微流体细胞培养系统的制作方法

1.本发明涉及包括至少一个微流体结构的微流体细胞培养系统。本发明还涉及用于运输本发明的微流体细胞培养系统的方法和用于形成本发明的微流体细胞培养系统的套件(kit-of-parts)。


背景技术：

2.体外细胞和组织培养是研究中的重要工具，作为用于研究正常、疾病和药物-或毒素-诱导的生理学和生物化学的模型系统。细胞和组织培养技术涉及在人工环境中例如通过使用微流体细胞培养系统来分配细胞，提供必需的营养、理想的温度、气体、ph和湿度以使细胞生长和增殖。为了确保所获得的结果的一致性和再现性，条件稳定是重要的。典型地，微流体细胞培养系统包括多个微流体结构。各个微流体结构包括用于培养细胞的细胞培养腔室。为了确保一致性和再现性，包含在微流体细胞培养系统中的微流体结构需要在产品(即微流体细胞培养系统)的生命周期期间保持完整和一致。然而，对于现今提供的微流体细胞培养系统观察到的是，微流体细胞培养系统中所包含的微流体结构的高百分比在最终用户如实验室技术人员收到时已不适合首次使用。已不适合首次使用的微流体结构的百分比可为显著的，即约50％。
3.为了减少不适合首次使用的微流体结构的数量，本发明对此提供了一种微流体细胞培养系统，所述微流体细胞培养系统包括至少一个微流体结构，其中所述至少一个微流体结构包括：
[0004]-用于容纳用于培养细胞的培养基的细胞培养腔室，所述细胞培养腔室包括微流体入口开口和微流体出口开口；
[0005]-第一储液器，其经由微流体入口开口与细胞培养腔室流体连通；和
[0006]-第二储液器，其经由微流体出口开口与细胞培养腔室流体连通。
[0007]
本发明的微流体细胞培养系统还包括用于密封至少一个微流体结构的可拆卸密封件。这样的可拆卸密封件可以是适用于密封微流体结构的任何密封件。可拆卸密封件可以是柔性或非柔性密封件。此外，本发明的可拆卸密封件可为形状固定密封(form-retaining seal)，例如盖。可选地，可拆卸密封件可为无定形密封，例如箔或石蜡膜。进一步注意地，可拆卸密封件可为可重复使用的密封件(例如，可重复使用的盖)或一次性密封件(例如，箔或石蜡膜)。在本发明的实施方案中，可拆卸密封件是非柔性的形状固定覆盖物，例如(透明)塑料盖。
[0008]
可拆卸密封件具有允许在不再需要可拆卸密封件之后(例如在运输后和到达预期的实验室时)容易地去除的优点。可拆卸密封件允许容易地用于密封和解封微流体结构，同时在施用至微流体结构时提供保护。
[0009]
在本发明的微流体细胞培养系统中，至少一个微流体结构的第一和第二储液器经由细胞培养腔室彼此流体连通。发现在运输期间，微流体结构内的压力波动和特别地微流体结构的储液器中的压力差可导致微流体结构的细胞培养腔室中的细胞外基质、培养的细
胞(例如，聚集体)或细胞培养基的破裂、不规则或破坏等，导致微流体结构不适于进一步的使用。受到破裂、不规则或破坏等的影响的方面的实例为包含细胞培养物的层或小管的屏障功能特征、或细胞培养物中所包含的细胞的存活率。
[0010]
为了减少在运输本发明的微流体细胞培养系统后不适于进一步使用的微流体结构的数量，微流体细胞培养系统配置为使得至少一个微流体结构的第一和第二储液器经由不包括细胞培养腔室的连通通道彼此流体连通。发现通过提供微流体结构，其中储液器经由除了细胞培养腔室以外的另一连通通道彼此流体连通，运输期间的压力的波动和微流体结构的储液器之间产生的任何压力差被连通通道抵消。因此，微流体结构的细胞培养腔室的内容物和构造不受到任何压力的波动和连接至细胞培养腔室的储液器中产生的压力差的影响。
[0011]
为了吸收本发明的微流体细胞培养系统的运输期间的压力的波动，细胞培养腔室和连通通道的设计为使得穿过第一和第二储液器之间的连通通道的流体阻力低于穿过第一和第二储液器之间的细胞培养腔室的流体阻力。流体阻力与连通通道的平均截面逆相关，并与连通通道的长度成比例相关。优选地，穿过连通通道的流体阻力比穿过细胞培养腔室的流体阻力低至少5倍，更优选低至少10倍，甚至更优选低至少50倍。细胞培养腔室和连通通道的设计可不仅限于结构设计选择。尽管可通过设计与细胞培养腔室的直径(例如，微流体入口和出口开口的直径)相比具有较大直径的连通通道来有利地控制连通通道和细胞培养腔室的阻力，通过选择与具有较高粘度的选择用于细胞培养腔室的介质相比具有较低粘度的用于连通通道的不同介质来进一步控制连通通道和细胞培养腔室二者的阻力。进一步注意地，连通通道是多向(例如，双向)型。在单向通道用于连通通道的情况中，系统不能对运输期间的压力的波动充分地作出反应。在本发明的优选实施方案中，连通通道配置成在微流体结构的储液器之间交换气体介质如氮气、氧气或空气。
[0012]
如本文所用，本发明的微流体细胞培养系统可以是包括至少一个微流体结构的任何系统，优选地包括多个微流体结构。这样的微流体细胞培养系统的实例包括微流体芯片、微流体微量滴定板、微量滴定板、微孔板或多孔板。如本文所用，微流体结构可以是由微流体通道的网络形成的结构。这样的微流体通道的网络可为多个微流体通道的复杂网络。然而，本发明的微流体结构还可包括微流体通道的相对简单的网络，例如由几个微流体通道或甚至单个微流体通道组成的网络。本发明的微流体结构还可以被称为微流体细胞培养单元。这样的微流体结构的实例是连接微孔板的两个孔的单个通道。
[0013]
此外，如本文所用，微流体结构的储液器可以是适用于微流体结构的任何类型的容器样结构。优选地，本发明的储液器可以由操作员如实验室技术人员分别地接收或排出注射至或提取自储液器的流体。此外，本发明的储液器优选地设计为接收用于对储液器提供压力的部件以推动注射至储液器的流体穿过连接至储液器的细胞培养腔室。用于对储液器提供压力的这样的部件可包括加压部件并且可包括移液管。在本发明的实施方案中，本发明的储液器设置有开口，所述开口位于微流体结构的面向本发明的微流体细胞培养系统的可拆卸密封件的内侧的表面中。
[0014]
本发明的微流体结构可进一步包括一个以上的毛细管压力屏障如相位引导件(phaseguide)，以在细胞培养腔室和/或一个以上的微流体通道内提供一个以上的子体积(subvolume)。这样的毛细管压力屏障或相位引导件是本领域已知的，例如在wo 2010/
086179 a2和wo 2014/038943 a1中。如从下文中所描述的示例性实施方案变得显而易见的，毛细管压力屏障不应被理解为可例如填充有含有一种以上的细胞或细胞聚集体的细胞培养基的液滴的壁或腔，而是理解为由确保这样的液滴不由于表面张力而分散的结构组成或包括所述结构。这个概念被称为弯月面钉止(meniscus pinning)。就此，可以实现将这样的液滴稳定限制至由微流体结构中毛细管压力屏障产生的子体积。在一个实例中，毛细管压力屏障可被称为限制性相位引导件，其配置成在微流体结构的正常使用期间或用第一流体初始填充微流体结构期间不溢出。
[0015]
在一个实例中，毛细管压力屏障包括以下或由以下组成：从细胞培养腔室和/或微流体通道的内表面突出的材料的边缘或凸起；或细胞培养腔室和/或微流体通道的内表面中的槽。边缘或凸起的侧壁可与边缘或凸起的顶部呈角α，所述角α优选尽可能地大。为了提供良好的屏障，角α应为大于70
°
、优选大于90
°
。对于凸起的侧壁和毛细管压力屏障位于其上的培养腔室或微流体通道的内表面之间的角α也是同样的。对于形成为槽的毛细管压力屏障存在类似的要求。
[0016]
毛细管压力屏障的可选形式是对细胞培养腔室或微流体通道的内表面具有不同润湿性的材料的区域，其起到由于毛细管力/表面张力而停止扩散的作用。在一个实例中，细胞培养腔室或微流体通道的内表面包含亲水性材料，并且毛细管压力屏障是疏水性或较小亲水性材料的区域。在一个实例中，细胞培养腔室或微流体通道的内表面包含疏水性材料，并且毛细管压力屏障是亲水性或较小疏水性材料的区域。
[0017]
因此，在本发明的特定实施方案中，毛细管压力屏障选自材料的边缘或凸起、槽、孔、或疏水线或其组合。在其它实施方案中，毛细管压力屏障可通过加宽微流体通道或通过所选间隔的柱来产生，该布置限定了由液滴占据的第一子体积或区域。在一个实例中，柱沿着微流体通道的整个高度延伸。
[0018]
作为存在毛细管压力屏障的结果，防止液体如含有细胞或细胞聚集体的液滴流出毛细管压力屏障，并且使得能够在微流体结构中形成液体的稳定限制性体积，例如在细胞培养腔室和/或微流体通道内的一个以上的子体积中。
[0019]
一个以上的毛细管压力屏障可将第一和第二储液器之间、经由细胞培养腔室的流体连通等分。通过设置具有一个以上的毛细管压力屏障的微流体结构，可设置微流体通道的多重网络以图案化细胞培养基，同时允许两个以上的通道如子体积之间的流体-流体相互作用。可设计一个以上的毛细管压力屏障使得子体积可彼此相互作用以交换子体积中所含有的培养基和/或培养基中所含有的组分。
[0020]
在本发明的实施方案中，在细胞培养腔室中配置一个以上的毛细管压力屏障以在细胞培养腔室中设置一个以上的子体积。一个以上的子体积的这样的形成甚至进一步增加了本发明的微流体结构中所包含的微流体通道的网络的复杂性。注意，一个以上的子体积可与本发明的至少一个微流体结构的第一和第二储液器流体连通。然而，可选地，一个以上的子体积可与至少一个微流体结构所包含的一个以上的其它储液器流体连通。
[0021]
为了避免包括一个以上的其它储液器的微流体结构的子体积中的细胞培养基或培养的细胞(例如，聚集体)的破裂、不正常、或破坏等，至少一个微流体结构的一个以上的其它储液器可经由其它连通通道(即，除了如上所述的连通通道以外的附加的连通通道)与至少一个微流体结构的另一储液器流体连通。这样的其它连通通道优选设计成具有对在一
个以上的其它储液器中产生的任何压力差的压力抵消作用。因此，优选地，穿过一个以上的其它储液器之间的其它连通通道的流体阻力低于穿过一个以上的其它储液器之间的一个以上的子体积的流体阻力。所述流体阻力与其它连通通道的平均截面逆相关、并与其它连通通道的长度相关。优选地，穿过其它连通通道的流体阻力比穿过一个以上的子体积的流体阻力低至少5倍，更优选低至少10倍，甚至更优选低至少50倍。
[0022]
通过采用纳维-斯托克斯方程(navier-stokes equation)、哈根-泊肃叶定律(hagen-poiseuille law)或其组合来估算流体阻力的差。还可以通过阻断连通通道并在预定压力下测定穿过细胞培养腔室的流量、接着阻断细胞培养腔室并在相同压力下测定穿过连通通道的流量来经验地确定流体阻力。穿过细胞培养腔室和穿过连通通道的流体阻力的差应优选为5倍、更优选为10倍、仍更优选为50倍。
[0023]
在本发明的一个实施方案中，配置微流体结构使得其它连通通道填充有比细胞培养腔室中的流体更低粘度的流体，例如气态流体。例如，在正常操作方向上，其它连通通道可位于比细胞培养腔室更高的位置，使得重力将确保气态流体填充其它连通通道而液体填充细胞培养腔室。
[0024]
本发明的微流体结构中所包括的细胞培养腔室可以是适用于培养细胞和/或组织等的任何类型的腔室。在本发明的实施方案中，微流体细胞培养系统包括一种以上的细胞和/或组织。细胞培养腔室、以及第一和第二储液器可进一步提供有包括固化剂和水性培养基的可逆性固化培养基。
[0025]
将可逆性固化培养基以液体形式添加至储液器并使其进入细胞培养腔室，其后使可逆性固化培养基固化。认为固化的固化培养基保护细胞培养腔室中的细胞培养物免于外部影响，例如免于运输期间的压力波动。
[0026]
为了提供固化培养基，其中曾固化的培养基可以恢复至液态，固化剂的质量相对于可逆性固化培养基的总质量的百分比为约1％至约10％。优选地，固化剂的质量相对于可逆性固化培养基的总质量的百分比为约2％至约8％。更优选地，固化剂的质量相对于可逆性固化培养基的总质量的百分比为约3％至约6％。
[0027]
优选的固化剂可选自由明胶、琼脂、黄原胶、海藻酸盐和其它非牛顿流体组成的组。优选的固化剂包括明胶。
[0028]
可逆性固化培养基用于保护微流体细胞培养系统的内容物免于在运输过程中的压力波动。运输后，通过首先熔融、其后抽吸可逆性固化培养基来从系统去除可逆性固化培养基。应注意不过度加热系统，因为温度高于约40℃可损害细胞培养腔室内的细胞培养物。
[0029]
在选择合适的固化剂时，所得水溶液的熔融温度应优选不高于40℃。也不应过低，因为这可能导致运输期间可逆性固化培养基的过度熔融。
[0030]
同样地，可以选择固化剂以实现与不同运输温度的最佳兼容性。当配置用于在室温下即通常约在18℃至24℃之间运输时，可逆性固化培养基的优选熔融温度为32℃至40℃之间，更优选35℃至38℃之间。当配置用于在约4℃下如在湿冰上或冷藏运输(refrigerated transport)中的冷运(cold shipment)时，可逆性固化培养基的典型优选熔融温度为8℃至40℃之间，更优选12℃至24℃之间。
[0031]
为了选择最佳固化剂，已知这样的选择取决于几个参数并且建议在现场谨慎使用，因为在特定情况中，一些固化剂可导致固化培养基在熔融温度中显示显著的滞后，即在
与固化培养基转变为液相的温度不同的温度下从液相转变为固相。此外，在其它情况中，一些固化剂可导致固化培养基具有较宽的熔融轨迹。对于各个这些构造，固化应优选高于0℃发生，熔融应优选高于7℃发生、更优选高于24℃、仍更优选高于32℃，但优选低于40℃。
[0032]
应注意，通过将熔融和固化温度调节至运输、处理期间和培养中期望的典型温度，可选择优选的固化剂用于最佳的易用性、与细胞培养系统的内容物的温度偏好的兼容性和鲁棒性(robustness)。
[0033]
本发明的微流体细胞培养系统中所包括的连通通道可以是适用于在微流体结构的储液器之间提供流体连通的、配置在微流体结构的储液器之间的任何类型的连通通道。在一个实施方案中，连通通道包括设置在至少一个微流体结构中的通路(passage)。在其它实施方案中，连通通道包括设置在至少一个微流体结构的面向可拆卸密封件的内侧的表面中的凹槽。所述通路和凹槽二者配置为用于将至少一个微流体结构的储液器以流体连通的方式连接。可选地，可拆卸密封件配置成气密性密封至少一个微流体结构，使得密封件的内侧配置成位于距至少一个微流体结构一定距离处。通过这种方法，内侧处于距至少一个微流体结构的储液器(即，储液器面向可拆卸密封件的内侧的开口)一定距离处，在微流体结构之间提供了间隙，并由此提供在微流体结构的储液器之间的连通通道。
[0034]
在本发明的微流体细胞培养系统的实施方案中，微流体细胞培养系统包括多个微流体结构，从而形成包括多个微流体结构的微流体微量滴定板。包括多个微流体结构的微流体细胞培养系统中所包括的各个微流体结构包括至少两个储液器，所述至少两个储液器经由微流体结构中所包括的细胞培养腔室彼此流体连通。为了避免在包括多个微流体结构的微流体细胞培养系统的运输期间细胞培养腔室中细胞培养基、培养的细胞(例如聚集体)的破裂、不规则或破坏等，至少两个储液器还经由如上限定的连通通道彼此流体连通。此外，一个微流体结构的一个以上的储液器可与一个以上的其它微流体结构的一个以上的储液器流体连通。因此，形成不同微流体结构的流体连通的储液器的互连连通网络。此外，可将此类不同微流体结构的流体连通的储液器的互连连通网络分为包括彼此流体连通的选择数量的不同微流体结构的几个子网络的网络。为了提供这样的子网络的组合，可在可拆卸密封件和多个微流体结构之间设置有网格结构(grid structure)。网格结构限定多个网格部分(grid section)，其中各网格部分包围一个以上的完整微流体结构。发现通过设置网格结构，进一步改善了运输期间的微流体细胞培养系统的鲁棒性。
[0035]
在本发明的微流体细胞培养系统的优选实施方案中，微流体细胞培养系统配置为使得由一个可拆卸密封件密封多个微流体结构。替代使用多个不同的可拆卸密封件，优选单个可拆卸密封件，例如用于覆盖微流体微量滴定板的孔的盖板。
[0036]
为了满足标准微量滴定板格式的尺寸，至少一个微流体结构的尺寸可为使得其对应于微量滴定板的一个以上的孔或微量滴定板的一组孔。优选地，至少一个微流体结构的尺寸与具有96、384、或1536个孔的微量滴定板的一个以上的孔相对应。
[0037]
可拆卸密封件可至少部分地包括半渗透屏障，其配置成允许从微流体细胞培养系统至其外部环境交换和/或反之亦然。半渗透屏障可以配置成对于一种以上的预定物质或量如气体介质、湿度、热、水分、颗粒、微生物、电、辐射和/或病毒为不可渗透的。此外，或可选地，可拆卸密封件可包括通风口，优选地单向通风口，用于提供从至少一个微流体结构的储液器至微流体细胞培养系统的外部环境的流体连通和/或反之亦然。
[0038]
除了使用可拆卸密封件密封微流体细胞培养系统以外，微流体细胞培养系统可通过密封包装材料(sealing packing)来进一步密封。这样的密封包装材料可配置成隔绝和/或保护微流体细胞培养系统免于外部影响，例如温度波动、机械力、电、渗透、损伤、污染和/或水分。
[0039]
此外，微流体细胞培养系统可根据用于危险品运输的相关法律和/或指南进行包装。在本发明的实施方案中，微流体细胞培养系统根据un3373标准进行包装。优选地，微流体细胞培养系统与吸收性材料一起包装在防漏袋中，优选进一步包含在防漏和吸震的另一容器中。
[0040]
在本发明的另一方面，本发明涉及一种运输微流体细胞培养系统的方法，所述方法包括以下步骤：
[0041]-提供一个以上的微流体结构，其中一个以上的微流体结构任选地包含细胞外基质和/或细胞或细胞聚集体，和其中微流体结构任选地包含固化的固化培养基；
[0042]-密封一个以上的微流体结构以形成根据本发明所述的微流体细胞培养系统；和
[0043]-运输密封的微流体细胞培养系统。
[0044]
根据本发明的方法，在存在固化培养基的情况中，固化培养基可替代微流体结构中存在的任何细胞培养基的全部或部分。
[0045]
本发明的方法可进一步包括以下步骤：
[0046]-在运输所述微流体细胞培养系统后，解封一个以上的微流体结构；
[0047]-任选地，允许一个以上的微流体结构内的固化的固化培养基液化；
[0048]-任选地，向储液器添加新鲜的细胞培养基。
[0049]
所述方法是基于以下见解：尽管密封了微流体结构，即使用了可拆卸密封件，但储液器之间设置的连通通道将平衡在微流体结构中在运输期间发生的任何压力波动。有利地，将可逆性固化培养基添加至微流体细胞培养系统。其以液体形式添加，然后允许其固化。固化的固化培养基提供针对运输期间的压力波动的附加防护。
[0050]
通常，将可逆性固化培养基添加至包含细胞培养物(例如包括caco-2管的管)的微流体细胞培养系统，并用细胞培养基灌注。为了制备用于运输的微流体细胞培养系统，首先从储液器去除细胞培养基，其后将液化的固化培养基添加至储液器并使其固化。运输后，小心地再液化固化培养基并从储液器去除。该步骤后，将细胞培养基添加至储液器以再次开始灌注细胞培养腔室内的细胞培养物。
[0051]
可选地，可以省略细胞培养基的去除、或仅部分地进行，其后，除了剩余细胞培养基以外，将可逆性固化培养基添加至装置。这可导致固化剂与细胞培养基混合，仍导致所有培养基的固化。这也可导致一部分体积的培养基固化，而另一部分体积仍是液体。在优选实施方案中，从储液器去除细胞培养基，但不从细胞培养腔室去除。将可逆性固化培养基添加至储液器并使其固化，导致储液器中固化的培养基庇护细胞培养腔室中未固化的细胞培养基免于外部影响，潜在地抵抗流动和/或位移。应注意，可容易地调整这样的构造以实现通过以任何顺序去除和添加细胞培养基和可逆性固化培养基来固化和液化子体积的任何构造。
[0052]
细胞外基质是本领域技术人员已知的并且可以是任何合适的物质或物质的组合，例如水凝胶，例如包含i型胶原。
[0053]
在本发明的又一方面，本发明涉及包含一个以上的微流体结构和密封件的套件。一个以上的微流体结构和密封件配置为以组装形式形成本发明的微流体细胞培养系统。
具体实施方式
[0054]
实施例
[0055]
图1.使用organoplate平台建模肠小管(trietsch等ncomms,2017)
[0056]
平台包括嵌入在标准384孔微量滴定板格式中的40个微流体细胞培养结构(图1的a和b，trietsch等ncomms,2017)trietsch等lab chip,2013，wevers等sci.rep.,2016。各个微流体通道结构由连接至微量滴定板的相应孔的三条跑道(lane)构成，所述跑道起到接入微流体培养的入口和出口的作用。跑道在结构的中央连接，在那里存在称为相位引导件(vulto等lab chip,2011)的两个毛细管压力屏障。图1的c-j，trietsch等ncomms,2017显示微流体结构的中央的垂直和水平截面以及生长管状结构的方法的示意图。首先，在中央跑道引入ecm凝胶(图1的c、d，trietsch等ncomms,2017)。相位引导件用于通过弯月面钉止而在中央跑道中选择性图案化ecm凝胶。弯月面延展并超出相位引导件，形成曲面形状。ecm凝胶化后，在一个侧向跑道中接种上皮细胞，通过以垂直位置放置滴定板、即在一侧站立，使它们直接沉积在ecm凝胶上(图1的e-h，trietsch等ncomms,2017)。在附着细胞的情况下，将板水平放置于间歇式摇床(interval rocker)，其通过储液器之间的相互调平来诱导流动。在进行流动的情况下，细胞增殖并且开始在灌注通道的所有表面上排列，形成汇合管状结构(图1的i、j，trietsch等ncomms,2017)。小管具有连接至相应跑道的入口和出口的腔，使它们可由培养基灌注并用于顶端化合物暴露。上皮的基底面面向ecm凝胶并且可通过ecm凝胶跑道的对向侧的第二灌注跑道接入。图1的k，trietsch等ncomms,2017，描述了管的3d构造的艺术效果图(artist impression)，显示管直接在ecm上生长，而不存在人工膜。为了建模肠屏障，使用了人肠结直肠腺癌细胞系(caco-2)。图1的l-p，trietsch等ncomms,2017，显示在第0、1、4、7、和11天分别从观察窗孔取得的管形成的相衬图像。在第0天，在ecm上接种细胞并开始在玻璃壁定殖以形成汇合管(图1的n-p，trietsch等ncomms,2017)。灌注对于管形成是重要的。
[0057]
图2.将中的caco-2培养物从mimetas leiden运输至位于美国马里兰州的mimetas us。
[0058]
使用微量滴定板密封以行业标准方式运输板。明视场图像用于捕获运输之前和之后的培养物的状态。如先前所述，在中生长caco-2培养物(改编自trietsch等ncomms,2017)。使用自动化成像系统(molecular devices,imagexpress pico)、由明视场成像来捕捉管培养，然后准备用于运输。这需要通过每100ml的caco-2培养基溶解2.5g的明胶粉末(sigma g9391)、并一旦溶解用0.22μ过滤器过滤来制备2.5％明胶-培养基溶液。抽吸的入口/出口中的所有培养基，将40μl的温热的明胶-培养基添加至各入口/出口。将粘合性透明密封件(vwr目录391-1251)置于上部并按压以完全密封板中所有的单孔。然后将板置于用于运输的盒中。到达后，用自动化成像系统(biotek,cytation 1cell imaging reader)在mimetas us取得明视场图像，并与在mimetas leiden包装前取得的那些相比较(图2a)。单个芯片图像的放大图显示运输前后的管形态的差异(图2b)。采
用该包装方法，存在损坏的许多caco-2管，由管塌陷或管扩张至ecm跑道而目视可见，如箭头所示(图2a-b)。
[0059]
图3.用于微流体芯片的流体连通的第二途径的建立
[0060]
连通的第二途径允许均匀平衡运输期间的潜在压力差。为了模拟经由航空货运的运输，使用真空泵和气密tupperware来建立低压室。如前所述产生管培养物，并在运输模拟之前，用明视场成像目视评价它们的形态，并使用屏障完整性检验评价它们的功能性(trietsch等ncomms,2017，wo2017/007325a1)。为此，将4.4kda tritc-dextran(sigma-aldrich t1037)以0.5mg/ml稀释至培养基，添加至所有顶部通道，并在自动化成像系统上、在t＝15分钟后用tritc显微镜滤光片成像观察窗。对于包装处理，抽吸所有的入口/出口，并且如下将不同的培养基溶液添加至各入口/出口(图3a)：第1行：40μl的如上所述制备的2.5％明胶-培养基，第2行：40μl的用5g/100ml的培养基如上所述制备的5％明胶-培养基，第3行：120μl的如上所述制备的2.5％明胶-培养基，第4行：120μl的用5g/100ml的培养基如上所述制备的5％明胶-培养基，第5行：120μl培养基。在运输前，在imagexpress pico自动化显微镜上、使用透射光明视场成像板的观察窗。如先前进行的，用粘合性透明密封件来密封一个而其它的仅在盖的周边(perimeter)处密封而不密封分别的单孔。然后将两个板置于真空室。通过以下来进行运输模拟：将室中的压力降低至800mbar 18分钟以诱导压力变化、然后恢复至大气压力和室温过夜以模拟地面转运的持续时间。第二天早晨，如上所述，用imagexpress pico捕获明视场图像并进行另一屏障完整性检验。将运输前后获得的明视场(图3b-e)和t＝15分钟tritc荧光图像(图3f-g)二者相比较。模拟运输后的具有单个的密封的孔的板的图像(图3b、d、f)显示，除了通过tritc-dextran渗透至ecm通道而观察到的降低屏障功能(图3f)以外，芯片中损坏的caco-2管和泡二者(图3b、d)。具有周边密封的板的图像显示caco-2管结构无可见的位移或损坏(图3c、e)，和对屏障功能的略微改变(图3g)。这些观察结果量化为功能性管相对于运输模拟前的板上的功能性管的数量的百分比(图3h)，其中粘合性密封的板中，形态完整和功能性屏障管二者明显减少。该研究确证了压力变化下的微流体板中caco-2培养物的破坏是由于密封，其中流体连通仅允许穿过微流体通道其自身。通过仅周边密封，流体连通可以穿过孔的顶部并且任何压力差可经由该途径平衡以维持芯片中的组织结构。
[0061]
图4.用于微流体芯片的流体连通的第二途径的建立
[0062]
采用真实运输的所提出的方法的结果。为了确证现实生活运输的可行性，在不单个密封细胞培养装置的所有储液器的情况下，将一批中的caco-2培养物从mimetas leiden运送至mimetas us。如上所述生长caco-2培养物，通过抽吸所有入口/出口培养基并替换为40μl 2.5％或4％明胶-培养基来包装。(1-4栏为2.5％，5-8栏为4％)。对装置进行周边密封，这密封了装置的储液器免于外部影响，但允许孔之间的流体连通。选择培养基组成以维持凝胶化溶液，使其在正常运输力期间不溢出板。应注意，尽管凝胶化溶液可以承受惯性力以避免溢出，这样的凝胶化溶液通常不可承受通过与单个密封的储液器的运输相关的压力变化而诱导的压力差，通过ecm和细胞的位移或其它变形而如上示出的。在mimetas leiden、在运输之前用imagexpress pico自动显微镜捕捉明视场图像，和在运输至mimetas us之后用cytation 1自动显微镜捕捉明视场图像。包装和压力数据记录器
(madgetech，prhtemp101a)一起发送以记录绝对压力。将之前和之后的图像相比较，在接收的板中发现无损坏、位移、或被困气泡(图4a-b)。数据记录器确实显示了运输期间的几个压力的波动并达到818mbar的最小值(图4c)。比较从荷兰至美国的不同板和运输，在真实的快递运输后，所提出的方法导致比粘合性密封方法更高的百分比的功能性管组织(图4d)。这确证了在微流体细胞培养系统的储液器中使用凝胶化培养基，在那里多个储液器彼此流体连通，形成了运输微流体滴定板的可行方法。
[0063]
图5显示包括由可拆卸密封件3密封的一个微流体结构2的微流体细胞培养系统1的示意图。微流体结构2包括第一储液器4和第二储液器5。储液器4、5二者经由细胞培养腔室6以及经由连通通道7流体连通。细胞培养腔室6填充有细胞培养基8。选择细胞培养基8的体积使得细胞培养腔室6像这样完全填充有培养基8。通过在第一储液器4和第二储液器5之间设置连通通道7，在储液器的一者中突然的压力的增加(δp)经由连通通道7容易地平衡，而不是对细胞培养腔室6中含有的细胞培养基8造成突然的压力的增加。通过在图5所示的箭头的厚度在图5中示出用于细胞培养腔室6和连通通道7的不同介质的流体阻力。第一储液器4和第二储液器5之间的流体连通线由穿过细胞培养腔室6的第一箭头p1和穿过连通通道7的第二箭头p2示出。细胞培养腔室6中培养基8的流体阻力显著高于连通通道7中介质的流体阻力，导致介质通过第一储液器4中增加的压力经由连通通道7从第一储液器4向第二储液器5的主要流动。
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图6a和6b显示由可拆卸密封件13密封的包括多个微流体结构12的微流体细胞培养系统10的示意图。各个微流体结构12包括经由细胞培养腔室16彼此流体连通的第一储液器14和第二储液器15。微流体结构12的第一和第二储液器14、15进一步经由中央连通通道17彼此流体连通，所述中央连通通道17由密封13的内侧和各个储液器14、15的上开口之间的间隙形成。再次，储液器14、15的一者中的任何压力增加可通过提供穿过连通通道17、而不是穿过微流体结构12中包含的一个以上的细胞培养腔室16的压力的主要流动来容易地平衡。在图6b中，微流体细胞培养系统10进一步设置有网格结构11，其中所述网格结构11包围一个以上的完整微流体结构12。在图6n中，网格结构11包围一个单个微流体结构12。
[0065]
图6c显示微流体细胞培养系统10的透视图，所述微流体细胞培养系统10的示意图示于图6b。在图6c中，可视化网格结构11以及微流体结构12。
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图7a至7f显示用于运输微流体细胞培养系统的方法中的步骤的示意性描述。图7a显示包括细胞培养腔室26的微流体细胞培养系统20，其中培养细胞并灌注细胞外基质。例如caco-2细胞等细胞通常以管状结构或管的形式培养(未示出)。图7中示出的细胞、细胞外基质和细胞培养基的组合由点状图案填充并具有附图标记281。微流体结构22还包括储液器24和25，其填充有细胞培养基28用于灌注细胞培养腔室26内的管。注意，图7a的示意图是高度简化的并且不显示储液器24、25中的培养基28如何确切地进入包括管和细胞外基质的细胞培养腔室26。有利地，微流体结构22具有如图1中示意性示出的构造。
[0067]
为了制备微流体细胞培养系统20用于运输，在第一步骤中，抽吸储液器24、25中的培养基28(图7b)。
[0068]
在下一步骤中，在图7c中所示，将温热的液化的可逆性固化培养基29如2.5％明胶溶液添加至储液器24、25，从而填充细胞培养腔室26。使可逆性固化培养基29固化并由瓦片状(shingle)填充图案表示。为了简单起见，细胞培养腔室26的内容物由点状填充图案显
示，表明细胞和细胞外基质，尽管可逆性固化培养基29还可存在于细胞培养腔室26中。
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通过用可拆卸密封件23覆盖微流体细胞培养系统20，从周围环境封闭微流体结构，并产生储液器24和25之间的连通通道27(图7d)。现在可将整个系统运输至其目的地。运输期间产生的任何压力波动，例如微流体细胞培养系统处于飞机货舱中、在10km的海拔高度下的结果，将通过连通通道27减轻并由固化的可逆性固化培养基29吸收。
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运输后，小心地去除可拆卸密封件23并加热微流体细胞培养系统20以再液化可逆性固化培养基29。应小心地进行加热以不损伤细胞培养腔室26内的细胞培养物。当所述培养基29再次转变为液体时，将其从微流体细胞培养系统20吸出(图7e)。
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将新鲜的细胞培养基28添加至储液器24、25，其后，可再次灌注细胞培养腔室26及其内容物281(图7f)。注意，图7f中所示步骤显示不同位置上的图7a中所描绘的起始状态。
[0072]
图7g和7h(a)-(c)示意性描述了其中除了细胞培养基28以外，将可逆性固化培养基29添加至储液器24、25和将可逆性固化培养基29添加至细胞培养基28之上的方法。图7g中描述了可逆性固化培养基29快速固化且不与细胞培养基28混合的情况。图7h(a)-(c)显示3个后续步骤。图7h(a)显示含有细胞培养28的储液器24、25和细胞培养腔室26包含细胞的混合物，例如以管、细胞外基质和细胞培养基的形式，混合物表示为281。可减少细胞培养基的体积以避免在添加可逆性固化培养基29时溢出。步骤ii(图7h(b))显示如何将可逆性固化培养基29以液体形式添加至储液器24、25，然而步骤iii(图7h(c))显示将可逆性固化培养基29和细胞培养基28混合成混合培养基291并固化的情况。注意，液体可逆性固化培养基29还与存在于细胞培养腔室26中的细胞培养基28混合，导致细胞的管和细胞外基质由混合培养基291包围并浸润的情况。为了清楚起见，将细胞、细胞外基质和固化的混合培养基291的整体表示为混合物282。注意，图7h(c)是高度简化的示意图。实际上，培养基291和混合物282之间没有清晰的分界线。