再生功能神经元以治疗出血性中风的制作方法

再生功能神经元以治疗出血性中风
1.相关申请交叉引用
2.本技术要求于2019年10月17日提交的美国专利申请序列第62/916,706号的权益。在先申请的公开内容被视为本技术的公开内容的一部分(并且通过引用并入本技术的公开内容中)。
技术领域
3.本文档涉及涉及治疗患有出血性中风的哺乳动物的方法和材料。例如，本文档提供了用于向患有出血性中风的哺乳动物施用含有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸和编码dlx2多肽(或其生物活性片段)的核酸的组合物的方法和材料。


背景技术：

4.中风是一种影响通向脑和脑内的动脉的疾病。在美国，中风是第五大死亡原因以及残疾的主要原因。当携带氧气和营养物质至脑的血管被凝块阻塞或破裂时，就会发生中风(bonnard等人，《中风(stroke)》，50：1318-1324(2019))。当这种情况发生时，部分脑无法获得其需要的血液(和氧气)，因此其和脑细胞都会死亡。中风可以由阻塞血液流向脑(称为缺血性中风)的凝块或由血管破裂和阻止血液流向脑(称为出血性中风)引起。短暂性缺血性发作(tia)或“小中风”是由暂时性凝块引起的。神经成像、组织化卒中医疗(organized stroke care)、专用神经-icu以及医疗和外科手术管理的最新进展已经改善了出血性中风的管理。然而，对于患有出血性中风的患者的治疗，仍存在显著的未满足的需要。


技术实现要素：

5.本文档提供了涉及治疗患有出血性中风的哺乳动物的方法和材料。例如，本文档提供了用于向患有出血性中风的哺乳动物施用含有编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸和编码dlx2多肽(或其生物活性片段)的核酸的组合物的方法和材料。
6.通常，本文档的一方面的特征在于用于在患有出血性中风并且需要(1)产生新的谷氨酸能神经元；(2)增加gaba能神经元的存活率；(3)产生新的非反应性星形胶质细胞；或(4)减少反应性星形胶质细胞的数量的哺乳动物体内进行所述(1)、(2)、(3)或(4)的方法。所述方法包括(或基本上由以下组成或由以下组成)向所述哺乳动物施用包括编码神经源性分化1(neurod1)多肽或其生物活性片段的外源性核酸以及编码远端缺失同源盒2(dlx2)多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物。所述哺乳动物可以是人。所述出血性中风可能是由于选自由以下组成的组的病状引起的：缺血性中风；身体损伤；肿瘤；炎症；感染；由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的全局缺血；由缺氧、低血糖或贫血引起的缺氧-缺血性脑病；脑膜炎；以及脱水；或其任何两种或更多种的组合。所述施用步骤可以包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的表达载体。所述施用步骤可以包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的重组病
毒表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的重组病毒表达载体。所述施用步骤可以包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的重组腺相关病毒表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的重组腺相关病毒表达载体。所述施用步骤可以包括向脑中的所述出血性中风的位置进行立体定向颅内注射。所述施用步骤可以进一步包括在一个表达载体、一个重组病毒表达载体或一个重组腺相关病毒表达载体上施用编码neurod1多肽或其生物活性片段的所述外源性核酸以及编码dlx2多肽或其生物活性片段的所述外源性核酸。所述组合物可以包括约1μl到约500μl的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体含有浓度为10
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个腺相关病毒颗粒/毫升的包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸以及编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的载体的腺相关病毒。可以将所述组合物以约0.1微升/分钟到约5微升/分钟的受控流速注射到所述哺乳动物的脑中。
7.另一方面，本文档的特征在于用于在患有出血性中风并且需要(1)产生新的gaba能和谷氨酸能神经元；(2)增加gaba能和谷氨酸能神经元的存活率；(3)产生新的非反应性星形胶质细胞；或(4)减少反应性星形胶质细胞的数量的哺乳动物体内进行所述(1)、(2)、(3)或(4)的方法。所述方法包括(或基本上由以下组成或由以下组成)在发生所述出血性中风3天内向所述哺乳动物施用包括编码神经源性分化1(neurod1)多肽或其生物活性片段的外源性核酸以及编码远端缺失同源盒2(dlx2)多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物。所述哺乳动物可以是人。所述出血性中风可能是由于选自由以下组成的组的病状引起的：脑出血；动脉瘤；颅内血肿；蛛网膜下出血；脑外伤；高血压；血管薄弱；血管畸形；缺血性中风；身体损伤；肿瘤；炎症；感染；由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的全局缺血；由缺氧、低血糖或贫血引起的缺氧-缺血性脑病；脑膜炎；以及脱水；或其任何两种或更多种的组合。所述施用步骤可以包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的表达载体。所述施用步骤可以包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的重组病毒表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的重组病毒表达载体。所述施用步骤可以包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的重组腺相关病毒表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的重组腺相关病毒表达载体。所述施用步骤可以包括向脑中的所述出血性中风的位置进行立体定向颅内注射。所述施用步骤可以进一步包括在一个表达载体、一个重组病毒表达载体或一个重组腺相关病毒表达载体上施用编码neurod1多肽或其生物活性片段的所述外源性核酸以及编码dlx2多肽或其生物活性片段的所述外源性核酸。所述组合物可以包括约1μl到约500μl的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体含有浓度为10
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个腺相关病毒颗粒/毫升的包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸以及编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的载体的腺相关病毒。可以将所述组合物以约0.1微升/分钟到约5微升/分钟的受控流速注射到所述哺乳动物的脑中。
8.除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文所提及的
所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入本文。在发生冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
9.本发明的其它特征和优点通过以下详细描述以及权利要求书而变得显而易见。
附图说明
10.图1a-1b：胶原酶诱导的脑内出血(ich)模型中的铁进化。(图1a)在中风后1天和2天(dps)，通过铁染色检测到非常低水平的三价铁，并且如通过dab染色确定的，小胶质细胞开始迁移到血肿中。(图1b)在中风后8天和29天，通过铁染色在损伤核心中检测到高水平的铁，与小胶质细胞混合，并且如通过dab染色确定的，星形胶质细胞在损伤核心周围形成胶质瘢痕。这些结果表明，不晚于中风后2天的治疗可能是优选的。
11.图2a-2p：星形胶质细胞向神经元的转化。图2a是示出了在胶原酶诱导的ich模型中将星形胶质细胞的体内会话转换为功能神经元的示意图。图2b是用于证实在ich模型(脑内出血)中反应性星形胶质细胞向神经元的体内转化的实验设计。通过将0.2μl的胶原酶注射到纹状体中诱导ich。对照病毒是aav5-gfap-cre(3
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；1μl) aav5-cag-flex-gfp(3.4
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；1μl)，并且处理病毒是aav5-gfap-cre(3
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；1μl) aav5-cag-flex-nd1-gfp(4.55
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；1μl) aav5-cag-flex-dlx2-gfp(2.36
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；1μl)。图2c示出了在用在中风后0天注射的nd1和dlx2病毒感染后21天(dpi)的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。观察到轻度ich。gfap信号在损伤中下调。大多数gfp

细胞显示出神经元形态。图2d示出了在用设计用于表达在中风后0天注射的nd1和dlx2的病毒感染后21天的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。数字1、2和3是指损伤核心周围的三个附近区域。大多数gfp

细胞表达neun。(图2e)在中风后2天用对照或处理病毒诱导后19天，许多gfp

细胞在处理侧显示出神经元形态。图2f示出了在中风后2天设计用于表达nd1和dlx2的病毒诱导后19天的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。数字1、2和3是指损伤核心周围的三个附近区域。许多gfp

细胞表达neun。(图2g)在中风后4天用对照或处理病毒诱导后17天，更少gfp

细胞在处理侧显示出神经元形态。图2h示出了在中风后4天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒诱导后17天的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。数字1、2和3是指损伤核心周围的三个附近区域。一些gfp

显示出神经元形态，而一些则是星形胶质细胞。(图2i)在中风后7天用对照或处理病毒诱导后14天，几乎没有观察到具有神经元形态的gfp

细胞。图2j示出了在中风后7天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒诱导后14天的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。数字1、2和3是指损伤核心周围的三个附近区域。几乎所有gfp

细胞保持星形胶质细胞形态。图2k示出了对于正常对照、对于病毒对照以及对于在中风后0天、中风后2天、中风后4天或中风后7天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒处理的处理小鼠，gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。观察到gfp

神经元减少、神经元密度降低以及反应性星形胶质细胞增多，以及注射时间点延迟。最佳时间点不应长于中风后2天。图2l示出了在处理组和对照组两者中观察到的gfap的消失。图2m示出了在用对照病毒诱导后21天gfap和neun信号的消失。图2n显示，虽然在处理小鼠的gfap缺失区域存在s100b信号，但在对照组小鼠的同一区域没有s100b信号。(图2o)在中风后2天用对照或处理病毒诱导后19天，s100b信号出现下调。图2p示出了处理组中s100b的下调，而s100b信号仍然显示出对照组中反应性星形胶质细胞的形态。
12.图3a-3h：ich中反应性星形胶质细胞向神经元的体内转化(长期)。图3a是用于证实在ich中反应性星形胶质细胞向神经元的体内转化(长期)的实验设计。通过将0.35μl的胶原酶注射到纹状体中诱导ich。对照病毒是aav5-gfap-cre(3
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；1μl) aav5-cag-flex-gfp(3.4
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；1μl)，并且处理病毒是aav5-gfap-cre(3
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；1μl) aav5-cag-flex-nd1-gfp(4.55
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；1μl) aav5-cag-flex-dlx2-gfp(2.36
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；1μl)。图3b示出了在中风后0天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒处理的小鼠在诱导后2个月的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。观察到轻度ich。大多数gfp

细胞是神经元样的。图3c示出了在中风后0天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒处理的小鼠在诱导后2个月的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。几乎所有gfp

细胞表达neun。图3d示出了在中风后2天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒处理的小鼠在诱导后2个月的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。病毒感染并不广泛，并且可能过于靠近心室。图3e示出了在中风后7天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒处理的小鼠在诱导后2个月的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。观察到轻度ich。观察到许多gfp

神经元样细胞。图3f示出了在中风后7天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒处理的小鼠在诱导后2个月的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。观察到的感染率低于中风后0天的感染率。图3g示出了在中风后0天用对照病毒处理的小鼠在诱导后2个月的gfp、gfap和neun的免疫荧光染色。许多gfp

细胞仍然是星形胶质细胞，同时观察到一些gfp

神经元。图3h含有绘制了如所指示处理的小鼠的转化(或泄漏)率(％)(左图)以及神经元密度(细胞数
×
104/mm3)(右图)的图。由于低效的病毒感染，排除了中风后2天-2个月数据。中风后0天-2个月实现了最高转化率(86％)以及最高神经元密度(147,000/mm3)。
13.图4a-4f：aav9-非浓缩的1.6kb-gfap-cre/flex系统。图4a示出了在中风后2天用对照病毒(aav9-非浓缩的1.6kb-gfap-cre aav9-flex-mcherry；左)或处理病毒(aav9-非浓缩的1.6kb-gfap-cre aav9-flex-nd1-mcherry aav9-flex-dlx2-mcherry；右)诱导后19天的rfp染色。在每种情况下，使用0.2μl(0.03单位)的胶原酶来诱导中风。图4b示出了在中风后2天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒诱导后19天的neun、nd1和rfp的免疫荧光染色。没有多少神经元过表达nd1，但仍然检测到nd1的信号。图4c示出了在中风后2天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒诱导后19天的neun、dlx2和rfp的免疫荧光染色。大多数神经元表达dlx2，并且所述神经元中的一些神经元不显示rfp信号。图4d示出了在中风后2天用对照病毒或处理病毒诱导后19天的gfap、rfp和neun的免疫荧光染色。处理组中的rfp信号减弱。aav9-非浓缩的cre中仍存在高泄漏。图4e示出了在中风后2天用对照病毒或处理病毒诱导后19天的ibal和rfp的免疫荧光染色。处理组中的小胶质细胞似乎比对照组中的小胶质细胞更具反应性。图4f示出了在中风后2天用对照病毒或处理病毒诱导后19天的aqp4(水通道蛋白4)和rfp的免疫荧光染色。在aqp4染色中未观察到对照组与处理组之间的显著差异。
14.图5a-5e：aav5-1.6kb-gfap-cre/flex系统。图5a示出了在中风后2天用对照病毒(aav5-1.6kb-gfap-cre aav5-flex-gfp；左)或处理病毒(aav5-1.6kb-gfap-cre aav5-flex-nd1-gfp aav5-flex-dlx2-gfp；右)诱导后19天的gfp染色。在每种情况下，使用0.2μl(0.03单位)的胶原酶来诱导中风。图5b示出了在中风后2天用设计用于表达nd1和dlx2的病毒诱导后19天的neun、gfp、nd1和dlx2的免疫荧光染色。未检测到nd1信号。许多神经元过表达dlx2。通常，信号弱于用aav9观察到的信号。图5c示出了在中风后2天用对照病毒或处理病毒诱导后19天的gfap、gfp和neun的免疫荧光染色。处理组中的星形胶质细胞在整个纹状
体中表现出更具反应性。对照组中的星形胶质细胞仅在损伤核心周围表现出更具反应性。图5d示出了在中风后2天用对照病毒或处理病毒诱导后19天的iba1和gfp的免疫荧光染色。在对照组中，反应性小胶质细胞密集地分布于损伤核心中，而在处理组中，也在周围损伤区域中观察到反应性小胶质细胞。图5e示出了在中风后2天用对照病毒或处理病毒诱导后19天的aqp4和rfp的免疫荧光染色。处理组中的aqp4的信号潜在地略强于对照组中观察到的信号。
15.图6a-6e：图6a示出了在中风后2天用对照病毒(aav5-1.6kb-gfap-cre-5-flex-gfp)诱导后14天的gfp、gfap和neun染色，所述对照病毒用0.5μl(0.075单位)的胶原酶诱导。图6b示出了在中风后2天用处理病毒(aav5-1.6kb-gfap-cre-5-flex-nd1-gfp-5-flex-dlx2-gfp)诱导后14天的轻度中风的gfp、gfap和neun染色，所述处理病毒用0.5μl(0.075单位)的胶原酶诱导。图6c示出了在中风后2天用处理病毒(aav5-1.6kb-gfap-cre-5-flex-nd1-gfp-5-flex-dlx2-gfp)诱导后14天的严重中风的gfp、gfap和neun染色，所述处理病毒用0.5μl(0.075单位)的胶原酶诱导。图6d示出了在中风后2天用处理病毒(aav5-0.6kb-gfap-cre aav5-flex-nd1-gfp aav5-flex-dlx2-gfp)诱导后2个月的轻度中风的gfp、gfap和neun染色，所述处理病毒用0.5μl(0.075单位)的胶原酶诱导。在中风后1天进行mri图像。图6e示出了在中风后2天用处理病毒(aav5-0.6kb-gfap-cre aav5-flex-nd1-gfp aav5-flex-dlx2-gfp)诱导后2个月的严重中风的gfp、gfap和neun染色，所述处理病毒用0.5μl(0.075单位)的胶原酶诱导。在中风后1天进行mri图像。
16.图7：血肿直到中风后7天才溶解。在中风后2天用对照病毒(aav9-非浓缩的gfap-cre aav9-flex-mcherry)诱导后4天的rfp染色，所述对照病毒用0.2μl(0.03单位)的胶原酶诱导。如果在中风后7天之前原位注射病毒，则病毒将进入血肿。血肿的存在可能阻碍病毒靶向星形胶质细胞。
17.图8：在ich后反应性星形胶质细胞的增殖峰值为约中风后7天。星形胶质细胞在中风后4天具有反应性并且在中风后8天之前开始形成胶质瘢痕。还参见，sukumari-ramesh等人，《神经外伤杂志(j.neurotrauma)》，29(18)：2798-28044(2012))。
18.图9：除了病毒注射时间点之外，不同的损伤条件也可能影响星形胶质细胞到神经元的转化率。在中风后2天、4天或7天用处理病毒(aav5-0.6kb-gfap-cre aav5-flex-nd1-gfp aav5-flex-dlx2-gfp)诱导后19、17或14天的gfp染色，所述处理病毒用0.2μl(0.03单位)的胶原酶诱导。
19.图10a-10d：在相当的损伤条件下，星形胶质细胞与神经元转化率的比较。小鼠#1在中风后2天接受处理病毒(aav5-0.6kb-gfap-cre aav5-flex-nd1-gfp aav5-flex-dlx2-gfp)，所述处理病毒用0.325μl(0.05单位)的胶原酶诱导。小鼠#2在左脑区域中风后7天内接受对照病毒(aav5-0.6kb-gfap-mcherry-cre aav5-flex-gfp)并且在右脑区域中风后7天内接受处理病毒(aav5-0.6kb-gfap-cre aav5-flex-nd1-gfp aav5-flex-dlx2-gfp)，所述对照病毒和处理病毒在每一侧用0.2μl(0.03单元)的胶原酶诱导。图10a示出了小鼠#1(顶部)在中风后1天和小鼠#2(底部)在中风后3天的mri扫描。图10b示出了在诱导后14天的小鼠#1和小鼠#2的gfp、gfap和neun染色。图10c示出了关于这两只小鼠的血肿大小的mri图像。图10d示出了处理侧中的纹状体的更好恢复。mri显示，在中风后3天时两侧的血肿相当，而在右侧施加治疗后第14天，可以观察到较小的损伤核心和较小的心室。这表明，治疗可以
缓解ich后纹状体的收缩。在中风后3天获得mri扫描。
20.图11是示出了ich中涉及的过程的图。
具体实施方式
21.本文档提供了涉及治疗患有出血性中风的哺乳动物的方法和材料。例如，本文档提供了用于向鉴定为患有出血性中风的哺乳动物施用含有编码neurod1多肽的外源性核酸和编码dlx2多肽的核酸的组合物的方法和材料。
22.任何适当的哺乳动物可以被鉴定为患有出血性中风。例如，人和如猴等其它灵长类动物可以被鉴定为患有出血性中风。
23.任何适当类型的出血性中风(例如，颅内出血)可以如本文所述进行治疗。例如，如脑内出血等轴内(脑内)出血性中风可以如本文所述进行治疗。在一些情况下，如硬膜外出血(例如，由外伤引起的硬膜外出血)、硬膜下出血(例如，由外伤引起的硬膜下出血)或蛛网膜下出血(例如，由外伤或动脉瘤引起的蛛网膜下出血)等轴外(脑外)出血可以如本文所述进行治疗。所有中风中的约10-20％可能涉及脑内出血，所述脑内出血在一个月内的死亡率高达40％且在一年内的死亡率高达54％。脑内出血的原因包含高血压和如淀粉样血管病(例如，阿尔茨海默氏病(alzheimer
′
s disease))或脑肿瘤等其它疾病的继发效应。纹状体中脑内出血的常见位置(例如，约50％)。脑内出血的三种模型是自体血液(或裂解的血细胞)注射、纹状体球囊膨胀以及胶原酶注射。对于自体血液(或裂解的血细胞)注射，将约50-100μl的全血、裂解的rbc或rbc加上细胞级分注射到纹状体中。标志是血液源性毒性，无病变扩张。对于纹状体球囊膨胀，将栓塞球囊插入到纹状体中并且用盐水使其缓慢膨胀。球囊可以留在原处或撤出，以进行期望的模拟。标志是肿块血肿的孤立机械效应。对于胶原酶注射，将约0.075单位到0.4单位的细菌性胶原酶注射到纹状体中以诱导基底层降解和ich。标志是由原位破裂引起的扩张性血肿，所述扩张性血肿与人的ich最为相似。
24.脑内出血可能给脑带来原发性和继发性损伤。例如，脑内出血可能带来由血肿诱导的物理压力引起的原发性损伤，并且可能带来由来自血液组分的毒性、由三价铁(fe
3
)诱导的铁死亡以及随后的氧化应激和炎症引起的继发性损伤。本文提供的方法和材料(例如，施用编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的核酸和编码dlx2多肽(或其生物活性片段)的核酸)可以用于降低对患有脑内出血的哺乳动物(例如，人)的脑的一种或多种原发性或继发性损伤的严重程度。
25.在一些情况下，所述出血性中风是由于选自由以下组成的组的病状引起的：血管破裂、高血压、动脉瘤、缺血性中风、身体损伤、肿瘤、炎症、感染、全局缺血、缺氧-缺血性脑病、脑膜炎以及脱水。
26.在一些情况下，所述出血性中风是由于选自由以下组成的组的病状引起的：脑出血、动脉瘤、颅内血肿、蛛网膜下出血、脑外伤、高血压、血管薄弱、血管畸形、缺血性中风、身体损伤、肿瘤、炎症、感染、全局缺血、缺氧-缺血性脑病、脑膜炎以及脱水。
27.在一些情况下，全局缺血是由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的。在一些情况下，缺氧-缺血性脑病是由缺氧、低血糖或贫血引起的。
28.在一些情况下，出血性中风是由于脑出血引起的。在一些情况下，出血性中风是由于动脉瘤引起的。在一些情况下，出血性中风是由于颅内血肿引起的。在一些情况下，出血
性中风是由于蛛网膜下出血引起的。在一些情况下，出血性中风是由于脑外伤引起的。在一些情况下，出血性中风是由于高血压引起的。在一些情况下，出血性中风是由于血管薄弱引起的。在一些情况下，出血性中风是由于血管畸形引起的。在一些情况下，出血性中风是由于缺血性中风引起的。在一些情况下，出血性中风是由于身体损伤引起的。在一些情况下，出血性中风是由于肿瘤引起的。在一些情况下，出血性中风是由于炎症引起的。在一些情况下，出血性中风是由于感染引起的。在一些情况下，出血性中风是由于全局缺血引起的。在一些情况下，出血性中风是由于缺氧-缺血性脑病引起的。在一些情况下，出血性中风是由于脑膜炎引起的。在一些情况下，出血性中风是由于脱水引起的。
29.在一些情况下，向受出血性中风影响的受试者施用治疗有效量的编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸和编码dlx2多肽(或其生物活性片段)的核酸介导：通过将反应性星形胶质细胞转化为谷氨酸能神经元来产生新的谷氨酸能神经元；反应性星形胶质细胞的数量的减少；包含gaba能神经元和谷氨酸能神经元在内的受损神经元的存活率；新的非反应性星形胶质细胞的产生；未转化的反应性星形胶质细胞的反应性的降低；以及将血管再整合到受损区域中。
30.在一些情况下，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物产生新的谷氨酸能神经元，从而使谷氨酸能神经元的数量相对于基线水平增加约1％到500％。在一些情况下，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物产生新的谷氨酸能神经元，从而使谷氨酸能神经元的数量相对于基线水平增加约1％到50％、约1％到100％、约1％到150％、约50％到100％、约50％到150％、约50％到200％、约100％到150％、约100％到200％、100％到250％、约150％到200％、约150％到250％、约150％到300％、200％到250％、200％到300％、200％到350％、250％到300％、250％到350％、约250％到400％、约300％到350％、约300％到400％、约300％到450％、约350％到400％、约350％到450％、约350％到500％、约400％到450％、约400％到500％或约450％到500％。
31.在一些情况下，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物使反应性星形胶质细胞的数量减少约1％到100％。在一些情况下，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物使反应性星形胶质细胞的数量减少约1％到约10％、1％到约20％、1％到约30％、10％到约20％、10％到约30％、约10％到约40％、约20％到约30％、约20％到约40％、约20％到约50％、约30％到约40％、约30％到约50％、约30％到约60％、约40％到约50％、约40％到约60％、约40％到约70％、约50％到约60％、约50％到约70％、约50％到约80％、约60％到约70％、约60％到约80％、约60％到约90％、约70％到约80％、约70％到约90％、约70％到约100％、约80％到约90％、约80％到约100％或约90％到约100％。
32.在一些情况下，与未施用相比，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物使gaba能神经元的存活率增加约1％到100％。在一些情况下，与未施用相比，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物使gaba能神经元的存活率增加约1％到约10％、1％到约20％、1％到约30％、10％到约20％、10％到约30％、约10％到约40％、约20％到约30％、约20％到约40％、约20％到约50％、约30％到约40％、约30％到约50％、约30％到约60％、约40％到约50％、约40％到约60％、约40％到约70％、约50％到约60％、约50％到约70％、约50％到约80％、约60％到约70％、约60％到约80％、约60％到约90％、约70％到约80％、约70％到约90％、约70％到约100％、约80％到约90％、约80％到约100％或
约90％到约100％。可以使用任何适当的方法来评估gaba能神经元的存活率的增加。例如，可以对γ-氨基丁酸(gaba)、gaba合成酶谷氨酸脱羧酶67(gad67)和/或小清蛋白(pv)进行免疫染色，以测量gaba能神经元的数量。gaba能神经元数量的减少可以指示gaba能神经元的丧失。当数量保持不变时，其可以指示gaba能神经元存活。gaba能神经元数量的增加可以指示gaba能再生的发生。
33.在一些情况下，与未施用相比，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物使谷氨酸能神经元的存活率增加约1％到100％。在一些情况下，与未施用相比，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物使谷氨酸能神经元的存活率增加约1％到约10％、1％到约20％、1％到约30％、10％到约20％、10％到约30％、约10％到约40％、约20％到约30％、约20％到约40％、约20％到约50％、约30％到约40％、约30％到约50％、约30％到约60％、约40％到约50％、约40％到约60％、约40％到约70％、约50％到约60％、约50％到约70％、约50％到约80％、约60％到约70％、约60％到约80％、约60％到约90％、约70％到约80％、约70％到约90％、约70％到约100％、约80％到约90％、约80％到约100％或约90％到约100％。可以使用任何适当的方法来评估谷氨酸能神经元的存活率的增加。例如，可以使用谷氨酸能神经元的标志物进行免疫染色以测量谷氨酸能神经元的数量。谷氨酸能神经元数量的减少可以指示谷氨酸能神经元的丧失。当数量保持不变时，其可以指示谷氨酸能神经元存活。谷氨酸能神经元数量的增加可以指示谷氨酸能再生的发生。
34.在一些情况下，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物产生新的非反应性星形胶质细胞，从而使新的非反应性星形胶质细胞的数量相对于基线水平增加约1％到100％。在一些情况下，本文所提供的方法或组合物产生新的非反应性星形胶质细胞，从而使新的非反应性星形胶质细胞的数量相对于基线水平增加约1％到约10％、1％到约20％、1％到约30％、10％到约20％、10％到约30％、约10％到约40％、约20％到约30％、约20％到约40％、约20％到约50％、约30％到约40％、约30％到约50％、约30％到约60％、约40％到约50％、约40％到约60％、约40％到约70％、约50％到约60％、约50％到约70％、约50％到约80％、约60％到约70％、约60％到约80％、约60％到约90％、约70％到约80％、约70％到约90％、约70％到约100％、约80％到约90％、约80％到约100％或约90％到约100％。
35.在一些情况下，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物使未转化的反应性星形胶质细胞的反应性相对于基线水平减少约1％到100％。在一些情况下，在施用本文提供的组合物之后，本文提供的方法或组合物使未转化的反应性星形胶质细胞的反应性相对于基线水平减少约1％到约10％、1％到约20％、1％到约30％、10％到约20％、10％到约30％、约10％到约40％、约20％到约30％、约20％到约40％、约20％到约50％、约30％到约40％、约30％到约50％、约30％到约60％、约40％到约50％、约40％到约60％、约40％到约70％、约50％到约60％、约50％到约70％、约50％到约80％、约60％到约70％、约60％到约80％、约60％到约90％、约70％到约80％、约70％到约90％、约70％到约100％、约80％到约90％、约80％到约100％或约90％到约100％。
36.在一些情况下，向受出血性中风影响的受试者施用治疗有效量的编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸和编码dlx2多肽(或其生物活性片段)的核酸介导：减少损伤位点处的炎症；降低损伤位点处的神经抑制；重建损伤位点处的正常小神经胶质形态；重建损伤位点处的神经回路、增加损伤位点处的血管；重建损伤位点处的血脑屏障；重
建损伤位点处的正常组织结构；以及改善由于正常血流的中断而引起的运动缺陷。
37.在一些情况下，在施用于反应性星形胶质细胞时，施用治疗有效量的编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸和编码dlx2多肽(或其生物活性片段)的核酸以改善有需要的个体受试者的ich的效果比在施用于静态星形胶质细胞时具有更大的有益效果。
38.用编码neurod1多肽(或其生物活性片段)的外源性核酸和编码dlx2多肽(或其生物活性片段)的核酸进行的治疗可以施用于如通过磁共振成像(mri)诊断的损伤区域。电生理学可以评估由神经细胞死亡或损伤引起的神经放电的功能变化。用于测定神经损伤的非侵入性方法包含eeg。至损伤点的血流的中断可以通过近红外光谱和fmri进行非侵入性地测定。区域内的血流量可以增加(如在动脉瘤中所见)或减少(如在缺血中所见)。由血流的中断引起的对cns的损伤另外引起了可以用于诊断损伤点的组织结构的短期和长期变化。从短期来看，损伤将引起局部肿胀。从长期来看，细胞死亡将引起组织点丧失。用于测定由组织死亡引起的结构变化的非侵入性方法包含mri、正电子发射断层扫描(pet)、计算机轴向断层扫描(cat)或超声。这些方法可以单独地使用或以任何组合使用，以精准确定损伤的焦点。
39.如上所述，用于测定由组织死亡引起的结构变化的非侵入性方法包含mri、cat扫描或超声。功能测定可以包含eeg记录。
40.在如本文所述的用于治疗患有出血性中风的哺乳动物的方法的一些实施例中，外源性neurod1多肽(或其生物活性片段)和dlx2多肽(或其生物活性片段)作为含有编码neurod1和dlx2的核酸序列的表达载体施用。
41.在如本文所述的用于治疗神经病症的方法的一些实施例中，将包含编码neurod1多肽和dlx2多肽的核酸的病毒载体(例如，aav)通过注射，如立体定向颅内注射或眶后注射递送到受试者的脑中。在一些情况下，在脑中的同一位置处使用两次以上颅内注射向脑施用含有编码neurod1多肽和dlx2多肽的腺相关病毒的组合物。在一些情况下，在脑中的两个或更多个不同位置处使用两次以上颅内注射向脑施用含有编码neurod1多肽和dlx2多肽的腺相关病毒的组合物。在一些情况下，使用一次或多次颅内注射向脑施用含有编码neurod1多肽和dlx2多肽的腺相关病毒的组合物。
42.术语“表达载体”是指用于在体外或体内将编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸和编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸引入到宿主细胞中的重组媒剂，在所述宿主细胞中所述核酸被表达以产生neurod1多肽和dlx2多肽。在特定实施例中，包含seq id no：1或3或基本上相同的核酸序列的表达载体被表达以在含有表达载体的细胞中产生neurod1。在特定实施例中，包含seq id no：10或12或基本上相同的核酸序列的表达载体被表达以在含有表达载体的细胞中产生dlx2。
43.术语“重组”用于指示两个或更多个核酸连接并且在自然界中未发现连接的核酸构建体。表达载体包含但不限于质粒、病毒、bac和yac。特定的病毒表达载体说明性地包含源自腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒的病毒表达载体。
44.本文档提供了用于根据所描述的方法治疗有需要的受试者的出血性中风的症状的材料和方法，所述方法包含提供包括编码neurod1和dlx2的核酸的病毒载体；以及将病毒载体递送到受试者的脑中，由此病毒载体分别感染中枢神经系统的胶质细胞，从而产生受
感染的胶质细胞，并且由此编码neurod1多肽或其生物活性片段的外源性核酸和编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸在受感染的胶质细胞中以治疗有效水平表达，其中与患有同一神经病状的未经治疗的受试者相比，neurod1多肽和dlx2多肽在受感染细胞中的表达导致在受试者体内产生更多数量的神经元，由此神经病症得以治疗。除了产生新的神经元之外，反应性胶质细胞的数量也将减少，从而导致所释放的神经抑制因子更少、神经炎症更少和/或还均匀分布的血管更多，由此使局部环境更允许神经元生长或轴突渗透，因此减轻神经病状。
45.在一些情况下，腺相关载体可以用于本文所述的方法中，并且将在注射位点处感染分裂细胞和非分裂细胞两者。腺相关病毒(aav)是细小病毒科家族的ssdna动物病毒的普遍存在的、非细胞病变的、无复制能力的成员。可以如本文所述使用如血清型1-9等各种重组腺相关病毒中的任何重组腺相关病毒。在一些情况下，aav-php.eb用于施用外源性neurod1和dlx2。
46.根据本文所述的一些方面，“flex”转换方法用于在受感染细胞中表达neurod1和dlx2。术语“flex”和“翻转切除(flip-excision)”可互换使用，以表示将两对异型的反平行loxp型重组位点安置在反向neurod1或dlx2编码序列的任一侧的方法，所述反向neurod1或dlx2编码序列首先经历编码序列的反向，随后切除两个位点，从而导致每个正交重组位点之一相反地定向并且不能进一步重组，从而实现稳定的反向，参见例如schnutgen等人，《自然生物技术(nature biotechnology)》，21：562-565(2003)；以及atasoy等人，《神经科学杂志(j.neurosci.)》，28：7025-7030(2008)。由于在胶质细胞特异性启动子控制下的位点特异性重组酶将在包含反应性星形胶质细胞在内的胶质细胞中强烈表达，因此neurod1和dlx2也将在包含反应性星形胶质细胞在内的胶质细胞中表达。然后，当从重组中去除neurod1或dlx2前面的终止密码子时，组成型或神经元特异性启动子将驱动neurod1和dlx2的高表达，从而使反应性星形胶质细胞转化成功能神经元。
47.根据具体方面，编码neurod1多肽或其生物活性片段的外源性核酸和编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸通过施用以下而施用于有需要的受试者：(1)腺相关病毒表达载体，所述腺相关病毒表达载体包含在如gfap或s100b或aldh1l1等星形胶质细胞特异性启动子的转录控制下编码位点特异性重组酶的dna序列；以及(2)包含在普遍存在的(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下编码neurod1多肽和dlx2多肽的dna序列在内的腺相关病毒表达载体，其中编码neurod1和dlx2的dna序列被反向并且以错误的定向进行neurod1和dlx2的表达，直到位点特异性重组酶使编码neurod1和dlx2的反向dna序列反向，从而允许neurod1和dlx2的表达。
48.位点特异性重组酶及其识别位点包含例如cre重组酶连同识别位点loxp和lox2272位点或flp-frt重组或其组合。
49.包含编码neurod1多肽或其生物活性片段的外源性核酸和编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸(例如，编码neurod1多肽和dlx2多肽的aav)的组合物可以被调配成药物组合物以施用于哺乳动物。例如，治疗有效量的包含编码neurod1多肽或其生物活性片段的外源性核酸和编码dlx2多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物可以与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起调配。包含编码neurod1多肽或其生物活性片段的外源性核酸和编码dlx2多肽或其生物活性片段的外源性核酸(例如，编码neurod1多肽
和dlx2多肽的aav)的药物组合物可以被调配成用于各种施用途径，例如，以胶囊、液体等形式口服施用。在一些情况下，肠胃外施用，优选地通过静脉内注射或静脉内输注具有编码neurod1多肽或其生物活性片段的外源性核酸和编码dlx2多肽或其生物活性片段的外源性核酸的病毒载体(例如，aav)。施用可以是例如通过静脉内输注进行，例如持续60分钟、30分钟或15分钟。在一些情况下，静脉内输注可以介于1分钟与60分钟之间。在一些情况下，静脉内输注可以介于1分钟与5分钟之间、介于1分钟与10分钟之间、介于1分钟与15分钟之间、介于5分钟与10分钟之间、介于5分钟与15分钟之间、介于5分钟与20分钟之间、介于10分钟与15分钟之间、介于10分钟与20分钟之间、介于10分钟与25分钟之间、介于15分钟与20分钟之间、介于15分钟与25分钟之间、介于15分钟与30分钟之间、介于20分钟与25分钟之间、介于20分钟与30分钟之间、介于20分钟与35分钟之间、介于25分钟与30分钟之间、介于25分钟与35分钟之间、介于25分钟与40分钟之间、介于30分钟与35分钟之间、介于30分钟与40分钟之间、介于30分钟与45分钟之间、介于35分钟与40分钟之间、介于35分钟与45分钟之间、介于35分钟与50分钟之间、介于40分钟与45分钟之间、介于40分钟与50分钟之间、介于40分钟与55分钟之间、介于45分钟与50分钟之间、介于45分钟与55分钟之间、介于45分钟与60分钟之间、介于50分钟与55分钟之间、介于50分钟与60分钟或介于55分钟与60分钟之间。
50.在一些情况下，可以在出血性中风后1天到60天向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后1天到5天、1天到10天、1天到15天、5天到10天、5天到15天、5天到20天、10天到15天、10天到20天、10天到25天、15天到20天、15天到25天、15天到30天、20天到25天、20天到30天、20天到35天、25天到30天、25天到35天、25天到40天、30天到35天、30天到40天、30天到45天、35天到40天、35天到45天、35天到50天、40天到45天、40天到50天、40天到55天、45天到50天、45天到55天、45天到60天、50天到55天、50天到60天或55天到60天向哺乳动物提供施用。
51.在一些情况下，可以在发生出血性中风时向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后1天向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后2天向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后3天向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后4天向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后5天向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后6天向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后7天向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后1周向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后2周向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后3周向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后4周向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后5周向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后6周向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后7周向哺乳动物提供施用。在一些情况下，可以在出血性中风后8周向哺乳动物提供施用。
52.在一些情况下，病毒载体(例如，编码neurod1多肽和dlx2多肽的aav)在外科手术期间通过注射局部地施用到脑。适于通过注射和/或输注施用的组合物包含溶液和分散体以及可以由其制备对应溶液和分散体的粉末。此类组合物将包括病毒载体和至少一种合适的药学上可接受的载体。用于静脉内施用的合适的药学上可接受的载体包含但不限于抑菌水、林格氏溶液(ringer
′
s solution)、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水(pbs)和cremophor el
tm
。
用于注射和/或输注的无菌组合物可以通过将所需量的病毒载体(例如，编码neurod1多肽和dlx2多肽的aav)引入到适当的载体中，并且然后通过过滤灭菌来制备。用于通过注射或输注施用的组合物在其制备后在储存条件下应当在延长的时间段内保持稳定。出于此目的，组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂包含氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。
53.在一些实施例中，基因递送载体可以是aav载体。例如，aav载体可以选自以下的组：aav2载体、aav5载体、aav8载体、aav1载体、aav7载体、aav9载体、aav3载体、aav6载体、aav10载体和aav11载体。
54.药物组合物可以被配制成用于以固体或液体形式施用，所述固体或液体形式包含但不限于无菌溶液、悬浮液、缓释调配物、片剂、胶囊、丸剂、粉末和颗粒。所述调配物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，并且可以储存在仅需要紧接着在使用之前添加无菌液体载体(例如，注射用水)的冷冻干燥(冻干)条件下。可以由无菌粉末、微粒和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。
55.可以用于本文所述的药物组合物中的另外的药学上可接受的载体、填充剂或媒剂包含但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、如人血清白蛋白等血清蛋白、如磷酸盐等缓冲物质、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐等电解质、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙二醇-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
56.如本文所使用的，术语“腺相关病毒颗粒”是指将其核酸基因组传递到细胞的aav病毒的包装衣壳形式。
57.含有外源性neurod1和dlx2的组合物的有效量可以是改善哺乳动物(例如，人)体内的神经病症的症状而不对哺乳动物产生严重毒性的任何量。例如，编码neurod1多肽和dlx2多肽的腺相关病毒的有效量可以是为约10
10
到10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升的浓度。如果特定哺乳动物对特定量没有反应，则可以增加编码neurod1多肽和dlx2多肽的aav的量。在一些情况下，编码neurod1和dlx2多肽的腺相关病毒的有效量可以介于10
10
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
11
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
10
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
12
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
10
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
13
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
11
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
12
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
11
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
13
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
11
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
12
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
13
个腺相关病毒颗粒/毫升之间、介于10
12
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升之间或介于10
13
个腺相关病毒颗粒/毫升与10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升之间。与待施用的病毒载体(例如，编码neurod1多肽和dlx2多肽的aav)的量相关的因素是例如病毒载体的施用途径、疾病的性质和严重程度、所治疗的患者的疾病史以及待治疗的患者的年龄、体重、身高和健康状况。在一些情况下，实现治疗效果所需的转基因的表达水平、患者的免疫应答以及基因产物的稳定性与待施用的量相关。在一些情况下，病毒载体(例如，编码外源性neurod1和dlx2的aav)的施用以导致脑的功能障碍或疾病的完全或基本上完全愈合的量发生。
58.在一些情况下，含有外源性neurod1和dlx2的组合物的有效量可以以约0.1微升/分钟到约5微升/分钟的受控流速施用。
59.在一些情况下，受控流速介于0.1微升/分钟与0.2微升/分钟之间之间、介于0.1微升/分钟与0.3微升/分钟之间、介于0.1微升/分钟与0.4微升/分钟之间、介于0.2微升/分钟与0.3微升/分钟之间、介于0.2微升/分钟与0.4微升/分钟之间、介于0.2微升/分钟与0.5微升/分钟之间、介于0.3微升/分钟与0.4微升/分钟之间、介于0.3微升/分钟与0.5微升/分钟之间、介于0.3微升/分钟与0.6微升/分钟之间、介于0.4微升/分钟与0.5微升/分钟之间、介于0.4微升/分钟与0.6微升/分钟之间、介于0.4微升/分钟与0.7微升/分钟之间、介于0.5微升/分钟与0.6微升/分钟之间、介于0.5微升/分钟与0.7微升/分钟之间、介于0.5微升/分钟与0.8微升/分钟之间、介于0.6微升/分钟与0.7微升/分钟之间、介于0.6微升/分钟与0.8微升/分钟之间、介于0.6微升/分钟与0.9微升/分钟之间、介于0.7微升/分钟与0.8微升/分钟之间、介于0.7微升/分钟与0.9微升/分钟之间、介于0.7微升/分钟与1.0微升/分钟之间、介于0.8微升/分钟与0.9微升/分钟之间、介于0.8微升/分钟与1.0微升/分钟之间、介于0.8微升/分钟与1.1微升/分钟之间、介于0.9微升/分钟与1.0微升/分钟之间、介于0.9微升/分钟与1.1微升/分钟之间、介于0.9微升/分钟与1.2微升/分钟之间、介于1.0微升/分钟与1.1微升/分钟之间、介于1.0微升/分钟与1.2微升/分钟之间、介于1.0微升/分钟与1.3微升/分钟之间、介于1.1微升/分钟与1.2微升/分钟之间、介于1.1微升/分钟与1.3微升/分钟之间、介于1.1微升/分钟与1.4微升/分钟之间、介于1.2微升/分钟与1.3微升/分钟之间、介于1.2微升/分钟与1.4微升/分钟之间、介于1.2微升/分钟与1.5微升/分钟之间、介于1.3微升/分钟与1.4微升/分钟之间、介于1.3微升/分钟与1.5微升/分钟之间、介于1.3微升/分钟与1.6微升/分钟之间、介于1.4微升/分钟与1.5微升/分钟之间、介于1.4微升/分钟与1.6微升/分钟之间、介于1.4微升/分钟与1.7微升/分钟之间、介于1.5微升/分钟与1.6微升/分钟之间、介于1.5微升/分钟与1.7微升/分钟之间、介于1.5微升/分钟与1.8微升/分钟之间、介于1.6微升/分钟与1.7微升/分钟之间、介于1.6微升/分钟与1.8微升/分钟之间、介于1.6微升/分钟与1.9微升/分钟之间、介于1.7微升/分钟与1.8微升/分钟之间、介于1.7微升/分钟与1.9微升/分钟之间、介于1.7微升/分钟与2.0微升/分钟之间、介于1.8微升/分钟与1.9微升/分钟之间、介于1.8微升/分钟与2.0微升/分钟之间、介于1.8微升/分钟与2.1微升/分钟之间、介于1.9微升/分钟与2.0微升/分钟之间、介于1.9微升/分钟与2.1微升/分钟之间、介于1.9微升/分钟与2.2微升/分钟之间、介于2.0微升/分钟与2.1微升/分钟之间、介于2.0微升/分钟与2.2微升/分钟之间、介于2.0微升/分钟与2.3微升/分钟之间、介于2.1微升/分钟与2.2微升/分钟之间、介于2.1微升/分钟与2.3微升/分钟之间、介于2.1微升/分钟与2.4微升/分钟之间、介于2.2微升/分钟与2.3微升/分钟之间、介于2.2微升/分钟与2.4微升/分钟之间、介于2.2微升/分钟与2.5微升/分钟之间、介于2.3微升/分钟与2.4微升/分钟之间、介于2.3微升/分钟与2.5微升/分钟之间、介于2.3微升/分钟与2.6微升/分钟之间、介于2.4微升/分钟与2.5微升/分钟之间、介于2.4微升/分钟与2.6微升/分钟之间、介于2.4微升/分钟与2.7微升/分钟之间、介于2.5微升/分钟与2.6微升/分钟之间、介于2.5微升/分钟与2.7微升/分钟之间、介于2.5微升/分钟与2.8微升/分钟之间、介于2.6微升/分钟与2.7微升/分钟之间、介于2.6微升/分钟与2.8微升/分钟之间、介于2.6微升/分钟与2.9微升/分钟之间、介于2.7微升/分钟与2.8微升/分钟之间、介于2.7微升/分钟与2.9微升/分钟之间、介于2.7微升/分钟与3.0微升/分钟之间、介于2.8微升/分钟与2.9微升/分钟之间、介于2.8微升/分钟与3.0微升/分钟之间、介于2.8微升/分钟与3.1微升/分钟之间、介于2.9微升/分钟与3.0微升/分钟
之间、介于2.9微升/分钟与3.1微升/分钟之间、介于2.9微升/分钟与3.2微升/分钟之间、介于3.0微升/分钟与3.1微升/分钟之间、介于3.0微升/分钟与3.2微升/分钟之间、介于3.0微升/分钟与3.3微升/分钟之间、介于3.1微升/分钟与3.2微升/分钟之间、介于3.1微升/分钟与3.3微升/分钟之间、介于3.1微升/分钟与3.4微升/分钟之间、介于3.2微升/分钟与3.3微升/分钟之间、介于3.2微升/分钟与3.4微升/分钟之间、介于3.2微升/分钟与3.5微升/分钟之间、介于3.3微升/分钟与3.4微升/分钟之间、介于3.3微升/分钟与3.5微升/分钟之间、介于3.3微升/分钟与3.6微升/分钟之间、介于3.4微升/分钟与3.5微升/分钟之间、介于3.4微升/分钟与3.6微升/分钟之间、介于3.4微升/分钟与3.7微升/分钟之间、介于3.5微升/分钟与3.6微升/分钟之间、介于3.5微升/分钟与3.7微升/分钟之间、介于3.5微升/分钟与3.8微升/分钟之间、介于3.6微升/分钟与3.7微升/分钟之间、介于3.6微升/分钟与3.8微升/分钟之间、介于3.6微升/分钟与3.9微升/分钟之间、介于3.7微升/分钟与3.8微升/分钟之间、介于3.7微升/分钟与3.9微升/分钟之间、介于3.7微升/分钟与4.0微升/分钟之间、介于3.8微升/分钟与3.9微升/分钟之间、介于3.8微升/分钟与4.0微升/分钟之间、介于3.8微升/分钟与4.1微升/分钟之间、介于3.9微升/分钟与4.0微升/分钟之间、介于3.9微升/分钟与4.1微升/分钟之间、介于3.9微升/分钟与4.2微升/分钟之间、介于4.0微升/分钟与4.1微升/分钟之间、介于4.0微升/分钟与4.2微升/分钟之间、介于4.0微升/分钟与4.3微升/分钟之间、介于4.1微升/分钟与4.2微升/分钟之间、介于4.1微升/分钟与4.3微升/分钟之间、介于4.1微升/分钟与4.4微升/分钟之间、介于4.2微升/分钟与4.3微升/分钟之间、介于4.2微升/分钟与4.4微升/分钟之间、介于4.2微升/分钟与4.5微升/分钟之间、介于4.3微升/分钟与4.4微升/分钟之间、介于4.3微升/分钟与4.5微升/分钟之间、介于4.3微升/分钟与4.6微升/分钟之间、介于4.4微升/分钟与4.5微升/分钟之间、介于4.4微升/分钟与4.6微升/分钟之间、介于4.4微升/分钟与4.7微升/分钟之间、介于4.5微升/分钟与4.6微升/分钟之间、介于4.5微升/分钟与4.7微升/分钟之间、介于4.5微升/分钟与4.8微升/分钟之间、介于4.6微升/分钟与4.7微升/分钟之间、介于4.6微升/分钟与4.8微升/分钟之间、介于4.6微升/分钟与4.9微升/分钟之间、介于4.7微升/分钟与4.8微升/分钟之间、介于4.7微升/分钟与4.9微升/分钟之间、介于4.7微升/分钟与5.0微升/分钟、4.8微升/分钟和4.9微升/分钟、介于4.8微升/分钟与5.0微升/分钟之间或介于4.9微升/分钟与5.0微升/分钟之间。
60.病毒载体(例如，含有编码neurod1多肽的核酸和编码dlx2多肽的核酸的aav)可以以对应于在约1.0
×
10
10
到约1.0
×
10
14
vg/kg(病毒基因组每kg体重)的范围内的病毒剂量的量施用。在一些情况下，病毒载体(例如，含有编码neurod1多肽的核酸和编码dlx2多肽的核酸的aav)可以以对应于在约1.0
×
10
11
到约1.0
×
10
12
vg/kg的范围内、约5.0
×
10
11
到约5.0
×
10
12
vg/kg的范围内或约1.0
×
10
12
到约5.0
×
10
11
的范围内的病毒剂量的量施用，仍然是更优选的。在一些情况下，病毒载体(例如，含有编码neurod1多肽的核酸和编码dlx2多肽的核酸的aav)以对应于约2.5
×
10
12
vg/kg的剂量的量施用。在一些情况下，病毒载体(例如，含有编码neurod1多肽的核酸和编码dlx2多肽的核酸的aav)的有效量可以是约1μl到约500μl的体积，对应于本文所述的vg/kg(病毒基因组每kg体重)剂量的体积。在一些情况下，待施用的病毒载体(例如，含有编码neurod1多肽的核酸和编码dlx2多肽的核酸的aav)的量是根据编码多肽(例如，neurod1和dlx2)的一种或多种外源性核酸的表达的强度来调整的。
61.在一些情况下，病毒载体的所施用的有效体积介于1μl与25μl之间、介于1μl与50μ
l之间、介于1μl与75μl之间、介于25μl与50μl之间、介于25μl与75μl之间、介于25μl与100μl之间、介于50μl与75μl之间、介于50μl与100μl之间、介于50μl与125μl之间、介于75μl与100μl之间、介于75μl与125μl之间、介于75μl与150μl之间、介于100μl与125μl之间、介于100μl与150μl之间、介于100μl与175μl之间、介于125μl与150μl之间、介于125μl与175μl之间、介于125μl与200μl之间、介于150μl与175μl之间、介于150μl与200μl之间、介于150μl与225μl之间、介于175μl与200μl之间、介于175μl与225μl之间、介于175μl与250μl之间、介于200μl与225μl之间、介于200μl与250μl之间、介于200μl与275μl之间、介于225μl与250μl之间、介于225μl与275μl之间、介于225μl与300μl之间、介于250μl与275μl之间、介于250μl与300μl之间、介于250μl与325μl之间、介于275μl与300μl之间、介于275μl与325μl之间、介于275μl与350μl之间、介于300μl与325μl之间、介于300μl与350μl之间、介于300μl与375μl之间、介于325μl与350μl之间、介于325μl与375μl之间、介于325μl与400μl之间、介于350μl与375μl之间、介于350μl与400μl之间、介于350μl与425μl之间、介于375μl与400μl之间、介于375μl与425μl之间、介于375μl与450μl之间、介于400μl与425μl之间、介于400μl与450μl之间、介于400μl与475μl之间、介于425μl与450μl之间、介于425μl与475μl之间、介于425μl与500μl之间、介于450μl与475μl之间、介于450μl与500μl之间或介于475μl与500μl之间。
62.在一些情况下，在普遍存在的(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下将包含编码neurod1多肽和dlx2多肽的核酸的腺相关病毒载体连同编码位点特异性重组酶的腺相关病毒一起通过立体定向注射递送到受试者的脑中，其中编码neurod1和dlx2的核酸序列被反向并且以错误的定向进行neurod1和dlx2的表达，并且进一步包含位点特异性重组酶的重组酶活性的位点，直到所述位点特异性重组酶使编码neurod1和dlx2的反向核酸序列反向，由此允许neurod1和dlx2多肽的表达。
63.在一些情况下，在普遍存在的(组成型)启动子或神经元特异性启动子的转录控制下将包含编码neurod1多肽和dlx2多肽的核酸的腺相关病毒载体连同感兴趣位点的区域内或在感兴趣位点的区域的编码位点特异性重组酶的腺相关病毒一起通过立体定向注射递送到受试者的大脑中，其中编码neurod1多肽和dlx2多肽的核酸序列被反向并且以错误的定向进行neurod1和dlx2的表达，并且进一步包含位点特异性重组酶的重组酶活性的位点，直到所述位点特异性重组酶使编码neurod1和dlx2的反向核酸序列反向，由此允许neurod1多肽和dlx2多肽的表达。
64.在一些情况下，位点特异性重组酶是cre重组酶，并且重组酶活性的位点是识别位点loxp和lox2272位点。
65.在一些情况下，在治疗期间或之后监测对受试者的编码neurod1多肽和dlx2多肽的外源性核酸的治疗，以监测治疗的进展和/或最终结果。可以通过恢复或接近恢复正常的电生理学、血流、组织结构和功能来诊断神经元细胞整合和组织微环境恢复的治疗后成功。测定神经功能的非侵入性方法包含eeg。血流可以通过近红外光谱和fmri进行非侵入性地测定。用于测定组织结构的非侵入性方法包含mri、cat扫描、pet扫描或超声。行为测定可以用于非侵入性测定脑功能的恢复。行为测定应当与由原始脑损伤引起的功能丧失相匹配。例如，如果损伤引起瘫痪，则应测试患者的移动性和肢体灵活性。如果损伤引起语言丧失或变慢，则应测定患者通过口头语言进行交流的能力。用编码neurod1多肽和dlx2多肽的外源性核酸治疗后正常行为的恢复表明有效神经元回路的成功产生和整合。这些方法可以单独
地使用或以任何组合使用，以测定神经功能和组织健康。用于评估治疗的测定可以在neurod1和dlx2治疗后的任何时间点进行，如1天、2天、3天、一周、2周、3周、一个月、两个月、三个月、六个月、一年或更久。此类测定可以在neurod1和dlx2治疗之前进行，以便在需要时建立基线比较。
66.本文所使用的科学和技术术语旨在具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。发现在各种标准参考文献的上下文中定义并使用此类术语，这些参考文献说明性地包含以下：j.sambrook和d.w.russell，《分子克隆：实验室手册(molecular cloning：a laboratory manual)》，冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)；第3版，2001；f.m.asubel编辑，《精编分子生物学实验指南(short protocols in molecular biology)》，《实验室指南(current protocols)》；第5版，2002；b.alberts等人，《细胞分子生物学(molecular biology of the cell)》，第4版，加兰科学出版社(garland)，2002；d.l.nelson和m.m.cox，《生物化学原理(lehninger principles of biochemistry)》，第4版，w.h.弗里曼公司(w.h.freeman&company)，2004；engelke，d.r.，《rna干扰(rnai)：rnai技术的具体细节(rna interference(rnai)：nuts and bolts of rnai technology)》，宾夕法尼亚州伊格尔维尔的dna出版社有限责任公司(dna press llc，eagleville，pa)，2003；herdewijn，p.(编辑)，《寡核苷酸合成：方法与应用(oligonucleotide synthesis：methods and applications)》，《分子生物学方法(methods in molecular biology)》，胡马纳出版社(humana press)，2004；a.nagy、m.gertsenstein、k.vintersten、r.behringer，《操纵小鼠胚胎：实验室手册(manipulating the mouse embryo：a laboratory manual)》，冷泉港实验室出版社，第3版；2002年12月15口，isbn-10：0879695919；kursad turksen(编辑)，《胚胎干细胞：分子生物学方法中的方法和方案(embryonic stem cells：methods and protocols in methods in molecular biology)》，2002；185，胡马纳出版社：《干细胞生物学实验指南(current protocols in stem cell biology)》，isbn：9780470151808。
67.如本文所使用的，单数术语“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”不旨在是限制性的，并且包含复数指示物，除非另外明确地陈述或上下文另外清楚地指示。
68.如本文所使用的，术语或“neurod1蛋白”是指涉及胚胎脑发育和成人神经发生的bhlh促神经原转录因子，参见cho等人，《分子神经生物学(mol，neurobiol.)》，30：35-47(2004)；kuwabara等人，《自然神经科学(nature neurosci.)》，12：1097-1105(2009)；以及gao等人，《自然神经科学》，12：1090-1092(2009)。neurod1在发育后期表达，主要在神经系统中表达，并且涉及神经元分化、成熟和存活。
69.术语“neurod1蛋白”或“外源性neurod1”涵盖人neurod1蛋白，在本文中被鉴定为seq id no：2以及小鼠neurod1蛋白，在本文中被鉴定为seq id no：4。除了seq id no：2和seq id no：4的neurod1蛋白之外，术语“neurod1蛋白”涵盖neurod1蛋白的变体，如seq id no：2和seq id no：4的变体，所述变体可以包含在本文所述的方法中。如本文所使用的，术语“变体”是指天然存在的遗传变异和重组制备的变异，与参考neurod1蛋白，如seq id no：2或seq id no：4相比，所述变异中的每一种在其氨基酸序列中含有一个或多个变化。此类变化包含一个或多个氨基酸残基已经通过氨基酸取代、添加或缺失进行修饰的变化。术语“变体”涵盖人neurod1，包含例如哺乳类动物和鸟neurod1的直向同源物，如但不限于来自
非人灵长类动物、猫、狗、绵羊、山羊、马、牛、猪、鸟、家禽动物和啮齿动物(如但不限于小鼠和大鼠)的neurod1直向同源物。在非限制性实例中，在本文中例示为氨基酸序列seq id no：4的小鼠neurod1是人neurod1的直向同源物。
70.在一些情况下，优选的变体与seq id no：2或seq id no：4具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
71.可以使用如定点诱变和pcr介导的诱变等标准分子生物学技术引入突变。本领域的技术人员将认识到，可以在不改变neurod1蛋白的功能性质的情况下引入一个或多个氨基酸突变。例如，可以在不改变seq id no：2或4的neurod1蛋白的功能性质的情况下进行一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。
72.可以在neurod1蛋白中进行保守氨基酸取代以产生neurod1蛋白变体。保守氨基酸取代是本领域公认的一个氨基酸对具有类似特性的另一个氨基酸的取代。例如，每个氨基酸可以被描述为具有以下特性中的一个或多个：正电性、负电性、脂肪族、芳香族、极性、疏水性和亲水性。保守取代是具有指定结构或功能特性的一个氨基酸对具有同一特性的另一个氨基酸的取代。酸性氨基酸包含天冬氨酸和谷氨酸；碱性氨基酸包含组氨酸、赖氨酸和精氨酸；脂肪族氨基酸包含异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸；芳香族氨基酸包含苯丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸和色氨酸；极性氨基酸包含天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；并且疏水性氨基酸包含丙氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、缬氨酸和色氨酸；并且保守取代包含每组内的氨基酸之间的取代。氨基酸还可以根据丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸以及缬氨酸的相对大小来描述，所有这些通常被认为是小的。
73.neurod1变体可以包含合成氨基酸类似物、氨基酸衍生物和/或非标准氨基酸，说明性地包含但不限于α-氨基丁酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、氰基丙氨酸、二氨基丁酸、二氨基庚二酸、二羟基-苯丙氨酸、黎豆氨酸、高精氨酸、羟脯氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、5-羟色氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸和鸟氨酸。
74.为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的对序列进行比对(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，以与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后将对应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较。当第一序列中的位置被与在第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则这些分子在所述位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数(即，同一性％＝相同重叠位置的数量/位置总数
×
100％)。在一个实施例中，两个序列的长度相同。
75.两个序列之间的同一性百分比的确定也可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性实例是karlin和altschul的算法，《美国国家科学院院刊(pnas)》，87：2264-2268(1990)，所述文献被修改为karlin和altschul，《美国国家科学院院刊》，90：5873-5877(1993)。将这种算法并入到altschul等人，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》，215：403(1990)的nblast和xblast程序中。用nblast核苷酸程序参数集(例如，分数＝100，字长＝12)执行blast核苷酸搜索，以获得与本文所述的核酸分子同源的核苷酸序列。
76.用xblast程序参数集(例如，分数50，字长＝3)执行blast蛋白搜索，以获得与本文
所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，利用如在altschul等人，《核酸研究(nucleic acids res.)》，25：3389-3402(1997)中所描述的有空位的blast。可替代地，psi blast用于执行检测分子之间的距离关系的迭代搜索。当利用blast、有空位的blast和psi blast程序时，使用相应程序(例如，xblast和nblast)的默认参数(参见，例如，ncbi网站)。
77.用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限制性实例是myers和miller的算法，《计算机在生物科学中的应用(cabios)，4：11-17(1988)。将这种算法并入align程序(第2.0版)中，所述程序是gcg序列比对软件包的一部分。当利用align程序比较氨基酸序列时，使用pam120权重残基表、空位长度罚分12以及空位罚分4。
78.在容许或不容许空位的情况下，使用类似于以上所述的那些技术的技术，确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，通常仅对确切的匹配进行计数。
79.术语“neurod1蛋白”涵盖在本文所述的方法或组合物中可操作的neurod1蛋白的片段，如seq id no：2和4的片段及其变体。
80.neurod1蛋白和核酸可以从天然来源分离，如生物体的脑或表达neurod1的细胞系的细胞。可替代地，可以重组地产生neurod1蛋白或核酸，如通过使用表达构建体在体外或体内进行表达。neurod1蛋白和核酸也可以通过熟知的方法来合成。
81.包含在本文所述的方法或组合物中的neurod1可以使用重组核酸技术来产生。重组neurod1产生包含将涵盖编码neurod1的dna序列的重组表达载体引入到宿主细胞中。
82.在一些情况下，编码neurod1的引入到宿主细胞中以产生neurod1的核酸序列编码seq id no：2、seq id no：4或其变体。
83.在一些情况下，在本文中被鉴定为seq id no：1的核酸序列编码seq id no：2并且被包含在表达载体中并被表达以产生neurod1。在一些情况下，在本文中被鉴定为seq id no：3的核酸序列编码seq id no：4并且被包含在表达载体中并被表达以产生neurod1。在一些情况下，在本文中被鉴定为seq id no：10的核酸序列编码seq id no：11并且被包含在表达载体中并被表达以产生dlx2。在一些情况下，在本文中被鉴定为seq id no：12的核酸序列编码seq id no：13并且被包含在表达载体中并被表达以产生dlx2。
84.应当理解，由于遗传密码的简并性质，与seq id no：1和3基本上相同的核酸序列编码neurod1和neurod1的变体，并且这些替代性核酸可以包含在表达载体中并且被表达以产生neurod1和neurod1的变体。本领域的技术人员将理解，编码neurod1蛋白的核酸的片段可以用于产生neurod1蛋白的片段。
85.如本文所使用的，术语“dlx2”是指远端缺失同源盒2，其充当转录激活因子并在中间神经元的终末分化中发挥作用，所述中间神经元如正在发育的视网膜中的无长突细胞和双极细胞。dlx2在腹侧前脑的发育中起调节作用，并且可以在颅面图案化和形态发生中起作用。术语“dlx2蛋白”或“外源性dlx2”涵盖人dlx2蛋白，在本文中被鉴定为seq id no：11以及小鼠dlx2蛋白，在本文中被鉴定为seq id no：13。除了seq id no：11和seq id no：13的dlx2蛋白之外，术语“dlx2蛋白”涵盖dlx2蛋白的变体，如seq id no：11和seq id no：13的变体，所述变体可以包含在本文所述的方法中。
86.表达载体含有核酸，所述核酸包含编码所关注多肽的区段，所述所关注多肽与提供编码所关注多肽的区段的转录的一个或多个调控元件可操作地连接。如本文所使用的术
语“可操作地连接”是指与第二核酸有功能关系的核酸。术语“可操作地连接”涵盖两个或更多个核酸分子(如待转录的核酸和调控元件)的功能连接。如本文所使用的术语“调控元件”是指控制可操作地连接的核酸的表达的一些方面的核苷酸序列。示例性调控元件包含增强子，如但不限于：土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)；内部核糖体进入位点(ires)或2a结构域；内含子；复制起点；聚腺苷酸化信号(pa)；启动子；转录终止序列；以及上游调控结构域，其有助于可操作地连接的核酸序列的复制、转录、转录后加工。本领域的普通技术人员能够在不超过常规实验的情况下选择和使用表达载体中的这些和其它调控元件。
87.如本文所使用的术语“启动子”是指与如编码neurod1的核酸序列和/或编码dlx2的核酸序列等待转录的核酸序列可操作地连接的dna序列。启动子通常定位在待转录的核酸序列的上游，并且提供用于通过rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。在具体实施例中，启动子通常定位在被转录以产生期望分子的核酸序列的上游，并且提供由rna聚合酶和其它转录因子特异性结合的位点。
88.如本领域的技术人员将认识到的，基因的5
′
非编码区域可以被分离并且以其整体用作用于驱动可操作地连接的核酸的表达的启动子。可替代地，5
′
非编码区域的一部分可以被分离并且用于驱动可操作地连接的核酸的表达。通常，基因的5
′
非编码区域的约500-6000bp用于驱动可操作地连接的核酸的表达。任选地，使用基因的5
′
非编码区域的含有驱动可操作地连接的核酸的表达所需的最小量的5
′
非编码区域的部分。用于确定基因的5
′
非编码区域的指定部分驱动可操作连接的核酸表达的能力的测定是本领域熟知的。
89.根据本文所述的方法，用于驱动neurod1和/或dlx2表达的特定启动子是“普遍存在的”或“组成型”启动子，其驱动表达载体被转移到其中的生物体的许多、大多数或所有细胞类型中的表达。可以用于neurod1和/或dlx2的表达的普遍存在的启动子的非限制性实例是巨细胞病毒启动子；猿猴病毒40(sv40)早期启动子；劳斯氏肉瘤病毒启动子(rous sarcoma virus promoter)；腺病毒主要晚期启动子；β肌动蛋白启动子；甘油醛3-磷酸脱氢酶；葡萄糖调控蛋白78启动子；葡萄糖调控蛋白94启动子；热休克蛋白70启动子；β-驱动蛋白启动子；rosa启动子；泛素b启动子；真核起始因子4a1启动子和延长因子i启动子；所有这些启动子在本领域中都是熟知的并且可以使用常规方法从主要来源分离或从商业来源获得。启动子可以完全源自单个基因或者可以是嵌合的，具有源自多于一个基因的部分。
90.调控序列的组合可以包含在表达载体中并且用于驱动neurod1和/或dlx2的表达。包含在表达载体中以驱动neurod1和/或dlx2的表达的非限制性实例是cag启动子，所述启动子组合了巨细胞病毒cmv早期增强子元件和鸡-β肌动蛋白启动子。
91.根据本文所述的方法，用于驱动neurod1和/或dlx2的表达的特定启动子是优先驱动胶质细胞，特别是星形胶质细胞和/或ng2细胞中的表达的启动子。这种启动子被称为“星形胶质细胞特异性”和/或“ng2细胞特异性”启动子。
92.星形胶质细胞特异性启动子的非限制性实例是胶质原纤维酸性蛋白(gfap)启动子和醛脱氢酶1家族成员l1(aldh1l1)启动子。人gfap启动子在本文中被示出为seq id no：6。小鼠aldh1l1启动子在本文中被示出为seq id no：7。
93.ng2细胞特异性启动子的非限制性实例是硫酸软骨素蛋白聚糖4基因的启动子，也称为神经元-胶质抗原2(ng2)。人ng2启动子在本文中被示出为seq id no：8。
94.根据本文所述的方法，用于驱动neurod1和/或dlx2的表达的特定启动子是优先驱
动反应性胶质细胞，特别是反应性星形胶质细胞和/或反应性ng2细胞中的表达的启动子。这种启动子被称为“反应性星形胶质细胞特异性”和/或“反应性ng2细胞特异性”启动子。
[0095]“反应性星形胶质细胞特异性”启动子的非限制性实例是脂质运载蛋白2(lcn2)基因的启动子。小鼠lcn2启动子在本文中被示出为seq id no：5。
[0096]
普遍存在的启动子和细胞类型特异性启动子的同源物和变体可以用于表达neurod1和/或dlx2。
[0097]
在一些情况下，启动子同源物和启动子变体可以包含在用于表达neurod1和/或dlx2的表达载体中。术语“启动子同源物”和“启动子变体”是指与本文公开的那些启动子相比，具有基本上类似的功能性质以在编码neurod1(和/或dlx2)的可操作地连接的核酸上赋予期望的表达类型，如neurod1(和/或dlx2)的细胞类型特异性表达或neurod1(和/或dlx2)的普遍存在表达的启动子。例如，与gfap、s100b、aldh1l1、ng2、lcn2和cag启动子相比，启动子同源物或变体具有基本上类似的功能性质以在编码neurod1(和/或dlx2)的可操作地连接的核酸上赋予细胞类型特异性表达。
[0098]
本领域的技术人员将认识到，可以在不改变给定启动子的功能性质的情况下引入一个或多个核酸突变。可以使用如定点诱变和pcr介导的诱变等标准分子生物学技术引入突变，以产生启动子变体。如本文所使用的，术语“启动子变体”是指参考启动子，如但不限于gfap、s100b、aldh1l1、ng2、lcn2和pcag启动子的分离的天然存在的或重组制备的变体。
[0099]
本领域已知来自其它物种的启动子是具有功能的，例如小鼠aldh1l1启动子在人细胞中是具有功能的。可以使用本领域已知的生物信息学工具鉴定来自其它物种的同源物和同源启动子，参见例如，xuan等人，《基因组生物学(genome biol.)》，6：r72(2005)；zhao等人，《核酸研究》，33：d103-107(2005)；以及halees等人，《核酸研究》，31：3554-3559(2003)。
[0100]
在结构上，neurod1的细胞类型特异性启动子和/或普遍存在的启动子的同源物和变体与参考发育调节的和/或普遍存在的启动子具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核酸序列同一性，并且包含用于结合rna聚合酶的位点以及任选地用于转录因子的一个或多个结合位点。
[0101]
与seq id no：1或seq id no：3基本上相同的核酸序列的特征在于具有能够在高严格性杂交条件下与seq id no：1或seq id no：3杂交的互补核酸序列。
[0102]
除了编码neurod1的一个或多个核酸之外，编码另外的蛋白质的一个或多个核酸序列可以包含在表达载体中。例如，此类另外的蛋白质包含非neurod1蛋白，如包含但不限于β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白的报告基因以及抗生素抗性报告基因。
[0103]
在特定实施例中，重组表达载体编码至少seq id no：2的neurod1、与seq id no：2具有至少95％同一性的蛋白质或由与seq id no：1基本上相同的核酸序列编码的蛋白质。
[0104]
在特定实施例中，重组表达载体编码至少seq id no：4的neurod1、与seq id no：4具有至少95％同一性的蛋白质或由与seq id no：2基本上相同的核酸序列编码的蛋白质。
[0105]
seq id no：9是包含与编码neurod1的核酸可操作地连接的cag启动子并且进一步包含编码egfp和增强子wpre的核酸序列的核酸的实例。ires将编码neurod1的核酸与编码egfp的核酸分离。将seq id no：9插入到表达载体中，以便表达neurod1和报告基因egfp。任
选地，去除ires以及编码egfp的核酸，并且将剩余cag启动子以及编码neurod1的可操作地连接的核酸插入到表达载体中，以便表达neurod1。可以任选地包含wpre或另一种增强子。
[0106]
任选地，报告基因包含在编码neurod1(和/或dlx2)的重组表达载体中。可以包含报告基因以产生肽或蛋白质，所述肽或蛋白质用作从重组表达载体表达neurod1(和/或dlx2)的替代标志物。如本文所使用的术语“报告基因”是指当通过例如化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、诱导型标志物和/或配体结合测定表达时易于检测的基因。示例性报告基因包含但不限于绿色荧光蛋白(gfp)、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、增强型黄色荧光蛋白(eyfp)、青色荧光蛋白(cfp)、增强型青色荧光蛋白(ecfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、增强型蓝色荧光蛋白(ebfp)、mmgfp(zernicka-goetz等人，《发育(development)》，124：1133-1137(1997))、dsred、荧光素酶和β-半乳糖苷酶(lacz)。
[0107]
将遗传物质引入到接受者宿主细胞中的过程，如用于在宿主细胞中瞬时或稳定表达由遗传物质编码的期望蛋白质的过程被称为“转染”。转染技术是本领域熟知的，并且包含但不限于电穿孔、颗粒加速转化(也称为“基因枪”技术)、脂质体介导的转染、磷酸钙或氯化钙共沉淀介导的转染、deae-葡聚糖介导的转染、显微注射、聚乙二醇介导的转染、热休克介导的转染和病毒介导的转染。如本文所述，病毒介导的转染可以使用病毒载体，如源自腺病毒、腺相关病毒和慢病毒的病毒载体来完成。
[0108]
任选地，将宿主细胞离体转染并且然后重新引入到宿主生物体中。例如，可以从受试者体内去除细胞或组织，用编码neurod1(和/或dlx2)的表达载体转染，并且然后返回到受试者。
[0109]
将包含编码neurod1或其功能片段的核酸和/或编码dlx2或其功能片段的核酸的重组表达载体在体外或体内引入到宿主胶质细胞中，以便在宿主胶质细胞中表达外源性neurod1和/或dlx2，从而将胶质细胞转化成神经元是通过各种转染方法中的任何一种来实现的。
[0110]
外源性neurod1和/或dlx2在宿主胶质细胞中的表达使胶质细胞转化成神经元任选地通过将编码neurod1或其功能片段的mrna和/或编码dlx2或其功能片段的mrna在体外或体内引入到宿主胶质细胞来实现。
[0111]
外源性neurod1和/或dlx2在宿主胶质细胞中的表达使胶质细胞转化成神经元任选地通过将neurod1蛋白和/或dlx2蛋白在体外或体内引入到宿主胶质细胞来实现。这些和其它技术的细节是本领域已知的，例如，如以下文献中所描述的：j.sambrook和d.w.russell，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社；第3版，2001；f.m.ausubel编辑，《精编分子生物学实验指南》，《实验室指南》；第5版，2002；以及engelke，d.r.，《rna干扰(rnai)：rnai技术的具体细节》，宾夕法尼亚州伊格尔维尔的dna出版社有限责任公司，2003。
[0112]
将包含编码neurod1或其功能片段和/或dlx2或其功能片段的核酸、编码neurod1或其功能片段的mrna和/或编码dlx2或其功能片段的mrna和/或neurod1蛋白和/或dlx2蛋白、全长或其功能片段的表达载体任选地与用于在体外或体内引入到宿主细胞中的载体缔合。
[0113]
在特定方面，载体是颗粒载体，如脂质颗粒，包含脂质体、胶束、单层或多层囊泡；聚合物颗粒，如水凝胶颗粒、聚乙醇酸颗粒或聚乳酸颗粒；无机颗粒，如磷酸钙颗粒，如其它
地方(例如，美国专利第5,648,097号)所描述的磷酸钙颗粒；以及无机/有机颗粒载体，如其它地方(例如，美国专利第6,630,486号)所描述的无机/有机颗粒载体。
[0114]
颗粒载体可以选自脂质颗粒；聚合物颗粒；无机颗粒；以及无机/有机颗粒。颗粒类型的混合物也可以作为颗粒药学上可接受的载体被包含在内。
[0115]
颗粒载体通常被调配成使得颗粒的平均粒度在约1nm到10微米的范围内。在特定方面，颗粒载体被调配成使得颗粒的平均粒度在约1nm到100nm的范围内。
[0116]
对脂质体和与其制备和用途相关的方法的进一步描述可见于《脂质体：实用方法(liposomes：a practical approach)》(实用方法系列，264)，v.p.torchilin和v.weissig(编辑)，牛津大学出版社(oxford university press)；第2版，2003。在s.m.moghimi等人，《美国实验生物学学会联合会杂志(faseb j.)》，19：311-30(2005)中描述了纳米颗粒的另外的方面。
[0117]
使用重组表达载体表达neurod1和/或dlx2是通过将表达载体引入到真核或原核宿主细胞表达系统，如昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞或本领域公认的任何其它单细胞或多细胞生物体中来完成的。宿主细胞任选地是原代细胞或永生化源性细胞。永生化细胞是可以在体外维持至少5次复制传代的细胞。
[0118]
在产生neurod1和/或dlx2的条件下维持含有重组表达载体的宿主细胞。可以使用已知的细胞培养技术培养和维持宿主细胞，所述细胞培养技术如celis，julio编辑，1994，《细胞生物学实验室手册(cell biology laboratory handbook)，纽约的学术出版社(academic press，n.y)中所述。本领域的技术人员可以选择和优化这些细胞的各种培养条件，包含关于特定营养物、氧气、张力、二氧化碳和降低的血清水平的培养基调配物。
[0119]
在一些情况下，将包含编码neurod1和/或dlx2的核酸的重组表达载体引入到受试者的胶质细胞中。外源性neurod1和/或dlx2在胶质细胞中的表达使胶质细胞“转化”成神经元。
[0120]
在一些情况下，将包含编码neurod1和/或dlx2或其功能片段的核酸的重组表达载体引入到受试者的星形胶质细胞中。外源性neurod1和/或外源性dlx2在胶质细胞中的表达使星形胶质细胞“转化”成神经元。
[0121]
在一些情况下，将包含编码neurod1的核酸和/或编码dlx2或其功能片段的核酸的重组表达载体引入到受试者的反应性星形胶质细胞中。外源性neurod1和/或外源性dlx2或其功能片段在反应性星形胶质细胞中的表达使反应性星形胶质细胞“转化”成神经元。
[0122]
在一些情况下，将包含编码neurod1的核酸和/或编码dlx2或其功能片段的核酸的重组表达载体引入到受试者的ng2细胞中。外源性neurod1和/或外源性dlx2或其功能片段在ng2细胞中的表达使ng2细胞“转化”成神经元。
[0123]
在引入包含编码外源性neurod1的核酸和/或编码外源性dlx2或其功能片段的核酸的重组表达载体后，外源性neurod1和/或外源性dlx2的表达的检测是使用各种标准方法中的任何标准方法，包含但不限于检测neurod1和/或dlx2的免疫测定、检测neurod1核酸和/或dlx2核酸的核酸测定以及与外源性neurod1和/或外源性dlx2共表达的报告基因的检测来完成的。
[0124]
术语“转化(converts)”和“转化的(converted)”在本文中用于描述neurod1或其功能片段和/或dlx2或其功能片段的表达导致胶质细胞、星形胶质细胞或反应性星形胶质
细胞表型改变为神经元表型的作用。类似地，短语“neurod1转化的神经元”、“dlx2转化的神经元”、“neurod1和dlx2转化的神经元”和“经转化的神经元”在本文中用于指代包含具有随之发生的神经元表型的外源性neurod1蛋白或其功能片段的细胞。
[0125]
术语“表型”是指本文所提及的细胞的熟知的可检测特性。神经元表型可以是但不限于以下的一种或多种：神经元形态、一种或多种神经元标志物的表达、神经元的电生理学特性、突触形成和神经递质的释放。例如，神经元表型涵盖但不限于：神经元的特征性形态方面，如树突、轴突和树突脊的存在；特征性神经元蛋白表达和分布，如在突触点中存在突触蛋白、在树突中存在map2；以及特征性电生理体征，如自发和诱发突触事件。
[0126]
在另外的实例中，如星形胶质细胞表型和反应性星形胶质细胞表型等胶质表型涵盖但不限于：星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞的特征性形态方面，如通常“星形”形态；以及特征性星形胶质细胞和反应性星形胶质细胞蛋白表达，如胶质原纤维酸性蛋白(gfap)的存在。
[0127]
术语“核酸”是指具有多于一个核苷酸的任何形式的rna或dna分子包含单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸。术语“核苷酸序列”是指单链形式的核酸中的寡核苷酸或多核苷酸中的核苷酸的排序。
[0128]
术语“neurod1核酸”是指分离的neurod1核酸分子，并且涵盖具有与seq id no：1或seq id no：3中所示的dna序列或其互补体或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的分离的neurod1核酸，或具有在高严格性杂交条件下与seq id no：1或seq id no：3中所示的核酸、其互补体或其片段杂交的序列的分离的dna分子。
[0129]
seq id no：3的核酸是具有在高严格性杂交条件下与seq id no：1中所示的核酸杂交的序列的分离的dna分子的实例。neurod1核酸的片段是在本文所述的一方面中可操作的neurod1核酸的任何片段，包含neurod1核酸。
[0130]
能够与靶neurod1 mrna或cdna杂交的核酸探针或引物可以用于检测和/或定量编码neurod1蛋白的mrna或cdna。核酸探针可以是长度为至少10个、15个、30个、50个或100个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严格条件下与neurod1 mrna或cdna或其互补序列特异性杂交。核酸引物可以是长度为至少10个、15个或20个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严格条件下与mrna或cdna或其互补序列特异性杂交。
[0131]
术语“dlx2核酸”是指分离的dlx2核酸分子，并且涵盖具有与seq id no：10或seq id no：12中所示的dna序列或其互补体或其片段具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列的分离的dlx2核酸，或具有在高严格性杂交条件下与seq id no：10或seq id no：12中所示的核酸、其互补体或其片段杂交的序列的分离的dna分子。
[0132]
seq id no：12的核酸是具有在高严格性杂交条件下与seq id no：10中所示的核酸杂交的序列的分离的dna分子的实例。dlx2核酸的片段是在本文所述的一方面中可操作的dlx2核酸的任何片段，包含dlx2核酸。
[0133]
能够与靶dlx2 mrna或cdna杂交的核酸探针或引物可以用于检测和/或定量编码dlx2蛋白的mrna或cdna。核酸探针可以是长度为至少10个、15个、30个、50个或100个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严格条件下与neurod1 mrna或cdna或其互补序列特异性杂交。核
酸引物可以是长度为至少10个、15个或20个核苷酸的寡核苷酸，并且足以在严格条件下与mrna或cdna或其互补序列特异性杂交。
[0134]
术语“互补体”和“互补”是指核苷酸之间的沃森-克里克碱基配对(watson-crick base pairing)并且具体地是指彼此氢键键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键与腺嘌呤残基连接并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。通常，核酸包含描述为与指定的第二核苷酸序列具有“百分比互补性”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可以与指定的第二核苷酸序列具有80％、90％或100％互补性，这表明序列的10个核苷酸中的8个、10个核苷酸中的9个或10个核苷酸中的10个与指定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3
′‑
tcga-5
′
与核苷酸序列5
′‑
agct-3
′
是100％互补的。另外，核苷酸序列3
′‑
tcga-与核苷酸序列5
′‑
ttagctgg-3
′
的区域是100％互补的。
[0135]
术语“杂交(hybridization)”和“杂交(hybridizes)”是指互补核酸的配对和结合。杂交在两个核酸之间以不同程度发生，这取决于如核酸的互补程度、核酸的解链温度tm以及杂交条件的严格性等因素，如本领域中熟知的。术语“杂交条件的严格性”是指杂交介质相对于如甲酰胺和登哈特氏溶液(denhardt
′
s solution)等特定常见添加剂的温度、离子强度和组成的条件。
[0136]
与特定核酸相关的特定杂交条件的确定是常规的并且是本领域熟知的，例如，如在以下文献中所描述的：j.sambrook和d.w.russell，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社；第3版，2001；以及f.m.ausubel编辑，《精编分子生物学实验指南》，《实验室指南》；第5版，2002。高严格性杂交条件是仅允许基本上互补的核酸杂交的那些条件。通常，具有约85-100％互补性的核酸被认为是高度互补的并且在高严格性条件下杂交。中间严格性条件被例示为具有中间互补性、约50-84％互补性的核酸以及具有高互补性程度的核酸杂交的条件。相反，低严格性杂交条件是具有低互补性程度的核酸杂交的条件。
[0137]
术语“特异性杂交(specific hybridization)”和“特异性杂交(specifically hybridizes)”是指特定核酸与靶核酸的杂交，而不与样品中除了靶核酸之外的核酸发生实质性杂交。
[0138]
杂交和洗涤条件的严格性取决于若干因素，包含探针和靶标的tm以及杂交和洗涤条件的离子强度，如本领域技术人员熟知的。例如在以下文献中描述了杂交和用于实现期望的杂交严格性的条件：sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，2001；以及ausubel，f.等人(编辑)，《精编分子生物学实验指南》，威利出版公司(wiley)，2002。
[0139]
高严格性杂交条件的实例是长度超过约100个核苷酸的核酸在含有6x ssc、5x登哈特氏溶液、30％甲酰胺和100微克/毫升变性鲑鱼精子的溶液中在37℃下杂交过夜，随后在0.1x ssc和0.1％sds的溶液中在60℃下洗涤15分钟。ssc是0.15m nacl/0.015m柠檬酸钠。登哈特氏溶液是0.02％牛血清白蛋白/0.02％ficoll/0.02％聚乙烯吡咯烷酮。在高严格条件下，seq id no：1和seq id no：3将与基本上相同靶标的互补体杂交，而不与不相关序列杂交。
[0140]
根据本文所述的一些方面，提供了治疗有需要的受试者的神经病状的方法，所述方法包含将治疗有效量的neurod1和/或dlx2递送到受试者的中枢神经系统或外周神经系统的胶质细胞，胶质细胞中的治疗有效量的neurod1和/或dlx2导致受试者的神经元数量比
dlx2-gfp：2.36
×
10
12
。在第21天，收集关于星形胶质细胞转化的数据。
[0157]
图2a-2b示出了关于短期内体内转化的实验的示意图。进行不同的病毒注射时间(立即、中风后2天、中风后4天和中风后7天)以找到修复ich的最佳时间窗口。图2c-2p相应地揭示了gfp、gfap和neun的免疫染色。结果一致地显示，在损伤核心周围转化率降低、神经元密度降低和反应性星形胶质细胞增加连同病毒注射时间点延迟。
[0158]
这些结果证明，早期的病毒注射具有更好的治疗效果。如果在中风后立即或2天内注射病毒，则可以实现更高的转化率，并且星形胶质细胞的反应性将会更低。
[0159]
实例3-在脑内出血的小鼠模型中反应性星形胶质细胞向神经元的体内转化(长期)
[0160]
进行一组实验以评估在用编码neurod1和dlx2的aav5病毒处理后反应性星形胶质细胞向神经元的体内转化。通过将0.35μl胶原酶注射到纹状体中进行第0天的ich诱导。ich诱导后第2天和第7天，向小鼠注射1μl的aav5-gfa104-cre：3
×
10
11
、1μl的aav5-cag-flex-gfp：3.4
×
10
11
、1μl的aav5-cag-flex-nd1-gfp：4.55
×
10
11
或1μl的aav5-cag-flex-dlx2-gfp：2.36
×
10
12
。诱导后两个月，收获小鼠并且收集数据。
[0161]
图3a示出了nd1和dlx2对ich的长期修复作用的实验设计。图3b-3g呈现了gfp、gfap和neun的免疫染色。图3b-3c示出了在ich后立即注射病毒时在病毒感染后两个月，几乎所有gfp阳性细胞具有神经元形态并且表达neun。图3d示出了在ich后2天注射病毒时2个月的病毒感染。感染并不广泛，这可能是由于病毒注射点太靠近心室而引起的。图3e-3f示出了在ich后7天注射病毒后，病毒感染2个月后的免疫染色。转化率低于ich后立即病毒注射。图3h示出了不同病毒注射时间点的转化率和神经元密度的比较(低感染排除了中风后2天)。结果表明，立即病毒注射可能是治疗ich的理想时间点。
[0162]
这些结果证明，ich后的早期病毒注射可能具有更好的修复效果：更高的转化率以及更高的神经元密度。
[0163]
实例4-在ich后在体内转化中对病毒载体的评估：aav9-1.6kb-gfap-cre-flex系统
[0164]
为了实现nd1和dlx2的更高感染和更高表达，开发了以下病毒系统：具有flex-nd1-mcherry和flex-dlx2-mcherry的aav9-1.6kb-gfap-cre。图4a-4f中的结果表明，即使aav9可以实现nd1和dlx2的更高表达，但其比aav5具有更多的泄漏。然而，治疗仍然显示出gfap反映的密度较低的胶质瘢痕，并且在aqp4中显示出稍微更好的血管形态。iba1信号在治疗中比对照更强，而小胶质细胞在转化中的作用尚不清楚。
[0165]
这些结果证明，无论泄漏如何，aav9-1.6kb-gfap-cre-flex系统可以是ich后体内星形胶质细胞向神经元转化的有效替代方案。
[0166]
实例5-在ich后在体内转化中对病毒载体评估：aav5-1.6kb-gfap-cre-flex系统以及损伤对转化率的影响
[0167]
图5a-5e示出了aav5系统的感染。几乎没有gfp阳性的神经元，这表明此系统相对干净。此外，从不同方面观察到恢复效果：损伤核心周围的gfap信号下调、神经元密度增加、血管周围aqp4信号增多，这表明血脑屏障恢复。这表明aav5系统是用于体内星形胶质细胞向神经元转化以及用于治疗ich的有效系统。图6a-6e示出了损伤对转化率的影响。损伤越严重，转化率越低。
[0168]
实例6-用于ich后体内转化的治疗应用的理想时间点的推理
[0169]
图7示出了在胶原酶注射后2天病毒感染4天。血肿是可见的，并且在血肿内无病毒信号。在血肿周围区域存在显著的病毒感染。有可能的是，血肿的存在阻碍了ich后的病毒感染和修复。为了解决这个问题，可以施用一个或多个小分子以抑制血肿的生长，和/或可以在血肿被吸收之后另外施用病毒一次或多次以获得nd1和dlx2的改善的表达。
[0170]
图8揭示了当ich发生时尽快采取行动是有益的。星形胶质细胞在ich后开始增殖并在约中风后5天达到峰值。图8还揭示了在中风后8天形成致密胶质瘢痕。胶质瘢痕将损伤核心分离并且使损伤不可逆转。因此，为了避免形成胶质瘢痕，可以尽可能快地进行治疗(例如，小于中风后5天、小于中风后4天、小于中风后3天、小于中风后2天、小于中风后1天，在中风12小时内、在中风8小时内或在中风6小时内)。
[0171]
实例7：杂项材料
[0172]
图9显示，早期病毒注射可以导致损伤核心的尺寸较小和转化率较高。图10示出了在中风后7天进行的病毒注射可能优于在中风后2天的罕见情况。然而，初始条件是在ich后的不同时间点测量的。图11示出了ich的过程以及每个步骤的对应处理的简图。这项技术可以用于ich后的长期恢复。
[0173]
实例8-另外的实施例
[0174]
实施例1.一种用于在患有出血性中风并且需要(1)产生新的谷氨酸能神经元；(2)增加gaba能神经元的存活率；(3)产生新的非反应性星形胶质细胞；或(4)减少反应性星形胶质细胞的数量的哺乳动物体内进行所述(1)、(2)、(3)或(4)的方法，其中所述方法包括向所述哺乳动物施用包括编码神经源性分化1(neurod1)多肽或其生物活性片段的外源性核酸和编码远端缺失同源盒2(dlx2)多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物。
[0175]
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0176]
实施例3.根据实施例1所述的方法，其中所述出血性中风是由于选自由以下组成的组的病状引起的：缺血性中风；身体损伤；肿瘤；炎症；感染；由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的全局缺血；由缺氧、低血糖或贫血引起的缺氧-缺血性脑病；脑膜炎；以及脱水；或其任何两种或更多种的组合。
[0177]
实施例4.根据实施例1所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的表达载体。
[0178]
实施例5.根据实施例1或2所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的重组病毒表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的重组病毒表达载体。
[0179]
实施例6.根据实施例1到3中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的重组腺相关病毒表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的重组腺相关病毒表达载体。
[0180]
实施例7.根据实施例1到6中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑中的所述出血性中风的位置进行立体定向颅内注射。
[0181]
实施例8.根据实施例1到7中任一项所述的方法，其中所述施用步骤进一步包括在
一个表达载体、一个重组病毒表达载体或一个重组腺相关病毒表达载体上施用编码neurod1多肽或其生物活性片段的所述外源性核酸以及编码dlx2多肽或其生物活性片段的所述外源性核酸。
[0182]
实施例9.根据实施例1所述的方法，其中所述组合物包括约1μl到约500μl的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体含有浓度为10
10-10
14
个腺相关病毒颗粒/毫升的包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸以及编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的载体的腺相关病毒。
[0183]
实施例10.根据实施例9所述的方法，其中将所述组合物以约0.1微升/分钟到约5微升/分钟的受控流速注射到所述哺乳动物的脑中。
[0184]
实施例11.一种用于在患有出血性中风并且需要(1)产生新的gaba能和谷氨酸能神经元；(2)增加gaba能和谷氨酸能神经元的存活率；(3)产生新的非反应性星形胶质细胞；或(4)减少反应性星形胶质细胞的数量的哺乳动物体内进行所述(1)、(2)、(3)或(4)的方法，其中所述方法包括在发生所述出血性中风3天内向所述哺乳动物施用包括编码神经源性分化1(neurod1)多肽或其生物活性片段的外源性核酸和编码远端缺失同源盒2(dlx2)多肽或其生物活性片段的外源性核酸的组合物。
[0185]
实施例12.根据实施例11所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
[0186]
实施例13.根据实施例11所述的方法，其中所述出血性中风是由于选自由以下组成的组的病状引起的：脑出血；动脉瘤；颅内血肿；蛛网膜下出血；脑外伤；高血压；血管薄弱；血管畸形；缺血性中风；身体损伤；肿瘤；炎症；感染；由心脏骤停或严重低血压(休克)引起的全局缺血；由缺氧、低血糖或贫血引起的缺氧-缺血性脑病；脑膜炎；以及脱水；或其任何两种或更多种的组合。
[0187]
实施例14.根据实施例11所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的表达载体。
[0188]
实施例15.根据实施例11或12所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的重组病毒表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的重组病毒表达载体。
[0189]
实施例16.根据实施例11到13中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑中的所述出血性中风的位置递送包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸的重组腺相关病毒表达载体以及包括编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的重组腺相关病毒表达载体。
[0190]
实施例17.根据实施例11到16中任一项所述的方法，其中所述施用步骤包括向脑中的所述出血性中风的位置进行立体定向颅内注射。
[0191]
实施例18.根据实施例11到17中任一项所述的方法，其中所述施用步骤进一步包括在一个表达载体、一个重组病毒表达载体或一个重组腺相关病毒表达载体上施用编码neurod1多肽或其生物活性片段的所述外源性核酸以及编码dlx2多肽或其生物活性片段的所述外源性核酸。
[0192]
实施例19.根据实施例11所述的方法，其中所述组合物包括约1μl到约500μl的药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体含有浓度为10
10-10
14
个腺相关病毒颗粒/毫
升的包括编码neurod1多肽或其生物活性片段的核酸以及编码dlx2多肽或其生物活性片段的核酸的载体的腺相关病毒。
[0193]
实施例20.根据实施例19所述的方法，其中将所述组合物以约0.1微升/分钟到约5微升/分钟的受控流速注射到所述哺乳动物的脑中。
[0194]
序列
[0195]
seq id no：1-编码人neurod1蛋白的人neurod1核酸序列-1071个核苷酸，包含终止密码子
[0196][0197]
seq id no：2-由seq id no：1编码的人neurod1氨基酸序列-356个氨基酸
[0198][0199]
seq id no：3-编码小鼠neurod1蛋白的小鼠neurod1核酸序列-1074个核苷酸，包含终止密码子
[0200][0201][0202]
seq id no：4-由seq id no：3编码的小鼠neurod1氨基酸序列-357个氨基酸
[0203][0204]
小鼠lcn2启动子-seq id no：5
[0205][0206][0207]
人gfap启动子-seq id no：6
[0208][0209]
小鼠aldh1l1启动子-seq id no.7
[0210]
[0211][0212]
人ng2启动子-seq id no：8
[0213]
[0214][0215]
cag：：neurod1-ires-gfp-seq id no.9
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220][0221]
seq id no：10-编码人dlx2蛋白的人dlx2核酸序列
[0222]
[0223][0224]
seq id no：11-由seq id no：10编码的人dlx2氨基酸序列
[0225][0226]
seq id no：12-编码小鼠dlx2蛋白的小鼠dlx2核酸序列
[0227][0228]
[0229]
seq id no：13-由seq id no：12编码的小鼠dlx2氨基酸序列
[0230][0231]
其它实施例
[0232]
应当理解，虽然已经结合本发明的具体描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其它方面、优点以及修改都在以下权利要求书的范围内。