一种改性壳聚糖凝胶及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及领域医用凝胶领域，尤其涉及一种改性壳聚糖凝胶及其制备方法和应用。


背景技术：

2.肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是一种危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于其他器官恶性肿瘤的肝转移。
3.肝癌的早期可以采用手术切除肿瘤组织的方式进治疗，但是，手术切除时，肿瘤细胞难以完全切除因此，术后，患者需进行化疗来清除未切除和肿瘤细胞。常规化疗需要采用静脉滴注，注入患者体内。这种全身性给药的方法副作用非常大，通常患者会出现非常多且严重的不良反应。而在术后，在肿瘤切除的部位进行局部的，靶向的给药能够很好的降低患者的不良反应。而如何在局部给药的时实现药物的缓释与控释成为一个亟待解决的问题。
4.有鉴于此，需要提出一种新的技术方案来解决上述技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于提供一种交联后可对药物进行控释与缓释的改性壳聚糖。
6.本发明的第二个目的在于提供一种所述改性壳聚糖的制备方法。
7.本发明的第三个目的在于提供一种所述改性壳聚糖的应用。
8.本发明的第四个目的在于提供一种可控释或缓释药物的改性壳聚糖凝胶。
9.本发明的第五个目的在于提供一种所述改性壳聚糖凝胶的制备方法。
10.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
11.一种改性壳聚糖，具有如下式所示结构：
[0012][0013]
其中，100≤n≤300，4％≤m≤8％。
[0014]
一种所述的改性壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：
[0015]
s1将壳聚糖溶于mes溶液中，得到溶液a；
[0016]
s2将乙酰酪氨酸于mes溶液中，得到溶液b；
[0017]
s3将溶液a与溶液b混合后得到溶液c，采用无机碱溶液调节ph值于4-5，向溶液c中加入hobt和hbtu，进行酰胺化反应，即得所述改性壳聚糖。
[0018]
所述mes溶液的浓度为125-175mmol/l；
[0019]
所述无机碱溶液包括氢氧化钠或氢氧化钾。
[0020]
所述溶液a中，所述壳聚糖的含量为2-5wt％；
[0021]
所述溶液b中，乙酰酪氨酸的含量为2-5wt％。
[0022]
所述溶液c中hobt的含量为0.1-0.3mol/l；
[0023]
所述溶液c中hbtu的含量为0.1-0.5mol/l。
[0024]
一种所述的改性壳聚糖的应用，应用于制备治疗肝癌的控缓释药物。
[0025]
一种改性壳聚糖凝胶，所述改性壳聚糖凝胶由所述的改性壳聚糖交联得到；所述改性壳聚糖凝胶中包括用于治疗肝癌的药物。
[0026]
所述用于治疗肝癌的药物包括阿霉素、卡培他滨或吉西他滨；
[0027]
所述改性壳聚糖凝胶中，所述用于治疗肝癌的药物的释放速度为5-6％/天。
[0028]
一种所述的改性壳聚糖凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0029]
将所述改性壳聚糖溶于乙醇水溶液中，先后加入所述用于治疗肝癌的药物和酪氨酸酶，即得所述改性壳聚糖凝胶。
[0030]
所述乙醇水溶液中，所述改性壳聚糖的含量为10-20wt％。
[0031]
相比于现有技术，本发明带来以下技术效果：
[0032]
1.本发明提供的改性壳聚糖可在存在酪氨酸酶存在的环境下自发的形成改性壳聚糖凝胶。因为癌细胞中酪氨酸酶含量高，因此，所述改性壳聚糖可以靶向的在癌细胞附近形成凝胶。
[0033]
2.本发明提供的所述改性壳聚糖的制备方法制备过程简单，可实现所述改性壳聚糖大批量生产。
[0034]
3.本发明提供的改性壳聚糖，对治疗癌症的化疗药物具有良好的亲合力可用于制备治疗肝癌的控缓释药物。
[0035]
4.本发明提供的改性壳聚糖凝胶对化疗药物具有良好的亲合力，其单体在癌细胞表面形成凝胶后可以一定的速率向癌细胞释放化疗药物。相对于全身给药，所述改性壳聚糖凝胶的局部给药方式可以减少患者的不良反应，提高患者的依从性，提高患者的生存质量。
[0036]
5.本发明提供的改性壳聚糖凝胶的制备方法其工艺简单，可靠性高。
附图说明
[0037]
图1示出了实施例1制备得到的改性壳聚糖的1h-nmr谱图；
[0038]
图2示出了实施例4中改性壳聚糖在交联前和交联后的流变曲线图；其中图2(a)为交联前的流变曲线图，图2(b)为交联后的流变曲线图；
[0039]
图3示出了实施例4中改性壳聚糖在交联前和交联后的紫外光谱图；
[0040]
图4示出了实施例4制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0041]
图5示出了实施例5制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0042]
图6示出了实施例6制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0043]
图7示出了对比例1制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0044]
图8示出了对比例2制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0045]
图9示出了对比例3制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0046]
图10示出了对比例4制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0047]
图11示出了对比例5制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0048]
图12示出了对比例6制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线；
[0049]
图13示出了实施例7中，改性壳聚糖在hepg2细胞的培养液中交联后，然后去除了hepg2细胞的培养液中的改性壳聚糖凝胶的tem照片。
具体实施方式
[0050]
下面结合实施例，对本发明进行进一步说明。
[0051]
本发明提供了一种改性壳聚糖，所述改性壳聚糖在壳聚糖的氨基上修饰有乙酰酪氨酸。在存在酪氨酸酶的环境中，所述改性壳聚糖会在酪氨酸酶的作用下交联而形成改性壳聚糖凝胶。具体的，在使用时，可在肝癌肿瘤切除术后，在切除部位涂覆包括化疗药物的所述改性壳聚糖的溶液。由于肿瘤细胞中酪氨酸酶的表达水平较正常细胞高，所述改性壳聚糖会在肿瘤细胞周围形成凝胶。未形成凝胶的壳聚糖则可被机体分解。在凝胶的形成过程中，化疗药物被封在改性壳聚糖凝胶中。但是由于所述改性壳聚糖的氨基上修饰有乙酰酪氨酸，使得在空间上，所述改性壳聚糖凝胶中会存在一些空隙，这些空隙会为化疗药物提供扩散通道，使药物能够均匀稳定的扩散，因此，所述改性壳聚糖凝胶能够具备更好的控缓释效果。而不作修饰的壳聚糖凝胶中，化疗药物被限制在凝胶内，相对扩散更慢，更不稳定。当然，也可以在体外向包括化疗药物的所述改性壳聚糖的溶液中直接加入酪氨酸酶，而得到改性壳聚糖凝胶，然后直接把改性壳聚糖凝胶涂覆于肿瘤切除的部位，化疗药物会在整个切除部位均匀的释放。所述改性壳聚糖的聚合度不家过大。当聚合度大于300时，其形成的凝胶的粒径也会增加，这会导致药物的释放面积增加而使正常细胞受到化疗药物的影响而增加不良反应。而当聚合度小于100时，凝胶的粒径过小，而使药物的释放量过小，而不能起到抑制肿瘤细胞生长的作用。
[0052]
具体的，所述的改性壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：
[0053]
s1将壳聚糖溶于mes溶液中，得到溶液a；
[0054]
s2将乙酰酪氨酸于mes溶液中，得到溶液b；
[0055]
s3将溶液a与溶液b混合后得到溶液c，采用无机碱溶液调节ph值于4-5，向溶液c中加入hobt和hbtu，进行酰胺化反应，即得所述改性壳聚糖。
[0056][0057]
上述方法中，mes代表吗啉乙磺酸，hobt代表1-羟基苯并三唑，hbtu代表o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐。
[0058]
在本发明的某些具体实施方式中，所述mes溶液的浓度为125-175mmol/l。所述mes
溶液可以作为缓冲液，调节反应体系的ph值。本领域技术人员可以理解，所述mes溶液的浓度在上述浓度范围附近，都可实现本发明。
[0059]
在本发明的某些具体实施方式中，所述无机碱溶液可以是氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。本领域技术人员可以理解，采用其他类型的无机碱也实现本发明。
[0060]
本发明的某些具体实施方式中，所述溶液a中，所述壳聚糖的含量为2-5wt％；所述溶液b中，乙酰酪氨酸的含量为2-5wt％。所述溶液c中hobt的含量为0.1-0.3mol/l；所述溶液c中hbtu的含量为0.1-0.5mol/l。
[0061]
由于所述改性壳聚糖在交联后可以以相对均匀地释放化疗药物，因此其可以应用于制备治疗肝癌的控缓释药物。
[0062]
具体的，所述改性壳聚糖在交联后可以得到改性壳聚糖凝胶；所述改壳聚糖中可以包含用于治疗肝癌的药物。优选的，所述用于治疗肝癌的药物可以是索拉非尼、仑伐替尼、多纳非尼或阿帕替尼；所述改性壳聚糖凝胶中，所述用于治疗肝癌的药物的释放速度为5-6％/天。
[0063]
一种所述的改性壳聚糖凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0064]
具体的，将所述改性壳聚糖溶于乙醇水溶液中，先后加入所述用于治疗肝癌的药物和酪氨酸酶，即得所述改性壳聚糖凝胶。优选的，所述乙醇水溶液中，所述改性壳聚糖的含量为10-20wt％。
[0065][0066]
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明
[0067]
实施例1
[0068]
改性壳聚糖的制备
[0069]
将3g聚合度为200的壳聚糖溶解在100ml mes(150mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(150mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后向溶液c中含水naoh将ph值调整回4.5。搅拌，继续反应2小时。得到聚合度为200，m为6％的改性壳聚糖。
[0070]
然后，添加5gnacl，并用含有20mm的nacl溶液透析3天。透析后，冷冻干燥，即得改性壳聚糖冻干粉。取少量冻干粉进行1h-nmr分析，得到的1h-nmr谱图如图1所示。从图中可以看出，实施例1制备得到的改性壳聚糖修饰有乙酰酪氨酸。
[0071]
实施例2
[0072]
改性壳聚糖的制备
[0073]
将3g聚合度为300的壳聚糖溶解在100ml mes(150mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(150mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后
向溶液c中含水naoh将ph值调整回4。搅拌，继续反应2小时。得到聚合度为300，m为4％的改性壳聚糖。
[0074]
然后，添加5gnacl，并用含有20mm的nacl溶液透析3天。透析后，冷冻干燥，即得改性壳聚糖冻干粉。
[0075]
实施例3
[0076]
改性壳聚糖的制备
[0077]
将3g聚合度为100的壳聚糖溶解在100ml mes(175mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(175mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后向溶液c中含水naoh将ph值调整回5。搅拌，继续反应2小时。得到得到聚合度为100，m为8％的改性壳聚糖。改性壳聚糖。
[0078]
然后，添加5gnacl，并用含有20mm的nacl溶液透析3天。透析后，冷冻干燥，即得改性壳聚糖冻干粉。
[0079]
实施例4
[0080]
改性壳聚糖凝胶的制备
[0081]
将实施例1制备得到的改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入阿霉素的原料药，混合均匀，然后向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0082]
发明人采用haake mars 60流变仪对实施例4制备得到的改性壳聚糖乙醇水溶液和改性壳聚糖凝胶进行了流变性能的分析。发明人通过流变仪测试了溶液体系的粘性模量(g”)的变化规律。其中流变仪的具体参数为：应变为4-6％，扫描频率为0.1hz，测试温度为室温。图2(a)为交联前的流变曲线图，图2(b)为交联后的流变曲线图。由图2(a)和由图2(b)可以看出，交联后，g”的流变曲线明显低于交联前。该结果也表明酪氨酸酶能够催化改性壳聚糖溶液发生交联反应形成凝胶。
[0083]
图3示出了实施例4交联前后的改性壳聚糖的紫外图谱。从图中可以看出交联后的改性壳聚糖的紫外吸收峰明显高于交联前的紫外吸收峰。这说明，酪氨酸酶可以催化实施例1制备得到的改性壳聚糖进行交联。
[0084]
壳聚糖具有广谱抗菌活性，其在酸性环境中能够季铵化，形成带正电荷的大分子，细菌的细胞壁是带负电荷的，壳聚糖能够和这种带负电荷的细胞壁键合，破坏细胞膜的正常功能从而发挥抗菌作用。而且，酪氨酸还能影响细菌的胞外聚合物(eps)因此，壳聚糖中引入乙酰酪氨酸能够使材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有更好的抑制作用。
[0085]
发明人还采用高效液相色谱仪对实施例4制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度进行了测试。
[0086]
色谱条件：
[0087]
流动相：0.1％磷酸-甲醇-乙腈(40：30：30)；
[0088]
色谱柱：agilentc
18
柱(250mm
×
4.6mm，5μm)；
[0089]
流速：1.0ml
·
min-1
；
[0090]
柱温：30℃；
[0091]
检测波长：237nm；
[0092]
进样量：20μl。
[0093]
释放度测定方法如下：
[0094]
避光操作，取实施例4制备得到的改性壳聚糖凝胶，在ph为6.8的溶出介质中测定释放曲线。参照溶出度测定法，转速为75r
·
min-1
，介质体积为900ml。分别在0.25d、0.5d、ld、1.5d、2d、3d、4d、6d、8d、12d取样5ml，采用hplc法进行测定，绘制释放曲线。
[0095]
ph6.8介质的配制
[0096]
取磷酸二氢钾1.7g和无水磷酸氢二钠1.775g，加水适量使溶解后，再加3.5ml吐温-60定容至1000ml。
[0097]
实施例4制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图4所示。从图中可以看出，阿霉素的释放速度缓慢而且均匀，这说明，实施例4制备得到的改性壳聚糖凝胶可以用于制备治疗肝癌的控缓释药物。
[0098]
实施例5
[0099]
改性壳聚糖的制备
[0100]
将实施例1制备得到的改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入卡培他滨的原料药，混合均匀，然后向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0101]
实施例5制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图5所示。从图中可以看出，卡培他滨的释放速度缓慢而且均匀，这说明，实施例5制备得到的改性壳聚糖凝胶可以用于制备治疗肝癌的控缓释药物。
[0102]
实施例6
[0103]
改性壳聚糖的制备
[0104]
将实施例1制备得到的改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入吉西他滨的原料药，混合均匀，然后向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0105]
实施例6制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图6所示。从图中可以看出，吉西他滨的释放速度缓慢而且均匀，这说明，实施例6制备得到的改性壳聚糖凝胶可以用于制备治疗肝癌的控缓释药物。
[0106]
对比例1
[0107]
将5g聚合度为50的壳聚糖溶解在100ml mes(175mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(175mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后向溶液c中含水naoh将ph值调整回5。搅拌，继续反应2小时。得到改性壳聚糖。将改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入阿霉素的原料药，混合均匀，然后向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0108]
对比例1制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图7所示。从图中可以看出，卡培他滨的释放速度过快。
[0109]
对比例2
[0110]
将5g聚合度为350的壳聚糖溶解在100ml mes(175mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(175mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后向溶液c中含水naoh将ph值调整回5。搅拌，继续反应2小时。得到改性壳聚糖。将改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入阿霉素的原料药，混合均匀，然后
向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0111]
对比例2制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图8所示。从图中可以看出，卡培他滨的释放速度过慢。
[0112]
对比例3
[0113]
将5g聚合度为50的壳聚糖溶解在100ml mes(175mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(175mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后向溶液c中含水naoh将ph值调整回5。搅拌，继续反应2小时。得到改性壳聚糖。将改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入卡培他滨的原料药，混合均匀，然后向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0114]
对比例3制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图9所示。从图中可以看出，卡培他滨的释放速度过快。
[0115]
对比例4
[0116]
将5g聚合度为350的壳聚糖溶解在100ml mes(175mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(175mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后向溶液c中含水naoh将ph值调整回5。搅拌，继续反应2小时。得到改性壳聚糖。将改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入阿霉素的原料药，混合均匀，然后向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0117]
对比例4制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图10所示。从图中可以看出，卡培他滨的释放速度过慢。
[0118]
对比例5
[0119]
将5g聚合度为50的壳聚糖溶解在100ml mes(175mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(175mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后向溶液c中含水naoh将ph值调整回5。搅拌，继续反应2小时。得到改性壳聚糖。将改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入阿霉素的原料药，混合均匀，然后向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0120]
对比例5制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图11所示。从图中可以看出，吉西他滨的释放速度过快。
[0121]
对比例6
[0122]
将5g聚合度为350的壳聚糖溶解在100ml mes(175mm)中得到溶液a。将3克乙酰酪氨酸溶解在100ml mes(175mm)溶液中，得到溶液b。将溶液a与溶液b混合后得到溶液c。然后向溶液c中含水naoh将ph值调整回5。搅拌，继续反应2小时。得到改性壳聚糖。将改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的乙醇水溶液，然后加入阿霉素的原料药，混合均匀，然后向乙醇水溶液中缓慢滴加80u/ml的酪氨酸酶溶液，反应完全后，即得改性壳聚糖凝胶。
[0123]
对比例6制备得到的改性壳聚糖凝胶的药物释放度曲线如图12所示。从图中可以看出，吉西他滨的释放速度过慢。
[0124]
实施例7
[0125]
改性壳聚糖在hepg2细胞培养液中的交联
[0126]
培养液：dmem 10％胎牛血清。
[0127]
传代：吸去培养液。用pbs轻微冲洗一遍，加入不含edta的0.25％胰酶，放置在37℃
的培养箱中，2分钟。再放入1.5ml锥型离心管中，800转每分钟，离心3分钟，使细胞更加干净。后将离心管中上清液吸出，只留下沉淀，再加入新鲜的完全培养基，吹打均匀后加入到细胞瓶中。
[0128]
交联：将实施例1制备得到的改性壳聚糖溶于乙醇水中，得到含量为15％的水溶液，然后将上述水溶液加入细胞瓶中，静置2天。
[0129]
图13示出了实施例7中，改性壳聚糖在hepg2细胞的培养液中交联后并去除了hepg2细胞后的tem照片。从图中可以看出，培养液中出现了颜色较深较小的凝胶颗粒。这说明，hepg2细胞中表达的酪氨酸酶可以催化实施例1制备得到的改性壳聚糖使其交联。
[0130]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。