20～120min。
[0038]
(4)以上不同ph缓冲液的胶体金-抗体混合液，各取25ul，分别用975ul纯化水稀释至1od，加入100ul 10％nacl溶液，震荡混匀，1～60min后观察胶体金-抗体混合物稀释液的颜色。颜色未发生变化，或者变化最小的，即为最适标记ph缓冲液，为缓冲液a。
[0039]
2.最适抗体标记量的确定
[0040]
(1)取400ul 100od高浓度胶体金溶液，添加缓冲液a，稀释胶体金溶液至10od～60od，分成至少6等份，分别加入不同体积的抗体溶液，抗体终浓度呈一定的规律性，可以是
100ug/ml，80ug/ml，60ug/ml，40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml等，常温震荡反应20min～120min，得不同浓度的抗体-胶体金混合物溶液，即不同浓度的标记物混合液b。
[0041]
(2)以上不同浓度的抗体-胶体金混合物溶液，各取25ul，用975ul纯化水稀释至1od，加入100ul 10％nacl溶液，震荡混匀，1～60min后观察胶体金-抗体混合物稀释液的颜色。颜色未发生变化，或者变化最小的抗体浓度，即为最适抗体标记量。
[0042]
3.胶体金-抗体复合物的封闭
[0043]
以确定的最适标记ph和最适抗体标记量条件，取缓冲液a和抗体配制蛋白质稀释液，然后加入浓度不低于100od的胶体金溶液中，反应15～120min得标记物混合液c，而后添加入终浓度为0.2％～5％的bsa溶液，反应15min～60min，完成封闭反应。
[0044]
4.胶体金-抗体复合物的纯化
[0045]
(1)封闭完成的反应体系，通过离心方式完成纯化。离心力：4660xg，时间：5min～60min。
[0046]
(2)离心完成后，取出上清，更换为胶体金复溶液重悬胶体金-抗体标记复合物即可。
[0047]
胶体金复溶液应包含缓冲液、大分子蛋白、糖类表面活性剂以及防腐剂等。
[0048]
实施例二 高浓度胶体金与抗体的标记方法
[0049]
与实施例一不同的是：
[0050]
1.最适标记ph的确定
[0051]
(1)选择0.01m bb缓冲液，配置成为ph 8.0、ph8.5以及ph9.0三种缓冲液。
[0052]
(2)取三支40ul 100od高浓度胶体金，分别用以上缓冲液稀释至10～60od，常温振荡混匀。
[0053]
3.胶体金-抗体复合物的封闭
[0054]
标记物混合液c中添加入终浓度为0.2％～5％的casein溶液，反应15min～60min，完成封闭反应。
[0055]
实施例三 高浓度胶体金与抗体的标记方法
[0056]
与实施例二不同的是：
[0057]
1.最适标记ph的确定
[0058]
(1)选择0.01m ph 8.5bb缓冲液、0.01m ph 7.6pb缓冲液、0.01m ph 6.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。
[0059]
实施例四 高浓度胶体金与抗原的标记方法
[0060]
1.确定最适标记ph缓冲液
[0061]
(1)选择0.01m ph 8.5bb缓冲液、0.01m ph 7.6pb缓冲液、0.01m ph 6.0柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。
[0062]
(2)取三支400ul 100od高浓度胶体金，分别用以上缓冲液稀释至10～60od。
[0063]
(3)加入不同体积的待标记抗原溶液，终浓度在10ug/ml～400ug/ml，常温震荡反应20～120min。
[0064]
(4)以上不同ph缓冲液的胶体金-抗体混合液，各取25ul，分别用975ul纯化水稀释至1od，加入100ul 10％nacl溶液，震荡混匀，1～60min后观察胶体金-抗体混合物稀释液的颜色。颜色未发生变化，或者变化最小的，即为最适标记ph缓冲液，为缓冲液a。
[0065]
2.最适抗体标记量的确定
[0066]
(1)取400ul 100od高浓度胶体金溶液，添加缓冲液a，稀释胶体金溶液至10od～60od，分成试验需要分成若干等份，分别加入不同体积的抗原溶液，抗原终浓度为10ug/ml～400ug/ml，具体终浓度可根据试验需要进行设计，具体参考实施例一，常温震荡反应20min～120min，得不同浓度的抗原-胶体金混合物溶液，即不同浓度的标记物混合液b。
[0067]
(2)以上不同浓度的抗原-胶体金混合物溶液，各取25ul，用975ul纯化水稀释至1od，加入100ul 10％nacl溶液，震荡混匀，1～60min后观察抗原-胶体金混合物稀释液的颜色。颜色未发生变化，或者变化最小的抗原浓度，即为最适抗原标记量。
[0068]
3.抗原-胶体金复合物的封闭
[0069]
以确定的最适标记ph和最适抗体标记量条件，取缓冲液a和抗体配制蛋白质稀释液，然后加入浓度不低于100od的胶体金溶液中，反应15～120min得标记物混合液c，而后添加入终浓度为0.2％～5％的bsa溶液，反应15min～60min，完成封闭反应。
[0070]
实施例五 高浓度胶体金标记降钙素原抗体的方法
[0071]
1.最适标记ph的确定
[0072]
(1)选择0.01m pb缓冲液，配置成为ph6.2、ph7.4以及ph8.0三种缓冲液。
[0073]
(2)取三支40ul100 od高浓度胶体金，分别用以上缓冲液稀释至40od，常温振荡混匀。
[0074]
(3)加入待标记降钙素原抗体，终浓度可以为60ug/ml，常温震荡反应40min，得不同ph缓冲液的胶体金-抗体混合液。
[0075]
(4)各取25ul以上不同ph缓冲液的胶体金-抗体混合液，用975ul纯化水稀释至1od，加入100ul 10％nacl溶液，震荡混匀，10min后观察胶体金-抗体混合物稀释液颜色。
[0076]
(5)颜色几乎没有发生变化，或者变化最小的，即为最适标记ph，在本试验中，最适标记ph为0.01m ph7.4 pb缓冲液。
[0077]
2.最适标记量的确定
[0078]
(1)取3支40ul100 od高浓度胶体金，分别用0.01m ph7.4 pb缓冲液稀释至40od，常温振荡混匀。
[0079]
(2)分别加入不同浓度的pct(降钙素原)抗体，终浓度分别为40ug/ml，50ug/ml，60ug/ml,常温震荡反应40min。
[0080]
(3)各取25ul以上不同浓度抗体的胶体金-抗体混合液，用975ul纯化水稀释至1od，加入100ul 10％nacl溶液，震荡混匀，10min后观察胶体金-抗体混合物稀释液颜色。
[0081]
(2)颜色几乎没有发生变化，或者变化最小的，即为最适抗体量，在本试验中，最适标记抗体量为50ug/ml。
[0082]
(4)按照最适标记ph，将400ul 100od的高浓度胶体金稀释至1ml，进一步地按照最适标记量，添加适量pct(降钙素原)抗体，标记抗体40min后，添加50ul 10％bsa水溶液，进一步地，bsa的终浓度为0.5％，常温震荡反应20min。
[0083]
(5)在离心力4660xg下，离心10min，去除上清后添加1ml的胶体金复溶液复溶胶体金标记复合物。胶体金复溶液的配方含有：tris缓冲液、bsa、糖类、表面活性剂以及防腐剂。
[0084]
(6)用金标三维喷金点膜仪，设置参数4ul/cm,将上述11混合标记复合物，喷于聚酯纤维dl42上，裁剪7mm*300mm备用，称为标记复合物垫。
[0085]
(7)用金标三维喷金点膜仪，以1μl/cm参数，在硝酸纤维素膜上包被另一株降钙素原单克隆抗体和羊抗鼠igg，37℃干燥16小时，作为反应膜。
[0086]
(8)用含0.5％tween-20的0.1m pbs溶液浸泡玻璃纤维，然后37℃干燥16小时，裁剪17mm
×
300mm为作为样品垫。
[0087]
(9)将样品垫、荧光纳米微球标记复合物垫、反应膜和吸水纸(22mm
×
300mm)以层层叠压的形式进行黏贴组装在pvc底板上，切条后，作为降钙素原测定试纸条。
[0088]
(10)检测：将试纸条放入合适的卡壳内，做成完整的检测试纸条。在加样孔内加入40～100ul的待检样本，反应15min。c线正常显出红色条带的为有效测试，观察t线的色带情况。t线没有色带的，检测结果为阴性，有条带的，根据条带的强弱判断为弱阳性、强阳性等。
[0089]
判读结果：
[0090][0091]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。