具有异源跨膜结构域的受体

具有异源跨膜结构域的受体
关于联邦政府资助研发的声明
1.本发明是在由美国国立卫生研究院授予的授权号od025751下在美国政府支持下完成的。政府拥有本发明中的某些权利。相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月24日提交的美国临时专利申请号62/905,258的优先权，所述申请的公开内容通过引用以其整体(包含所有附图在内)并入本文。序列表的并入
3.本技术含有序列表，所述序列表通过引用以其整体特此并入。所附的名称为“048536_658001wo_sequence_listing_st25.txt”的序列表文本文件创建于2020年9月23日，并且为156kb。
技术领域
4.本公开文本总体上涉及结合细胞表面配体并且具有可选择的特异性和活性的新合成细胞受体。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、经所述核酸遗传修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗各种健康状况或疾病如癌症的方法。


背景技术：

5.限制工程化细胞疗法在人中的开发的重要问题是调控治疗基因表达和工程化细胞活性的能力。例如，第一代嵌合抗原受体t细胞(car-t)缺少在需要时调节或关闭car-t活性的能力；其他问题包括脱靶活性和脱肿瘤/中靶活性(即，其中car-t靶抗原也发现于肿瘤外部的正常细胞上)。这些问题的一种可能的解决方案是使用能够修饰基因表达和/或细胞行为的合成受体。
6.notch受体是1型跨膜蛋白，其介导细胞间信号传导并且在发育和细胞间通讯(例如在两个接触细胞之间的通讯，其中一个接触细胞是“接收”细胞并且另一个接触细胞是“发送”细胞)的其他方面中发挥核心作用。接收细胞中表达的notch受体识别它们的在发送细胞上表达的配体(δ/serrate/lag或“dsl”蛋白家族)。这些接触细胞上notch与dsl配体的接合导致notch受体的两步蛋白水解，其最终导致受体的胞内部分从膜释放到细胞质中。notch具有金属蛋白酶切割位点(称为“s2”)，其通常被notch负调控区(nrr)保护免于切割，所述notch负调控区含有notch胞外亚基(nec)的三个lin-12-notch重复(lnr)模块和一个异二聚化结构域(hd)。定位于hd结构域的c末端是跨膜结构域(tmd)。其含有s3切割位点，所述切割位点是γ-分泌酶复合物(γsec)的调控的膜内蛋白水解的底物。s3蛋白水解导致notch胞内结构域的释放。这个事件将仅在限速的s2切割已经发生后才发生，使得s3是γsec可及的。
7.认为这种蛋白水解通过发送细胞施加的力来调控：dsl配体拉动notch受体，从而改变(nrr)的构象，并暴露s2金属蛋白酶位点。这是通过组成型活性蛋白酶来切割，释放受
体的胞外结合部分和负调控区。所述受体的配体结合部分的释放又暴露一个或多个其他膜内切割位点(例如，s3位点)，所述其他膜内切割位点由细胞膜内的γ-分泌酶切割并释放核归巢胞内结构域(icd)。w.r.gordon等人,dev cell(2015)33:729-36。这种释放的结构域通过作为转录调控因子发挥作用而改变接收细胞行为。因此，notch跨膜结构域的切割是notch信号传导通路中的必需步骤，其是发育期间的多种细胞功能所涉及和需要的。另外，先前报道阻止这个切割过程会引起严重失调和疾病。此外，对notch tmd的γ-分泌酶切割的抑制可能引起毒性的近期报道加快了通过抑制淀粉样前体蛋白的γ-分泌酶切割来预防或治疗阿尔茨海默病的努力。
8.不论是天然的还是合成的，受体具有变化的特征，如“噪声”(即，在不存在预期配体的情况下诱导的基线表达水平)，以及信号或敏感性(通过预期配体的结合诱导的表达的量)。通常，经由notch和notch受体的现有第一代合成衍生物(通常被称为“synnotch”)的信号传导与配体结合相关联，但是难以调整所述受体的敏感性和反应，并且需要更多的工具来提供具有更宽范围的更易调控的特征的合成受体。


技术实现要素：

9.本公开文本描述具有异源跨膜结构域(tmd)的合成受体。令人惊讶地，改变这个结构域可以显著影响所述受体的信号特征，如受体表达的程度、来自配体诱导的激活的信号水平以及在不存在配体的情况下的信号水平。本文提供展现通过异源tmd的包括介导的一定范围的信号特征的合成嵌合受体。这些受体提供一定范围的敏感性，包括当在激活的t细胞中表达时对t细胞激活程度敏感的受体。当在t细胞中表达时，一些实施方案展现如与t细胞未被激活时配体诱导的信号水平相比，在t细胞被激活时更高的配体诱导的信号水平。
10.本公开文本尤其提供含有包含至少一个γ-分泌酶位点的异源跨膜结构域的新型嵌合受体。因为tmd的切割是notch信号传导通路中的必需步骤，其是发育期间多种细胞功能所涉及和所需的，认为tmd切割的调节有利于对本文所公开的嵌合受体的活性的优化和/或改进，这又可能在调节细胞活性中和/或治疗健康状况例如疾病中特别有用。
11.在一个方面，本文提供嵌合多肽，其从n末端到c末端包括：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外结合结构域；(b)连接序列，其具有：(i)与notch jmd的至少约80％序列同一性；(ii)与notch jmd的至少约80％序列同一性，其中notch受体的lin-12-notch重复(lnr)和/或异二聚化结构域(hd)已经缺失；(iii)与多肽铰链结构域的至少约80％序列同一性；(iv)与包括至少一个纤连蛋白(fn)重复的robo1近膜结构域(jmd)的至少约80％序列同一性；或者(v)具有约2至约40个氨基酸的多肽；(c)与1型跨膜受体的跨膜结构域具有至少约80％序列同一性并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域(tmd)；以及(d)包含转录调控因子的胞内结构域(icd)，其中所述选定的配体与所述胞外结合结构域的结合诱导在所述转录调控因子与所述连接序列之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中(i)在所述连接序列与notch jmd或者其中notch受体的lnr和/或hd已经缺失的notch jmd具有至少约80％序列同一性时，所述tmd对于所述连接序列是异源的，并且(ii)在所述连接序列与notch jmd或者其中notch受体的lnr和/或hd已经缺失的notch jmd不具有至少约80％序列同一性时，所述跨膜结构域不是notch1 tmd。
12.本文所提供的嵌合多肽的非限制性示例性实施方案包括以下特征中的一种或多
种：在一些实施方案中，所述嵌合多肽还包括在所述tmd与所述icd之间的停止转移序列(sts)；在一些实施方案中，所述tmd包含与来自1型跨膜受体的跨膜结构域具有至少80％序列同一性的多肽序列并且包含γ-分泌酶切割位点；在一些实施方案中，所述tmd包含与来自i型跨膜受体的跨膜结构域具有至少90％序列同一性的多肽序列并且包含γ-分泌酶切割位点；在一些实施方案中，所述tmd包含与来自i型跨膜受体的跨膜结构域具有至少95％序列同一性的多肽序列并且包含γ-分泌酶切割位点。
13.在一些实施方案中，所述胞外结构域包含能够结合至细胞表面上的配体的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述细胞是病原体。在一些实施方案中，所述配体包括蛋白质或碳水化合物。在一些实施方案中，所述配体是分化簇(cd)标记物。在一些实施方案中，所述cd标记物选自cd1、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、cd1e、cd2、cd3d、cd3e、cd3g、cd4、cd5、cd7、cd8a、cd8b、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd27、cd28、cd33、cd34、cd40、cd45、cd48、cd52、cd59、cd66、cd70、cd71、cd72、cd73、cd79a、cd79b、cd80(b7.1)、cd86(b7.2)、cd94、cd95、cd134、cd140(pdgfr4)、cd152、cd154、cd158、cd178、cd181(cxcr1)、cd182(cxcr2)、cd183(cxcr3)、cd210、cd246、cd252、cd253、cd261、cd262、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、cd276(b7h3)、cd279、cd295、cd339(jag1)、cd340(her2)、egfr、fgfr2、cea、afp、ca125、muc-1、mage、bcma(cd269)、alppl2、gfp、egfp和sirpα。
14.在另一方面，本文提供包含编码如本文所公开的嵌合多肽的核苷酸序列的核酸。在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达盒或表达载体中。
15.在另一方面，本文提供重组细胞，其包括(a)如本文所公开的嵌合多肽和/或(b)如本文所公开的重组核酸。在另一方面，本文还提供细胞培养物，其包括至少一种如本文所公开的重组细胞和培养基。
16.在另一方面，本文提供药物组合物，其包括药学上可接受的载体和以下中的一种或多种：(a)如本文所公开的重组核酸，或者(b)如本文所公开的重组细胞。在一些实施方案中，所公开的药物组合物包含如本文公开的重组核酸和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。
17.在另一方面，本文提供用于调节细胞的活性的方法，其包括：(a)提供本公开文本的重组细胞，以及(b)使其与选定的配体接触，其中所述选定的配体与所述胞外结合结构域的结合诱导配体诱导型蛋白水解切割位点的切割并释放转录调控因子，其中所释放的转录调控因子调节所述重组细胞的活性。另一方面涉及用于抑制个体中靶细胞的活性的方法，其包括向所述个体施用有效数量的本公开文本的重组细胞，其中所述重组细胞抑制所述个体中靶细胞的活性。
18.在另一方面，本文提供用于治疗个体的健康状况(例如，疾病)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效数量的本公开文本的重组细胞的步骤，其中所述重组细胞治疗所述个体的健康状况。
19.在另一方面，本文提供用于调节细胞的活性、调节靶细胞的活性或治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)的系统，其中所述系统包括以下中的一种或多种：本公开文本的嵌合多肽；本公开文本的多核苷酸；本公开文本的重组细胞；或者本公开文本的药物组合物。
20.在另一方面，本文提供用于制备本公开文本的重组细胞的方法，其包括：(a)提供
能够表达蛋白质的细胞；以及(b)使所提供的细胞与本公开文本的重组核酸接触。在一些实施方案中，通过对从人受试者或患者获得的样品进行的白细胞单采术获得所述细胞，并且离体接触所述细胞。在一些实施方案中，所述重组核酸被包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。
21.在另一方面，本文提供以下中的一种或多种的用途：本公开文本的嵌合多肽、本公开文本的多核苷酸、本公开文本的重组细胞或本公开文本的药物组合物，其用于健康状况(例如，疾病)的治疗。在一些实施方案中，所述健康状况是癌症。
22.在另一方面，本文提供以下中的一种或多种的用途：本公开文本的嵌合多肽、本公开文本的多核苷酸、本公开文本的重组细胞或本公开文本的药物组合物，其用于制造用于健康状况(例如，疾病)的治疗的药物中。
23.前述发明内容仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了本文描述的说明性实施方案和特征之外，根据附图、具体实施方式和权利要求，本公开文本的其他方面、实施方案、目的和特征将变得完全清楚。
附图说明
24.图1a-图1d示意性地说明synnotch受体与本公开文本的嵌合多肽之间的差异。图1a描绘现有合成notch受体(synnotch)的示意性结构。图1b描绘具有异源跨膜结构域(tmd)的示例性第二代synnotch受体的示意性结构。在这种嵌合synnotch受体中，tmd关于相邻的胞内结构域(icd)和连接多肽是异源的。图1c描绘如本文所公开的另一种示例性第二代合成notch受体。在这种嵌合notch受体(微型notch)中，野生型notch多肽的lnr结构域和hd结构域(它们一起形成notch调控区，nrr)已经缺失，并且tmd对于胞外结构域(连接多肽)是异源的。图1d描绘如本文所公开的另一种示例性第二代合成notch受体。在这种嵌合notch受体(铰链-notch)受体中，野生型notch多肽的notch胞外亚基已经缺失，并且将衍生自cd8α铰链结构域的铰链多肽序列插入tmd的n末端。在这些示例性嵌合notch受体的每一种中，胞外结合结构域包含对选定的配体具有结合亲和力的单链抗原结合片段(scfv),所述配体在这个实施例中是b淋巴细胞抗原cd19。
25.图2描绘针对可以运用于本文所述的嵌合多肽和受体中的跨膜结构域的筛选的实验设计。用衍生自88种已知的人γ分泌酶靶标的跨膜结构域(haapalaso,j alzheimers dis.25(1):3-28,2011)和来自模式生物的notch家族成员来进行所述筛选。将蓝色荧光报告基因(bfg)置于具有4个拷贝的gal4识别位点的启动子(即，gal4反应元件)的控制下。
26.图3概括针对具有更高的配体诱导的激活活性的tmd的筛选的结果。在这些实验中，将对应于来自88种已知的人γ分泌酶靶标的跨膜结构域(haapalaso,2011)和来自模式生物的notch家族成员的氨基酸序列并入图1中示意性描绘的受体中。用受体构建体转导报告物阳性jurkat t细胞系。使用alexafluor647标记的抗myc抗体(cell signaling)测量受体表达。对于受体激活测试，将1
×
105个表达抗cd19受体的jurkat t细胞与以下共培养24小时：无添加、1
×
105个k562细胞或1
×
105个cd19 k562细胞。使用fortessa x-50(bd biosciences)测量诱导型bfp报告基因的转录激活。根据板图(每个孔一种tmd)将bfp ％绘图。
27.图4显示：(顶部)96孔板的图，其显示如图3中所述用于每个孔中的构建体质粒；
(中间)每个孔中转导的jurkat细胞群的受体阳性百分比，如通过af647-抗myc抗体染色所测量；以及(底部)校正的激活，通过用未校正的激活百分比(bfp ％)除以呈myc阳性的jurkat的百分比来计算。
28.图5显示jurkat t细胞系中微型notch1 tmd筛选的热图。用受体构建体转导报告物阳性jurkat t细胞系。使用alexafluor647标记的抗myc抗体(cell signaling)测量受体表达。对于受体激活测试，将1
×
105个表达抗cd19受体的jurkat t细胞与以下共培养24小时：无添加、1
×
105个k562细胞或1
×
105个cd19 k562细胞。使用fortessa x-50(bd biosciences)测量诱导型bfp报告基因的转录激活。根据板图(每个孔一种tmd)将bfp ％绘图。
29.图6显示：(顶部)96孔板的图，其显示如图5中所述用于每个孔中的构建体质粒；(中间)每个孔中转导的jurkat细胞群的受体阳性百分比，如通过af647-抗myc抗体染色所测量；以及(底部)校正的激活，通过用未校正的激活百分比(bfp ％)除以呈myc阳性的jurkat百分比来计算。
30.图7描绘实验设计以显示tmd调控notch激活。用含有具有tmd变体的notch受体的慢病毒构建体转导表达bfp报告物构建体的jurkat t细胞。将jurkat与对照cd19(-)或cd19( )k562细胞1:1共培养。随后使用fortessa x-50(bd biosciences)测量bfp报告基因激活。将在cd19 k562与k562条件下来自bfp 细胞的mfi的信噪比针对所述两种条件中的mfi变化绘图。
31.图8a-图8b示意性地概括用于铰链-notch构建体中的notch1跨膜结构域(tmd)的突变分析的实验的结果。制备在铰链-notch构建体的tmd结构域中具有不同丙氨酸突变的变体。在铰链-notch的tmd中从301位(f)至322位(s)的每个氨基酸残基单独突变为丙氨酸。将原代人cd4 t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabeads激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达tmd突变体变体，而另一种慢病毒构建体含有bfp转录报告物。在初始t细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。在图8a中，左小图示出了通过抗myc标签染色测量的不同受体的相对表达(y轴)与报告物构建体标记物表达(x轴)的关系，而右小图代表了在双阳性细胞中tmd突变体变体的受体表达的mfi量化。在图8b中，将表达抗cd19受体的t细胞与对照cd19(-)k562细胞或对照cd19( )k562细胞以1:1的比率共培养。随后使用fortessa x-50测量诱导型bfp报告基因的转录激活。左小图示出了激活概况的流式图。右小图代表绘制为线图的bfp％。
32.图9示意性地概括用于铰链-notch构建体中的跨膜结构域(tmd)和sts结构域的突变分析的实验的结果。在此实施例中使用四种类型的示例性铰链notch受体，所有这些都包含抗cd19 scfv结构域、截短的cd8铰链结构域和gal4vp64结构域，加上不同的tmd结构域(clstn1 tmd或clstn2 tmd)和不同的sts结构域(clstn1 sts、clstn2 sts或notch1 sts)。将原代人cd4 t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabeads(gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有所指示的tmd/sts组合的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物及组成型表达的抗alppl2 car。在初始t细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。对于测试，将1x105个表达受体的双阳性t细胞与以下共培养：1x105个k562细胞(
“‑
car”组，蓝色)或1x105个cd19 k562细胞(
“‑
car”组，红色)。类似地，在car活性的存在下通过与以下共培养来测试1x105个表达受体的双阳性t
细胞：1x105个alppl2 k562细胞(“ car”组，蓝色)或1x105个alppl2 cd19 k562细胞(“ car”组，红色)。随后使用fortessa x-50(bd biosciences)测量诱导型bfp报告基因的转录激活。
具体实施方式
33.本公开文本总体上尤其涉及含有具有至少一个γ-分泌酶位点的异源跨膜结构域的新型嵌合notch受体。这些受体在自然界中不存在。如下文所述，本公开文本的嵌合多肽可以是合成多肽，或者可以被工程化、设计或修饰以提供期望的和/或改进的特性，例如，调节转录。如下文更详细地描述，tmd的切割是由notch型受体介导的信号传导中的必需步骤。不受任何具体理论束缚，认为对tmd切割的调节有利于本文所公开的受体的优化和/或改进，这又可能在调节细胞活性(例如，激活或抑制选定的生物合成通路中和/或治疗健康状况或疾病中特别有用。在一些实施方案中，本文所公开的受体结合靶细胞表面展示的配体，从而触发所述受体的蛋白水解切割以及调节细胞中的定制转录程序的转录调控因子的释放。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、经所述核酸遗传修饰的宿主细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗各种健康状况或疾病如癌症的方法。
34.在以下具体实施方式中，参考形成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另外指出，否则类似的符号通常标识类似的组分。在具体实施方式、附图和权利要求中描述的说明性替换方案不意为是限制性的。在不脱离在此呈现的主题的精神或范围的情况下，可以使用其他替代方案并且可以进行其他改变。将容易理解的是，如在本文总体上描述的以及在附图中展示的方面可以以各种各样的不同配置来布置、取代、组合和设计，所有这些都被明确地考虑并构成本技术的一部分。定义
35.除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。本文中使用“a和/或b”来包括所有的以下替代形式：“a”、“b”、“a或b”以及“a和b”。
36.如本文可互换使用的术语“施用(administration)”和“施用(administering)”是指通过施用途径递送组合物或配制品，所述施用途径包括但不限于静脉内、动脉内、大脑内、鞘内、肌内、腹膜内、皮下、肌内及其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。
37.术语“宿主细胞”和“重组细胞”在本文中可互换使用。应理解，这样的术语以及“细胞”、“细胞培养物”、“细胞系”不仅是指特定受试细胞或细胞系，还是指这样的细胞或细胞系的后代或潜在后代，不考虑转移次数。应理解，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响而在后代中发生，这样的后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在如本文所用的所述术语的范围内，只要所述后代保留与原始细胞或细胞系相同的功能性即可。
38.如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许所述元件以它们的预期方式来操作。
39.术语“异源的”是指核酸构建体或嵌合多肽中彼此可操作地连接或以其他方式接
合的核酸序列或氨基酸序列，所述序列在自然界中彼此没有可操作地连接或者不相邻。
40.在两个或更多个核酸或蛋白质的上下文中，如本文所用的术语“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，约60％序列同一性、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)，如使用采用如下所述的默认参数的blast或blast 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量。参见例如，ncbi网站ncbi.nlm.nih.gov/blast。此定义也指或可能应用于测试序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的序列。可以在长度为至少约20个氨基酸或核苷酸的区域上，或在长度为10-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或在给定序列的整个长度上计算序列同一性。序列同一性可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序如gcs程序包(devereux等人,nucleic acids res(1984)12:387)、blastp、blastn、fasta(atschul等人,j mol biol(1990)215:403)来计算。可以使用序列分析软件以所述软件的默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如university of wisconsin biotechnology center(威斯康星州麦迪逊，大学大道1710号，53705)的genetics computer group的序列分析软件包
41.如本文所用，并且除非另有说明，否则药剂的“治疗有效量”是足以在治疗或管理癌症方面提供治疗益处或者延迟或最小化与癌症相关的一种或多种症状的量。治疗有效量的化合物是指单独或与其他治疗剂组合的一定量的治疗剂，其在治疗或管理癌症方面提供治疗益处。术语“治疗有效量”可以涵盖改善癌症的整体疗法、减轻或避免癌症的症状或原因、或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以称为“治疗有效量”。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或一种或多种症状的消除。组合物的确切量(包括“治疗有效量”)将取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见例如，lieberman,pharmaceutical dosage forms(第1-3卷,2010)；lloyd,the art,science and technology of pharmaceutical compounding(2016)；pickar,dosage calculations(2012)；以及remington:the science and practice of pharmacy,第22版,2012,gennaro编辑,lippincott,williams&wilkins)。
42.如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人个体)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”可以是在医生的护理下的患者。因此，所述受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目标疾病(例如癌症)和/或所述疾病的一种或多种症状的人患者或个体。所述受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为具有目的病症的风险的个体。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物(例如，啮齿动物，例如小鼠)和非哺乳动物(如非人灵长类动物)，例如绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
43.在提供了一系列值时，应理解的是每个中间值，到下限的第十个单位(除非上下文另外明确指出)，所述范围的上限与下限之间以及任何其他陈述的或在所述陈述范围内的中间值均被涵盖在本公开文本之内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在更小范围之内，并且也被涵盖在本公开文本之内，服从于陈述的范围内的任何确切排除的界限。当陈述的范围包括一个或两个界限时，排除那些包括的界限中的任一个或两个的范围也包括在本公开文本中。
44.本文公开的所有范围还涵盖任何且所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围均可以识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样如本领域技术人员将理解的，如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有言辞都包括所列举的数字并且涉及随后可以分解为如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组等等。
45.应了解，为明确起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征还可以分开地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种组合均单独地和明确地公开一样。此外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地涵盖在本公开文本中并且在本文中公开如同每个和每一种这样的子组合均单独地和明确地在本文中公开一样。notch受体
46.notch受体是众多种细胞系统所必需的高度保守的单次跨膜蛋白，并且其失调与多种发育障碍和恶性肿瘤相关。notch受体通常在与相邻细胞上表达的表面结合的配体结合后传递送号。notch信号依赖于细胞间接触。脊椎动物和无脊椎动物的进化趋异伴随notch谱系中的至少两轮基因重复：苍蝇具有单一notch基因，蠕虫具有两个(glp-1和lin-12)，并且哺乳动物具有四个(notch1-4)。notch信号的转导依赖于三个关键事件：(i)配体识别；(ii)配体依赖性切割位点的构象暴露，以及之后核归巢胞内结构域的切割和释放；以及(iii)核转录激活复合物的组装。
47.规范的notch信号通过调控的膜内蛋白水解来转导。在细胞表面上，notch受体通常维持静止的蛋白水解抗性构象，但是配体结合启动蛋白水解级联，从而从膜释放icd。关键的调控的切割步骤通过一种或多种adam金属蛋白酶来实现，发生在紧邻质膜外部的称为s2的位点处，并且导致截短的受体。这种截短的受体保持膜栓系直至其在一个或多个位点(称为“s3”)处被γ-分泌酶(一种多蛋白酶复合物)切割。
48.在s3处的γ-分泌酶切割后，icd进入细胞核，在其中icd组装含有dna结合转录因子的转录激活复合物并接合另外的辅激活物蛋白如p300，以募集基础转录机构并激活下游靶基因的表达。
49.notch受体具有模块结构域组织。notch受体的胞外域由负责配体结合的一系列n末端表皮生长因子(egf)样重复组成。这些egf重复的o连接糖基化(包括由o-岩藻糖、fringe和rumi糖基转移酶修饰)还调节notch受体响应脊椎动物和无脊椎动物中不同配体亚型的活性。
50.在egf重复之后是三个lin-12/notch重复(lnr)模块，它们是notch受体特有的，并被广泛报道参与防止受体过早激活。通过弗林蛋白酶切割notch1的异二聚化(hd)结构域，使得其n末端部分终止胞外亚基，并且其c末端部分构成tmd亚基的开端，从而得到通过非共价相互作用保持结合在一起的异二聚体。在胞外区域之后，受体具有跨膜区段和胞内结构
域(icd)，其包括转录调控因子。关于notch受体和notch介导的细胞信号传导的另外的信息可以参见例如以下文献：w.r.gordon等人,dev cell(2015)33:729-36和w.r.gordon等人,j.cell sci.(2008)121:3109-19，两个文献通过引用特此并入。本公开文本的组合物
51.如下文更详细描述的，本公开文本提供了一种新类别的嵌合多肽受体，所述嵌合多肽受体被工程化为以配体依赖性方式调节转录调控，具有优于现有合成notch受体的多种优点。例如，用异源tmd替代tmd提供具有多种改进的表达特征的新受体，从而扩大可用于细胞工程师可用的可用受体的范围。此外，在本文所公开的嵌合多肽和受体的一些实施方案中，通过省略notch/synnotch调控区或者整个nec亚基，可以使编码本文所提供的嵌合受体的多核苷酸小于synnotch编码多核苷酸，从而使得能够使用具有更优先的容量但在其他方面具有更合意的特征的载体，或者能够包括原本由于与载体容量相关的大小约束而被排除的另外的元件。
52.本领域技术人员将理解，本文所公开的嵌合多肽受体促进在某些特定细胞和环境背景下增强的激活。这种类型的受体活性反馈是新的特征，其可以用于增强和调谐由工程化的细胞实现的治疗有效载荷的表达。另外，如下文更详细地描述，本文所公开的多种受体变体以高于现有synnotch受体的速率来表达。
53.另外，如下文更详细地描述，本文所公开的嵌合多肽受体具有与现有synnotch受体相比改进的活性，并且提供更具模块性的工程化平台。现有synnotch受体可以用配体结合结构域如scfv和纳米抗体工程化，但是难以将来自受体/配体的天然胞外结构域用于synnotch受体。相比之下，本公开文本的第二代notch受体适合于用其他类型的配体结合结构域(不仅衍生自抗体的那些)取代notch ecd，从而扩大了可靶向疾病和组织的范围。
54.如本文实施例中所述，已经在原代人t细胞中测试并验证嵌合多肽受体。不受任何具体理论束缚，考虑这些新受体在小鼠模型中以及在其他哺乳动物细胞中显示类似的表现。本文公开的受体可以被工程化到各种免疫细胞类型中以增强肿瘤的辨别和消除，或工程化到工程化的细胞中以控制自身免疫和组织再生。因此，工程化的细胞如被工程化为表达本文公开的嵌合受体中的一种或多种的免疫细胞也在本公开文本的范围内。嵌合多肽
55.在一个方面，本文提供多种新型的非天然存在的嵌合多肽，其被工程化为以配体依赖性方式调节转录调控。这些新受体包含具有至少一个γ-分泌酶位点的异源tmd。因为notch跨膜结构域的切割是notch受体功能中的必需步骤，认为notch tmd切割的调节有利于本文所公开的新嵌合受体的优化和/或改进，这又在调节细胞活性中和/或治疗健康状况例如疾病中是有用的。在一些实施方案中，本文所提供的受体结合靶细胞表面展示的配体，从而触发所述受体的蛋白水解切割并释放调节细胞中的定制转录程序的转录调控因子。
56.在一些实施方案中，本文提供一种嵌合多肽，其从n末端到c末端包括：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外结合结构域；(b)连接序列，其具有：(i)与notch jmd的至少约80％序列同一性；(ii)与notch jmd的至少约80％序列同一性，其中notch受体的lnr和/或hd已经缺失；(iii)与多肽铰链结构域的至少约80％序列同一性；(iv)与包括至少一个纤连蛋白(fn)重复的robo1 jmd的至少约80％序列同一性；或者(v)具有约2至约40个氨基酸的多肽；(c)与1型跨膜受体的跨膜结构域具有至少约80％序列同一性并且包含一个或多个
配体诱导型蛋白水解切割位点的tmd；以及(d)包含转录调控因子的icd，其中所述选定的配体与所述胞外结合结构域的结合诱导在所述转录调控因子与所述连接序列之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中(i)在所述连接序列与notch jmd或其中notch受体的lnr和/或hd已经缺失的notch jmd具有至少约80％序列同一性时，所述跨膜结构域对于所述连接序列是异源的，并且(ii)在所述连接序列与notch jmd或其中notch受体的lnr和/或hd已经缺失的notch jmd不具有至少约80％序列同一性时，所述跨膜结构域不是notch1跨膜结构域。胞外结构域(ecd)
57.在一些实施方案中，本文所公开的嵌合多肽受体的ecd具有对一种或多种靶配体的结合亲和力。原则上，关于可以由本文所提供的嵌合多肽靶向的合适的配体没有特别限制。在一些实施方案中，靶配体是细胞表面配体。合适的细胞表面配体的非限制性例子包括细胞表面受体；粘附蛋白；表面结合的碳水化合物、脂质、糖脂、脂蛋白和脂多糖；整合素；粘蛋白；以及凝集素。在一些实施方案中，所述配体是蛋白质。在一些实施方案中，所述配体是碳水化合物。在一些实施方案中，所述配体是分化簇(cd)标记物。在一些实施方案中，所述cd标记物选自cd1、cd1a、cd1b、cd1c、cd1d、cd1e、cd2、cd3d、cd3e、cd3g、cd4、cd5、cd7、cd8a、cd8b、cd19、cd20、cd21、cd22、cd23、cd25、cd27、cd28、cd33、cd34、cd40、cd45、cd48、cd52、cd59、cd66、cd70、cd71、cd72、cd73、cd79a、cd79b、cd80(b7.1)、cd86(b7.2)、cd94、cd95、cd134、cd140(pdgfr4)、cd152、cd154、cd158、cd178、cd181(cxcr1)、cd182(cxcr2)、cd183(cxcr3)、cd210、cd246、cd252、cd253、cd261、cd262、cd273(pd-l2)、cd274(pd-l1)、cd276(b7h3)、cd279、cd295、cd339(jag1)、cd340(her2)、egfr、fgfr2、cea、afp、ca125、muc-1、mage、bcma(cd269)、alppl2、gfp、egfp和sirpα。
58.在一些实施方案中，所述胞外结构域包含受体的配体结合部分。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含结合至一种或多种靶抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含抗体或其功能性抗原结合片段的一种或多种抗原结合决定簇。本领域技术人员在阅读本公开文本后将易于理解，术语“其功能片段”或“其功能变体”是指与衍生出所述片段或变体的野生型分子具有共同的生物活性的分子。例如，抗体的功能片段或功能变体是这样的，其保留与衍生所述功能片段或功能变体的抗体基本上相同的结合至相同表位的能力。例如，能够与细胞表面受体的表位结合的抗体可以在n末端和/或c末端处被截短，并且使用本领域技术人员已知的测定来评估其表位结合活性的保留。在一些实施方案中，抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体、或微型抗体、f(ab’)2片段、fab片段、单链可变片段(scfv)和单结构域抗体(sdab)或其功能片段。在一些实施方案中，所述抗原结合部分包含scfv。
59.抗原结合部分可以包括天然存在的氨基酸序列，或者可以被工程化、设计或修饰以提供期望和/或改进的特性，例如，结合亲和力。通常，抗原结合部分(例如，抗体)对靶抗原(例如，cd19抗原)的结合亲和力可以通过frankel等人,mol immunol(1979)16:101-06所述的scatchard方法来计算。在一些实施方案中，通过抗原/抗体解离速率测量结合亲和力。在一些实施方案中，通过竞争放射免疫测定测量结合亲和力。在一些实施方案中，通过elisa测量结合亲和力。在一些实施方案中，通过流式细胞术测量抗体亲和力。“选择性结合”抗原(如cd19)的抗体是以高亲和力结合所述抗原并且不会明显结合其他无关抗原的抗
原结合部分。
60.技术人员可以基于被遗传修饰以表达本公开文本的嵌合多肽或合成notch受体的细胞的期望定位或功能来选择胞外结构域。例如，胞外结构域可以被选择为将受体表达细胞靶向至雌激素依赖性乳腺癌细胞。在一些实施方案中，所公开的嵌合多肽notch受体的胞外结构域能够结合肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa)。本领域技术人员将理解，taa包括存在于肿瘤细胞上和正常细胞的子群体上，或者存在于许多正常细胞上但浓度远低于在肿瘤细胞上的分子(如例如，蛋白质)。例子包括但不限于cea、afp、her2、ctag1b和magea1。相比之下，tsa通常包括存在于肿瘤细胞上但不在正常细胞上表达的分子(如例如，蛋白质)。例子包括但不限于肿瘤病毒抗原和突变的蛋白质(也称为新生抗原)。
61.在一些情形中，抗原结合部分对肿瘤细胞表达的抗原(即，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原)中存在的表位具有特异性。肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原可以是与以下相关的抗原：例如，乳腺癌细胞、b细胞淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤、肺癌细胞、非霍奇金b细胞淋巴瘤(b-nhl)细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、间皮瘤细胞、黑色素瘤细胞、慢性淋巴细胞性白血病细胞、急性淋巴细胞性白血病细胞、神经母细胞瘤细胞、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌细胞等。还将理解，肿瘤相关抗原也可以由非癌细胞表达。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域对存在于组织特异性抗原中的表位具有特异性。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域对存在于疾病相关抗原中的表位具有特异性。
62.通常，关于可以由本文所公开的嵌合多肽受体靶向的合适的表面抗原没有特别限制。合适的靶抗原的非限制性例子包括cd19、b7h3(cd276)、bcma(cd269)、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(alppl2)、绿色荧光蛋白(gfp)、增强型绿色荧光蛋白(egfp)、信号调节蛋白α(sirpα)、cd123、cd171、cd179a、cd20、cd213a2、cd22、cd24、cd246、cd272、cd30、cd33、cd38、cd44v6、cd46、cd71、cd97、cea、cldn6、clecl1、cs-1、egfr、egfrviii、elf2m、epcam、epha2、肝配蛋白b2、fap、flt3、gd2、gd3、gm3、gprc5d、her2(erbb2/neu)、igll1、il-11ra、kit(cd117)、muc1、ncam、pap、pdgfr-β、prss21、psca、psma、ror1、ssea-4、tag72、tem1/cd248、tem7r、tshr、vegfr2、alpi、瓜氨酸化波形蛋白、cmet和axl。
63.在一些实施方案中，靶抗原选自cd19、b7h3(cd276)、bcma(cd269)、cd123、cd171、cd179a、cd20、cd213a2、cd22、cd24、cd246、cd272、cd30、cd33、cd38、cd44v6、cd46、cd71、cd97、cea、cldn6、clecl1、cs-1、egfr、egfrviii、elf2m、epcam、epha2、肝配蛋白b2、fap、flt3、gd2、gd3、gm3、gprc5d、her2(erbb2/neu)、igll1、il-11ra、kit(cd117)、muc1、ncam、pap、pdgfr-β、prss21、psca、psma、ror1、ssea-4、tag72、tem1/cd248、tem7r、tshr、vegfr2、alpi、瓜氨酸化波形蛋白、cmet、axl、gpc2、人表皮生长因子受体2(her2/neu)、cd276(b7-h3)、il-13rα1、il-13rα2、α-甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、癌症抗原-125(ca-125)、ca19-9、钙视网膜蛋白、muc-1、上皮膜蛋白(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、cd34、cd45、cd123、cd93、cd99、cd117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病液蛋白(gcdfp-15)、alk、dlk1、fap、ny-eso、wt1、hmb-45抗原、蛋白质黑色素-a(由t淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；mart-1)、myo-d1、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、aoc3(vap-1)、cam-3001、ccl11(嗜酸性粒细胞
趋化因子-1)、cd125、cd147(basigin)、cd154(cd40l)、cd2、cd20、cd23(ige受体)、cd25(il-2受体的链)、cd3、cd4、cd5、ifn-α、ifn-γ、ige、ige fc区、il-1、il-12、il-23、il-13、il-17、il-17a、il-22、il-4、il-5、il-5、il-6、il-6受体、整合素α4、整合素α4β7、lfa-1(cd11α)、肌生成抑制蛋白、ox-40、硬化蛋白、sost、tgfβ1、tnf-α、vegf-a、丙酮酸激酶同工酶m2型(肿瘤m2-pk)、cd20、cd5、cd7、cd3、trbc1、trbc2、cd38、cd123、cd93、cd34、cd1a、slamf7/cs1、flt3、cd33、cd123、talla-1、cspg4、dll3、κ轻链、λ轻链、cd16/fcγriii、cd64、fitc、cd22、cd27、cd30、cd70、gd2(神经节苷脂g2)、gd3、egfrviii(表皮生长因子变体iii)、egfr及其同种变体、tem-8、精子蛋白17(sp17)、间皮素。
64.合适的抗原的其他非限制性例子包括pap(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(psca)、prostein、nkg2d、tarp(t细胞受体γ交替阅读框蛋白)、trp-p8、steap1(前列腺六跨膜上皮抗原1)、异常ras蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(cd61)、催乳素、k-ras(v-ki-ras2 kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)、ral-b、gpc2、cd276(b7-h3)或il-13rα。在一些实施方案中，所述抗原是her2。在一些实施方案中，所述抗原是alppl2。在一些实施方案中，所述抗原是bcma。在一些实施方案中，所述ecd的抗原结合部分对报告蛋白如gfp和egfp具有特异性。这种抗原结合部分的非限制性例子包括lag17抗gfp纳米抗体。在一些实施方案中，所述ecd的抗原结合部分包含抗bcma完全人源化vh结构域(fhvh)。在一些实施方案中，所述抗原是信号调节蛋白α(sirpα)。
65.可能适合于本文所公开的嵌合多肽受体的另外的抗原包括但不限于gpc2、人表皮生长因子受体2(her2/neu)、cd276(b7-h3)、il-13rα1、il-13rα2、α-甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、癌症抗原-125(ca-125)、ca19-9、钙视网膜蛋白、muc-1、上皮膜蛋白(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)。其他合适的靶抗原包括但不限于酪氨酸酶、黑色素瘤相关抗原(mage)、cd34、cd45、cd123、cd93、cd99、cd117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、结蛋白、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病液体蛋白(gcdfp-15)、alk、dlk1、fap、ny-eso、wt1、hmb-45抗原、蛋白质黑色素-a(t淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；mart-1)、myo-d1、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触小泡蛋白、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1。
66.另外的合适的抗原包括但不限于与炎性疾病相关的那些，如aoc3(vap-1)、cam-3001、ccl11(嗜酸性粒细胞趋化因子-1)、cd125、cd147(basigin)、cd154(cd40l)、cd2、cd20、cd23(ige受体)、cd25(异二聚il-2受体的一个亚基)、cd3、cd4、cd5、ifnα、ifnγ、ige、ige fc区、il-1、il-12、il-23、il-13、il-17、il-17a、il-22、il-4、il-5、il-5、il-6、il-6受体、整合素α4、整合素α4β7、lfa-1(cd11α)、肌生成抑制蛋白、ox-40、硬化蛋白、sost、tgfβ1、tnfα和vegf-a。
67.适合于本文所公开的嵌合多肽和合成notch受体的其他抗原包括但不限于丙酮酸激酶同工酶m2型(肿瘤m2-pk)、cd20、cd5、cd7、cd3、trbc1、trbc2、bcma、cd38、cd123、cd93、cd34、cd1a、slamf7/cs1、flt3、cd33、cd123、talla-1、cspg4、dll3、κ轻链、λ轻链、cd16/fcγriii、cd64、fitc、cd22、cd27、cd30、cd70、gd2(神经节苷脂g2)、gd3、egfrviii(表皮生长因子变体iii)、egfr及其同种变体、tem-8、精子蛋白17(sp17)、间皮素。合适的抗原的其他非限制性例子包括pap(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺干细胞抗原(psca)、prostein、nkg2d、tarp(t细胞受体γ交替阅读框蛋白)、trp-p8、steap1(前列腺六跨膜上皮抗原-1)、异常ras
蛋白、异常p53蛋白、整合素β3(cd61)、催乳素、k-ras(v-ki-ras2 kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因)和ral-b。在一些实施方案中，抗原是alppl2。在一些实施方案中，所述抗原是bcma。在一些实施方案中，所述ecd的抗原结合部分对报告蛋白如gfp和egfp具有特异性。这种抗原结合部分的非限制性例子包括lag17抗gfp纳米抗体。在一些实施方案中，所述ecd的抗原结合部分包含抗bcma完全人源化vh结构域(fhvh)。在一些实施方案中，所述抗原是信号调节蛋白α(sirpα)。
68.在一些实施方案中，适合于由本文所公开的嵌合多肽和嵌合受体靶向的抗原包括衍生自病原体的配体。例如，所述抗原可以是由her2阳性乳腺癌细胞产生的her2。在一些实施方案中，所述抗原可以是在b细胞白血病上表达的cd19。在一些实施方案中，所述抗原可以是在多形性胶质母细胞瘤(gbm)上表达但在健康cns组织上表达少得多的egfr。在一些实施方案中，所述抗原可以是与成人癌症例如结肠癌相关的cea。
69.在一些实施方案中，胞外结构域的抗原结合部分对细胞表面靶标具有特异性，其中细胞表面靶标的非限制性例子包括cd19、cd30、her2、cd22、enpp3、egfr、cd20、cd52、cd11α和α-整合素。在一些实施方案中，本文所公开的嵌合多肽和合成notch受体包括具有结合cd19、cea、her2、muc1、cd20、alppl2、bcma或egfr的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，本文所提供的嵌合多肽包括包含结合alppl2的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，本文所提供的嵌合多肽包括包含结合bcma的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，本文所提供的嵌合多肽包括包含结合her2的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，本文所公开的嵌合多肽和合成notch受体包括包含结合cd19、alppl2、bcma或her2的抗原结合部分的胞外结构域。在一些实施方案中，抗原结合部分包括与序列表中的seq id no:95具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包括与seq id no:95具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包括与seq id no:95具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包括与seq id no:95具有100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原结合部分包括seq id no:5的氨基酸序列，其中seq id no:95中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。连接序列/jmd
70.如上所述，本公开文本的嵌合多肽和受体包括设置在胞外配体结合结构域(ecd)与tmd之间的连接多肽序列。
71.在一些实施方案中，使用包括nrr和hd的notch jmd作为连接多肽。在一些实施方案中，嵌合受体的连接多肽与notch近膜结构域(jmd)具有至少约80％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，所公开的嵌合受体的连接多肽与其中notch受体的lnr和/或hd已经缺失的notch jmd具有至少约80％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，嵌合受体的连接多肽与多肽铰链结构域具有至少约80％氨基酸序列同一性。
72.在一些实施方案中，将robo(roundabout)细胞表面受体的一个或多个结构域并入本公开文本的嵌合受体的连接多肽中。在配体诱导的通过adam10 mmp和γ-分泌酶对受体胞外部分的切割之后，robo受体以与notch类似的方式释放核转录因子结构域。然而，robo不含lin/notch结构域、egf样重复或hd结构域。另外，robo的主要配体是可溶蛋白(slit)。
哺乳动物具有四种robo受体：robo1-3具有五个免疫球蛋白样(ig)结构域、三个纤连蛋白(fn)重复以及与胞内结构域连接的跨膜结构域。robo4仅具有两个ig结构域和两个fn结构域。这个方面的另外的信息可以发现于例如h.blockus等人,development(2016)143:3037-44中，其通过引用特此并入。
73.在一些实施方案中，如本文所公开的嵌合受体的连接多肽包括衍生自robo受体的至少一个纤连蛋白(fn)重复。所公开的嵌合受体的连接多肽可以含有1、2、3、4或5个fn重复。在一些实施方案中，嵌合受体的连接多肽包括约1至约5个fn重复、约1至约3个fn重复或者约2至约3个fn重复。在一些实施方案中，嵌合受体的连接多肽与包括至少一个纤连蛋白重复的robo1 jmd具有至少约80％氨基酸序列同一性。
74.在一些实施方案中，嵌合受体的连接多肽具有长度为约4至约40个氨基酸残基(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸残基)的多肽序列。在一些实施方案中，可以优化连接多肽的长度和氨基酸组成以改变ecd和tmd相对于彼此的取向和/或接近度，以实现本公开文本的嵌合多肽的期望活性。在一些实施方案中，嵌合受体的连接多肽具有长度为约4至约40、约5至约30、约10至约20、约10至约30、约10至约40、约5至约20、约5至约40或约20至约40个氨基酸残基的多肽序列。
75.在一些实施方案中，连接多肽包含与序列表中的seq id no:97-99或138-148中所示的序列具有至少约80％序列同一性(如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或约99％序列同一性)的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，连接多肽包含与seq id no:97-99或138-148中所示的序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，连接多肽包含与seq id no:97-99或138-148中所示的序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，连接多肽包含与seq id no:97-99或138-148中所示的序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，连接多肽包含与seq id no:97-99或138-148中所示的序列具有约100％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，连接多肽包含选自seq id no:97-99或138-148的氨基酸序列或由其组成，其中seq id no:97-99和138-148中的任一个的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。跨膜结构域(tmd)
76.如上所述，本公开文本的嵌合受体包括与1型跨膜受体的tmd具有至少约80％序列同一性并且包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域。
77.notch受体中的蛋白水解切割位点(例如，s2或s3)的例子如上所述。适合于本文所公开的组合物和方法的另外的蛋白水解切割位点包括但不限于选自以下的基质金属蛋白酶(mmp)的金属蛋白酶切割位点：胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3(mmp-1、mmp-8和mmp-13)、明胶酶a和明胶酶b(mmp-2和mmp-9)、溶基质蛋白酶1、溶基质蛋白酶2和溶基质蛋白酶3(mmp-3、mmp-10和mmp-11)、基质溶解因子(mmp-7)以及膜金属蛋白酶(mt1-mmp和mt2-mmp)。例如，mmp-9的切割序列是pro-x-x-hy(其中，x表示任意残基；hy表示疏水残基，如leu、ile、val、phe、trp、tyr、val、met和pro)(seq id no:103)，例如，pro-x-x-hy-(ser/thr)(seq id no:104)，例如，pro-leu/gln-gly-met-thr-ser(seq id no:105)或pro-leu/gln-gly-met-thr(seq id no:106)。合适的蛋白酶切割位点的另一个例子是血纤蛋白溶解酶原激活物切
割位点，例如，尿激酶血纤蛋白溶解酶原激活物(upa)或组织血纤蛋白溶解酶原激活物(tpa)切割位点。合适的蛋白酶切割位点的另一个例子是催乳素切割位点。upa和tpa的切割序列的具体例子包括包含val-gly-arg的序列(seq id no:107)。蛋白水解可切割接头中可以包括的蛋白酶切割位点的另一个例子是烟草蚀纹病毒(tev)蛋白酶切割位点，例如，glu-asn-leu-tyr-thr-gln-ser(seq id no:108)，其中所述蛋白酶在谷氨酰胺与丝氨酸之间切割。蛋白水解可切割接头中可以包括的蛋白酶切割位点的另一个例子是肠激酶切割位点，例如，asp-asp-asp-asp-lys(seq id no:109)，其中切割发生在赖氨酸残基之后。蛋白水解可切割接头中可以包括的蛋白酶切割位点的另一个例子是凝血酶切割位点，例如，leu-val-pro-arg(seq id no:110)。包含蛋白酶切割位点的另外的合适的接头包括可通过以下蛋白酶切割的序列：prescission
tm
蛋白酶(包含人鼻病毒3c蛋白酶和谷胱甘肽-s-转移酶的融合蛋白)、凝血酶、组织蛋白酶b、eb病毒(epstein-barr virus)蛋白酶、mmp-3(溶基质蛋白酶)、mmp-7(基质溶解因子)、mmp-9；嗜热菌蛋白酶样mmp、基质金属蛋白酶2(mmp-2)、组织蛋白酶l；组织蛋白酶d、基质金属蛋白酶l(mmp-l)、尿激酶型血纤蛋白溶解酶原激活物、膜1型基质金属蛋白酶(mt-mmp)、溶基质蛋白酶3(或mmp-11)、嗜热菌蛋白酶、成纤维细胞胶原酶和溶基质蛋白酶-1、基质金属蛋白酶13(胶原酶-3)、组织型血纤蛋白溶解酶原激活物(tpa)、人前列腺特异性抗原、激肽释放酶(hk3)、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶以及钙蛋白酶(钙激活的中性蛋白酶)。对于其中表达受体的宿主细胞(例如，tev)并非天然的蛋白酶可以用作另一种调控机制，其中在表达或以其他方式提供蛋白酶之前，本公开文本的合成notch受体的激活是降低的。另外，蛋白酶可以是肿瘤相关的或疾病相关的(表达程度显著高于在正常组织中的表达程度)，并且作为独立的调控机制。例如，一些基质金属蛋白酶在某些癌症类型中高度表达。
78.通常，适合于本文所公开的嵌合受体的tmd可以是包含至少一个γ-分泌酶切割位点的1型跨膜受体的任何跨膜结构域。γ-分泌酶复合物以及其底物蛋白(包括淀粉样前体蛋白(app)和notch)的结构和功能的详细描述可以例如参见zhang等人,frontiers cell neurosci(2014)的近期综述。来自1型跨膜受体的非限制性的合适的tmd包括来自以下的那些：clstn1、clstn2、aplp1、aplp2、lrp8、app、btc、tgbr3、spn、cd44、csf1r、cxcl16、cx3cl1、dcc、dll1、dsg2、dag1、cdh1、epcam、epha4、ephb2、efnb1、efnb2、erbb4、ghr、hla-a和ifnar2，其中所述tmd包括至少一个γ-分泌酶切割位点。适合于本文所述的组合物和方法的另外的tmd包括但不限于来自以下1型跨膜受体的跨膜结构域：il1r1、il1r2、il6r、insr、ern1、ern2、jag2、kcne1、kcne2、kcne3、kcne4、kl、chl1、ptprf、scn1b、scn3b、npr3、ngfr、plxdc2、pam、ager、robo1、sorcs3、sorcs1、sorl1、sdc1、sdc2、spn、tyr、tyrp1、dct、vasn、flt1、cdh5、pkhd1、nectin1、pcdhgc3、nrg1、lrp1b、cdh2、nrg2、ptprk、scn2b、nradd和ptprm。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽或notch受体的tmd是衍生自钙同线蛋白家族成员如阿卡德因(alcadein)α和阿卡德因γ的tmd。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽或notch受体的tmd是衍生自不同notch受体的tmd。例如，在基于人notch1的合成notch受体中，notch1 tmd可以被人notch2 tmd、人notch3 tmd、人notch4 tmd或来自非人动物(如斑马鱼(danio rerio)、黑腹果蝇(drosophila melanogaster)、光滑爪蟾(xenopus laevis)或原鸡(gallus gallus))的notch tmd取代。
79.因此，在一些实施方案中，跨膜结构域包括展现与多肽序列的至少70％、至少
75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽序列与包含γ-分泌酶切割位点的来自1型跨膜受体的跨膜结构域具有至少约70％序列同一性。在一些实施方案中，跨膜结构域包括展现与包含γ-分泌酶切割位点的来自1型跨膜受体的跨膜结构域的至少70％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包括展现与包含γ-分泌酶切割位点的来自1型跨膜受体的跨膜结构域的至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包括展现与包含γ-分泌酶切割位点的来自1型跨膜受体的跨膜结构域的至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包括展现与包含γ-分泌酶切割位点的来自1型跨膜受体的跨膜结构域的至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，1型跨膜受体选自clstn1、clstn2、aplp1、aplp2、lrp8、app、btc、tgbr3、spn、cd44、csf1r、cxcl16、cx3cl1、dcc、dll1、dsg2、dag1、cdh1、epcam、epha4、ephb2、efnb1、efnb2、erbb4、ghr、hla-a、ifnar2、il1r1、il1r2、il6r、insr、ern1、ern2、jag2、kcne1、kcne2、kcne3、kcne4、kl、chl1、ptprf、scn1b、scn3b、npr3、ngfr、plxdc2、pam、ager、robo1、sorcs3、sorcs1、sorl1、sdc1、sdc2、spn、tyr、tyrp1、dct、vasn、flt1、cdh5、pkhd1、nectin1、pcdhgc3、nrg1、lrp1b、cdh2、nrg2、ptprk、scn2b、nradd和ptprm。在一些实施方案中，tmd包括展现与序列表中的seq id no:1-94中的任一个的至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包括与seq id no:1-94具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包括与seq id no:1-94具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包括与seq id no:1-94具有约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，跨膜结构域包括seq id no:1-94的氨基酸序列，其中seq id no:10中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。
80.在一些实施方案中，所述tmd内的一个或多个氨基酸取代包含tmd的“gv”基序内的一个或多个取代。在一些实施方案中，至少一个这样的取代包括取代为丙氨酸。例如，序列fmyvaaaafvllffvgcgvlls(seq id no:57)以及如seq id no:1和2中所示序列中的任一个的一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸残基可以被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，seq id no:57内“gv”基序的位置18和/或19处的氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，seq id no:57的位置18处的甘氨酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，seq id no:57的位置19处的缬氨酸残基被不同的氨基酸残基取代。在一些实施方案中，跨膜结构域包含具有对应于seq id no:57的序列的氨基酸序列，其在对应于seq id no:57的位置18的位置处具有突变，如g18a突变。在一些实施方案中，跨膜结构域包含具有对应于seq id no:57的序列的氨基酸序列，其在对应于seq id no:57的位置19的位置处具有突变，如v19a突变。停止转移序列(sts)
81.在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包括停止转移序列(sts)，其基本上是位于tmd与icd之间的高电荷结构域。不受任何特定理论的约束，设置在tmd与icd之间的这种高电荷结构域防止icd进入膜。原则上，对所述sts的长度和/或氨基酸组成没有特别限制。在一些实施方案中，可以使用包含约1至约40个氨基酸残基(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个氨基酸残基)的任何任意单链肽作为sts。在一些实施方案中，sts包括约1至15、约5至20、约8至25、约10至30、约12至35、约14至40、约5至40、约10至35、约15至30、约20至25、约20至40、约10至30、约4至20或约5至25个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述sts包含约1至10、约5至12、约6至14、约7至18、约8至20、约9至22、约10至24、或约11至26个氨基酸残基。在一些实施方案中，所述sts包含约4至10个残基，如4、5、6、7、8、9至10个氨基酸残基。在一些实施方案中，sts包括与序列表中的seq id no:96、135、136或137具有至少80％序列同一性(如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或99％序列同一性)的序列。在一些实施方案中，sts包括与seq id no:96、135、136或137具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，sts包括与seq id no:96、135、136或137具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，sts包括与seq id no:96、135、136或137具有至少100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，sts包括seq id no:96、135、136或137的氨基酸序列，其中seq id no:96、135、136或137中的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代。
82.在一些实施方案中，所述sts包括与来自notch1、notch2、notch3、notch4、csf1r、cxcl16、dag1、ghr、ptprf、ager、kl、nrg1、lrp1b、jag2、epcam、kcne3、cdh2、nrg2、ptprk、btc、epha3、il1r2或ptprm的sts序列具有至少70％序列同一性，如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，所述sts包含在前4个残基中仅包含lys(k)或arg(r)的序列。在一些实施方案中，所述sts包含一个、两个、三个、四个、五个或更多个碱性残基。在一些实施方案中，所述sts包含五个、四个、三个、两个、一个或零个芳族残基或具有疏水和/或庞大侧链的残基。胞内结构域(icd)
83.本公开文本的嵌合受体还包含含有转录调控因子的胞内结构域(icd)。转录调控因子是生化元件，其用以激活或阻遏启动子驱动的dna序列的转录。适合于本公开文本的组合物和方法的转录调控因子可以是天然存在的转录调控因子，或者可以被工程化、设计或修饰以提供期望的和/或改进的特性，例如，调节转录。在一些实施方案中，转录调控因子直接调控细胞的分化中涉及的一个或多个基因的表达。在一些实施方案中，转录调控因子通过以下方式间接调节细胞的分化中涉及的一个或多个基因的表达：调节第二转录因子的表达，这又调节细胞的分化中涉及的一个或多个基因的表达。技术人员将理解，转录调控因子可以是转录激活物或转录阻遏物。在一些实施方案中，所述转录调控因子是转录阻遏物。在一些实施方案中，所述转录调控因子是转录激活物。在一些实施方案中，所述转录调控因子还可以包含核定位信号。在一些实施方案中，所述转录调控因子选自gal4-vp16、gal4-vp64、tetr-vp64、zfhd1-vp64、gal4-krab和hap1-vp16。在一些实施方案中，所述转录调控因子是gal4-vp64。另外的结构域
84.在一些实施方案中，位于tmd的n末端的胞外结构域还可以包括另外的结构域，例如膜定位信号如cd8α信号、可检测标记物如myc标签或his标签等。在一些实施方案中，嵌合受体还包含一个或多个另外的蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，嵌合受体不包含另
外的蛋白水解切割位点。在一些实施方案中，嵌合受体还包含一个或多个糖基化位点。在一些实施方案中，嵌合受体不包含糖基化位点。在一些实施方案中，嵌合受体不包含用于经由分子间二硫键合促进嵌合多肽的寡聚化的铰链结构域。
85.在一些实施方案中，嵌合受体还包含高度保守的robo细胞表面受体的元件。在一些实施方案中，嵌合受体还包含胞外寡聚化结构域(例如，铰链结构域)以促进嵌合受体的寡聚化(例如，二聚化、三聚化或更高阶多聚物)。在一些实施方案中，所公开的嵌合受体从n末端到c末端包含：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；(b)包含纤连蛋白重复的robo结构域；(c)包括一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的tmd；以及(d)包括转录调控因子的icd，其中所述选定的配体与所述胞外结合结构域的结合诱导所述tmd中的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中所述嵌合多肽不包括notch受体的notch负调控区(nrr)、lnr或hd。
86.在一些实施方案中，铰链结构域包括能够经由分子间二硫键合促进嵌合多肽的寡聚物形成的多肽基序。在一些实施方案中，本文所公开的嵌合受体从n末端到c末端包括：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；(b)能够经由分子间二硫键合促进嵌合多肽的寡聚物形成的铰链结构域；(c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的tmd；以及(d)包含转录调控因子的icd，其中所述选定的配体与所述胞外结合结构域的结合诱导tmd中的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中所述嵌合多肽不包含notch受体的胞外亚基(nec)或notch受体的nrr或hd。
87.本公开文本的嵌合受体可以是任何长度的嵌合多肽，包括如下长度的嵌合多肽：通常在约100个氨基酸(aa)至约1000个aa之间，例如，约100个aa至约200个aa、约150个aa至约250个aa、约200个aa至约300个aa、约250个aa至约350个aa、约300个aa至约400个aa、约350个aa至约450个aa、约400个aa至约500个aa。在一些实施方案中，所公开的嵌合多肽的长度通常在约400个aa至约450个aa之间、约450个aa至约500个aa、约500个aa至约550个aa、约550个aa至约600个aa、约600个aa至约650个aa、约650个aa至约700个aa、约700个aa至约750个aa、约750个aa至约800个aa、约800个aa至约850个aa、约850个aa至约900个aa、约900个aa至约950个aa、或约950个aa至约1000个aa。在一些情形中，本公开文本的嵌合多肽的长度为约300个aa至约400个aa。在一些情形中，本公开文本的嵌合多肽的长度为300个aa至350个aa。在一些情形中，本公开文本的嵌合多肽的长度为300个aa至325个aa。在一些情形中，本公开文本的嵌合多肽的长度为350个aa至400个aa。在一些情形中，本公开文本的嵌合多肽的长度为750个aa至850个aa。
88.在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包括：(a)胞外配体结合结构域；(b)连接多肽，其包括与seq id no:97-99和138-148中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；(c)tmd，其包括与seq id no:1-94中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；(d)sts，其包括与seq id no:95具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；以及(e)包含转录调控因子的icd。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包括：(a)连接多肽，其包括与seq id no:97-99和138-148中的任一个具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；(b)tmd，其包括与seq id no:1-94中的任一个具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及(c)sts，其包括与seq id no:95具有至少
约90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合受体包括：(a)连接序列，其包括与seq id no:97-99和138-148中的任一个具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；(b)跨膜结构域，其包括与seq id no:1-94中的任一个具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；以及(c)sts，其包括与seq id no:95具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。
89.在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽包括与本文所公开的嵌合受体具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽包括与选自seq id no:111-134的序列具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。核酸分子
90.在一个方面，本文所公开的一些实施方案涉及包含编码本公开文本的嵌合多肽和notch受体的核苷酸序列的核酸分子，包括含有这些核酸分子的表达盒和表达载体，所述核酸分子与异源核酸序列可操作地连接，所述异源核酸序列如例如引导所述受体在宿主细胞中的体内表达的调控序列。
91.本公开文本的核酸分子可以是任何长度的核酸分子，包括如下核酸分子：通常在约5kb与约50kb之间，例如在约5kb与约40kb之间、在约5kb与约30kb之间、在约5kb与约20kb之间或在约10kb与约50kb之间，例如在约15kb至30kb之间、在约20kb与约50kb之间、在约20kb与约40kb之间、约5kb与约25kb之间或约30kb与约50kb之间。
92.在一些实施方案中，核酸分子包含编码嵌合受体的核苷酸序列，所述嵌合受体从n末端到c末端包含：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；(b)连接多肽，其具有：(i)与notch jmd的至少约80％序列同一性；(ii)与notch jmd的至少约80％序列同一性，其中notch受体的lnr和/或hd已经缺失；(iii)与多肽铰链结构域的至少约80％序列同一性；(iv)与包括至少一个纤连蛋白(fn)重复的robo1 jmd的至少约80％序列同一性；或者(v)具有约2至约40个氨基酸的多肽；(c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的与1型跨膜受体的跨膜结构域具有至少约80％序列同一性的tmd；以及(d)包含转录调控因子的icd，其中所述选定的配体与所述胞外结合结构域的结合诱导在所述转录调控因子与所述连接序列之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中(i)在连接序列与notch jmd或其中nrr和hd已经缺失的synnotch jmd具有至少约80％序列同一性时，所述tmd对于所述连接序列是异源的，并且(ii)在连接序列与notch jmd或其中nrr和hd已经缺失的notch jmd不具有至少约80％序列同一性时，所述tmd不是notch1 tmd。
93.在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达盒或表达载体中。应理解，表达盒通常包含遗传物质的构建体，所述构建体含有编码序列和足够的调控信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。通常，可以将表达盒插入用于靶向至期望的宿主细胞或组织的载体中和/或个体中。因此，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包含编码嵌合多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列与足以指导所述盒的体内表达的表达控制元件可操作地连接。在一些实施方案中，表达控制元件包括启动子和/或增强子以及任选地能够影响编码序列的转录和/或翻译的其他核酸序列的任一种或组合。
94.在一些实施方案中，所述核苷酸序列被并入表达载体中。本领域技术人员将理解，术语“载体”通常是指设计用于在宿主细胞之间转移的重组多核苷酸构建体，并且其可以用
于转化的目的，例如，将异源dna引入宿主细胞中。这样，在一些实施方案中，所述载体可以是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可以在其中插入另一个dna区段以引起插入区段的复制。在一些实施方案中，所述表达载体可以是整合载体。
95.在一些实施方案中，所述表达载体可以是病毒载体。如本领域技术人员将理解的，术语“病毒载体”广泛用于指包含衍生自病毒的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)或指介导核酸转移的病毒颗粒，所述衍生自病毒的核酸元件通常促进将核酸分子转移或整合到细胞的基因组中。病毒颗粒通常包含各种病毒组分，并且有时除一种或多种核酸外还包含宿主细胞组分。术语病毒载体可以指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒颗粒，或者指转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构性和/或功能性遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构性和功能性遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒的结构和功能遗传元件或其部分(包括ltr)的病毒载体或质粒。
96.在一些实施方案中，重组核酸编码具有与本文所公开的嵌合受体具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，重组核酸编码具有与嵌合多肽具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽，所述嵌合多肽包括与选自seq id no:111-134的序列具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
97.在一些实施方案中，核酸分子编码嵌合多肽，所述嵌合多肽包含：(a)连接多肽，其包括与seq id no:97-99和138-148中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；(b)跨膜结构域，其包括与seq id no:1-94中的任一个具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列；以及(c)sts，其包括与seq id no:95具有至少约80％、90％、95％、96％、97、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子编码嵌合多肽，所述嵌合多肽包含：(a)连接多肽，其包括与seq id no:97-99和138-148中的任一个具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；(b)跨膜结构域，其包括与seq id no:1-94中的任一个具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；以及(c)sts，其包括与seq id no:95具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸分子编码嵌合多肽，所述嵌合多肽包含：(a)连接序列，其包括与seq id no:97-99和138-148中的任一个具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；(b)跨膜结构域，其包括与seq id no:1-94中的任一个具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列；以及(c)sts，其包括与seq id no:95具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。
98.可以针对在目的宿主细胞中的表达优化编码嵌合受体的核酸序列。例如，可以将序列的g-c含量调节至给定细胞宿主的平均水平，如参照宿主细胞中表达的已知基因所计算的。用于密码子优化的方法是本领域已知的。可以优化本文公开的嵌合受体的编码序列内的密码子使用以增强在宿主细胞中的表达，使得编码序列内的密码子的约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或多达100％已针对特定宿主细胞中的表达进行优化。
99.本文公开的一些实施方案涉及载体或表达盒，所述载体或表达盒包含编码本文公开的嵌合受体的重组核酸分子。所述表达盒通常含有编码序列和足够的调控信息以引导编码序列在体内和/或离体的受体细胞中恰当转录和/或翻译。可以将所述表达盒插入用于靶
向期望的宿主细胞的载体中和/或个体中。可以将表达盒插入从能够进行基因组整合或自主复制的包含核酸分子的任何来源衍生的质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、或噬菌体(作为线性或环状的、单链或双链的dna或rna多核苷酸)，其中一个或多个核酸序列已经以功能上操作性的方式连接，即可操作地连接。
100.本文还提供含有编码本文所公开的任何嵌合受体的一种或多种核酸分子的载体、质粒或病毒。所述核酸分子可以包含在载体内，所述载体能够引导所述核酸分子在例如已用所述载体转化/转导的细胞中表达。用于真核细胞和原核细胞的合适载体是本领域已知的，并且是可商购的或容易由技术人员制备的。参见例如，sambrook,j.&russell,d.w.(2012).molecular cloning:a laboratory manual(第4版).cold spring harbor,纽约:cold spring harbor laboratory and sambrook,j.,&russel,d.w.(2001).molecular cloning:a laboratory manual(第3版).cold spring harbor,纽约:cold spring harbor laboratory(本文中合称为“sambrook”)；ausubel,f.m.(1987).current protocols in molecular biology.纽约,纽约州:wiley(包括至2014年的增刊)；bollag,d.m.等人(1996).protein methods.纽约,纽约州:wiley-liss；huang,l.等人(2005).nonviral vectors for gene therapy.圣地亚哥:academic press；kaplitt,m.g.等人(1995).viral vectors:gene therapy and neuroscience applications.圣地亚哥,加利福尼亚州:academic press；lefkovits,i.(1997).the immunology methods manual:the comprehensive sourcebook of techniques.圣地亚哥,加利福尼亚州:academic press；doyle,a.等人(1998).cell and tissue culture:laboratory procedures in biotechnology.纽约,纽约州:wiley；mullis,k.b.,ferr
é
,f.&gibbs,r.(1994).pcr:the polymerase chain reaction.波士顿:birkhauser publisher；greenfield,e.a.(2014).antibodies:a laboratory manual(第2版).纽约,纽约州:cold spring harbor laboratory press；beaucage,s.l.等人(2000).current protocols in nucleic acid chemistry.纽约,纽约州:wiley,(包括至2014年的增刊)；以及makrides,s.c.(2003).gene transfer and expression in mammalian cells.阿姆斯特丹,荷兰:elsevier sciences b.v.，所述文献的公开内容通过引用并入本文。
101.可以经由常规转化或转染技术将dna载体引入真核细胞中。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以发现于sambrook等人(2012，同上)和其他标准分子生物学实验室手册中，如磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载(scrape loading)、弹道引入、核穿孔、流体力学冲击和感染。
102.可以在本公开文本中使用的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(sv40)和牛乳头瘤病毒载体(参见例如，gluzman(编辑),eukaryotic viral vectors,csh laboratory press,cold spring harbor,n.y.)。例如，如本文所公开的嵌合受体可以在真核宿主如哺乳动物细胞(例如，cos细胞、nih 3t3细胞或hela细胞)中产生。这些细胞可以从许多来源获得，包括美国典型菌种保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)。在选择表达系统时，应注意确保组分彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。另外，如果在选择表达系统时需要指导，则技术人员可以查询p.jones,“vectors:cloning applications”,john wiley and sons,new york,n.y.,2009)。
103.所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或者与天然存在的序列不同但是由于遗传密码的简并性而编码相同基因产物的序列。这些核酸分子可以由rna或dna(例如，基因组dna、cdna，或合成dna(如通过基于亚磷酰胺的合成产生的dna))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。此外，核酸分子可以是双链或单链的(例如，包含有义链或反义链)。
104.核酸分子不限于编码多肽(例如，抗体)的序列；也可以包含位于编码序列(例如，嵌合受体的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉用于分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组dna或通过进行聚合酶链式反应(pcr)来生成。在核酸分子是核糖核酸(rna)的情况下，转录物可以例如通过体外转录来产生。重组细胞和细胞培养物
105.可以将本公开文本的核酸引入宿主细胞如人t淋巴细胞中，以产生含有所述核酸分子的重组细胞。因此，本公开文本的一些实施方案涉及用于制备重组细胞的方法，其包括以下步骤：(a)提供能够表达蛋白质的细胞，以及(b)使所提供的细胞与本文所述的任何重组核酸接触。
106.将本公开文本的核酸分子引入细胞中可以通过以下方式来实现：病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(pei)介导的转染、deae-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送等。
107.因此，在一些实施方案中，核酸分子可以通过本领域中已知的病毒或非病毒递送媒介物递送至细胞。例如，核酸分子可以稳定地整合到宿主基因组中、或者可以以附加体复制、或者作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于稳定或瞬时表达。因此，在本文公开的一些实施方案中，所述核酸分子在重组宿主细胞中作为附加体单元被维持和复制。在一些实施方案中，所述核酸分子稳定地整合到所述重组细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典随机基因组重组技术或用更精确的基因组编辑技术来完成，所述基因组编辑技术如使用指导rna引导的crispr/cas(如crispr/cas9)、或dna指导的核酸内切酶基因组编辑ngago(格氏嗜盐碱杆菌(natronobacterium gregoryi)argonaute)、或talen基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。在一些实施方案中，核酸分子作为用于稳定或瞬时表达的微环表达载体存在于重组宿主细胞中。
108.可以将核酸分子包封在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中。例如，可以通过病毒转导实现核酸向细胞中的引入。在非限制性例子中，腺相关病毒(aav)是一种无包膜病毒，其可以被工程化以经由病毒转导将核酸递送至靶细胞。已经描述了若干种aav血清型，并且所有已知的血清型可以感染来自多种不同组织类型的细胞。aav能够在体内转导广泛的物种和组织，没有毒性证据，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫应答。
109.慢病毒系统也适合于经由病毒转导的核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了若干种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)能够感染分裂细胞和非分裂细胞二者；(iii)具有广泛的组织趋性，包括重要的基因和细胞疗法靶细胞类型；(iv)载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，如多顺反子序列或含有内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点
特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和生产的系统。
110.在一些实施方案中，宿主细胞已经用例如包含编码如本文所述的嵌合受体的核酸序列的载体基因工程化(例如，转导、转化或转染)，所述载体是病毒衍生的表达载体或者用于同源重组的载体，其还包含与宿主细胞的基因组的一部分同源的核酸序列。宿主细胞可以是未转化的细胞或者已经用一种或多种核酸分子转染的细胞。
111.在一些实施方案中，所述重组细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，所述细胞被体内转化。在一些实施方案中，所述细胞被离体转化。在一些实施方案中，所述细胞被体外转化。在一些实施方案中，所述重组细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是免疫细胞、神经元、上皮细胞和内皮细胞，或干细胞。在一些实施方案中，所述重组细胞是免疫系统细胞，例如，淋巴细胞(例如，t细胞或nk细胞)或树突细胞。在一些实施方案中，所述免疫细胞是b细胞、单核细胞、自然杀伤细胞(nk)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、调节性t细胞、辅助性t细胞、细胞毒性t细胞或其他t细胞。在一些实施方案中，所述免疫系统细胞是t淋巴细胞。
112.在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述细胞是造血干细胞。在所述细胞的一些实施方案中，所述细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞是前体t细胞或t调节性(treg)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是cd34 细胞、cd8 细胞或cd4 细胞。在一些实施方案中，所述细胞是选自幼稚cd8 t细胞、中枢记忆cd8 t细胞、效应记忆cd8 t细胞和大量(bulk)cd8 t细胞的cd8 t细胞毒性淋巴细胞。在所述细胞的一些实施方案中，所述细胞是选自幼稚cd4 t细胞、中枢记忆cd4 t细胞、效应记忆cd4 t细胞和大量cd4 t细胞的cd4 t辅助性淋巴细胞。在一些实施方案中，可以通过对从人受试者获得的样品进行的白细胞单采术获得所述细胞。
113.在一些实施方案中，重组细胞还包括如本文所公开的第二核酸分子，其中第一核酸分子和第二核酸分子不具有相同的序列。在一些实施方案中，重组细胞还包括如本文所公开的第二嵌合多肽，其中第一嵌合多肽和第二嵌合多肽不具有相同的序列。在一些实施方案中，第一嵌合多肽调节第二嵌合多肽的表达和/或活性。
114.在一些实施方案中，重组细胞还包括编码可操作地连接至启动子的目的蛋白的表达盒，其中目的蛋白的表达受由嵌合受体编码的转录调控因子的调节。在一些实施方案中，所述目的蛋白对于所述重组细胞是异源的。原则上，关于选择蛋白质以靶向用于由嵌合受体编码的转录调控因子调节表达没有特别限制。适合于通过本文所公开的组合物和方法进行调控的蛋白质的非限制性例子包括细胞因子、细胞毒素、趋化因子、免疫调节剂、促凋亡因子、抗凋亡因子、激素、分化因子、去分化因子、免疫细胞受体或报告基因。在一些实施方案中，免疫细胞受体包括t细胞受体(tcr)。在一些实施方案中，免疫细胞受体包括嵌合抗原受体(car)。在一些实施方案中，将编码目的蛋白的表达盒并入编码本公开文本的嵌合受体的相同核酸分子中。在一些实施方案中，将编码目的蛋白的表达盒并入与编码本公开文本的嵌合受体的核酸分子分开的第二表达载体中。
115.在另一方面，本文提供包括至少一种如本文所公开的重组细胞和培养基的各种细胞培养物。通常，培养基可以是用于本文所述的细胞培养物的任何一种合适的培养基。用于
转化多种多样的上述宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包含至少一种如本文公开的重组细胞的细胞培养物也在本技术的范围内。适合于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。药物组合物
116.在一些实施方案中，本公开文本的核酸和重组细胞可以并入组合物(包括药物组合物)中。这样的组合物通常包括所述核酸和/或重组细胞以及药学上可接受的赋形剂(例如，载体)。
117.适合于注射使用的药物组合物包含无菌水溶液(水溶性的)或分散体，以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
tm
(basf，帕西帕尼，新泽西州)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情形中，组合物应是无菌的并且应为可通过注射器施用的程度的流体。其在制造和储存条件下应是稳定的并且必须抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而保存。所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以维持适当的流动性，例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情形中通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂例如十二烷基硫酸钠。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情形中，所述组合物中通常将包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇和/或氯化钠。通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
118.无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量并入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这些方法由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。
119.在一些实施方案中，本公开文本的嵌合多肽和notch受体也可以通过转染或感染使用本领域中已知的方法来施用，所述方法包括但不限于以下文献中所述的方法：mccaffrey等人(nature(2002)418:6893)，xia等人(nature biotechnol(2002)20:1006-10)，或者putnam(am j health syst pharm(1996)53:151-60,勘误于am j health syst pharm(1996)53:325)。本公开文本的方法
120.本文所述的任何一种或多种治疗组合物(例如,核酸、重组细胞和药物组合物)的施用可以用于在相关健康状况或疾病(如癌症和慢性感染)的治疗中治疗个体。在一些实施方案中，将核酸、重组细胞和药物组合物并入用于治疗个体的方法中的治疗组合物中，所述个体患有与检查点抑制相关的一种或多种自身免疫性障碍或疾病，怀疑患有所述障碍或疾病，或者可能具有患上所述障碍或疾病的高风险。示例性的自身免疫障碍和疾病可以包括而不限于乳糜泻、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。
121.因此，在一个方面，本文提供用于抑制个体中靶细胞的活性的方法，所述方法包括
向所述个体施用包括本文所提供的核酸、重组细胞和药物组合物中的一种或多种的第一疗法的步骤，其中所述第一疗法抑制所述靶细胞的活性。例如，如果靶细胞的增殖减少，如果靶细胞的病理或致病行为减少，如果靶细胞被破坏或杀伤等，则靶细胞的活性可能被抑制。抑制包括所测量的量减少至少约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用有效数量的如本文所公开的重组细胞，其中所述重组细胞抑制所述个体的靶细胞。通常，所公开的方法的靶细胞可以是任何细胞，如例如急性骨髓瘤白血病细胞、间变性淋巴瘤细胞、星形细胞瘤细胞、b细胞癌细胞、乳腺癌细胞、结肠癌细胞、室管膜瘤细胞、食管癌细胞、胶质母细胞瘤细胞、神经胶质瘤细胞、平滑肌肉瘤细胞、脂肪肉瘤细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、套细胞淋巴瘤细胞、黑色素瘤细胞、神经母细胞瘤细胞、非小细胞肺癌细胞、少突神经胶质瘤细胞、卵巢癌细胞、胰腺癌细胞、外周t细胞淋巴瘤细胞、肾癌细胞、肉瘤细胞、胃癌细胞、癌细胞、间皮瘤细胞或肉瘤细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是致病细胞。
122.在另一方面，本文提供用于治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)的方法，所述方法包括向所述个体施用包括本文所提供的嵌合多肽、notch受体、核酸、重组细胞或药物组合物中的一种或多种的第一疗法的步骤，其中所述第一疗法治疗所述个体的健康状况。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包括有效数量的本文所提供的重组细胞，其中所述重组细胞治疗所述健康状况。
123.在另一方面，本文提供用于辅助治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)的方法，所述方法包括以下步骤：向所述个体施用包括如本文所公开的一种或多种重组核酸、重组细胞或药物组合物的第一疗法，以及向所述个体施用第二疗法，其中所述第一疗法和所述第二疗法一起治疗所述个体的健康状况。在一些实施方案中，所述方法包括向所述个体施用第一疗法，所述第一疗法包含有效数量的如本文公开的重组细胞，其中所述重组细胞治疗所述健康状况。向个体施用重组细胞
124.在一些实施方案中，所述方法涉及将有效量或数量的本公开文本的重组细胞施用至需要这样的方法的个体。这个施用步骤可以使用本领域中已知的任何植入方法来完成。例如，本公开文本的重组细胞可以通过静脉内输注直接注射至个体的血流中，或者以其他方式施用至个体。
125.术语“施用”、“引入”和“移植”在本文中可互换使用，以指代将表达本文所提供的嵌合受体的重组细胞递送至个体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括通过导致将引入的细胞至少部分定位于期望部位，从而产生一种或多种期望作用的施用方法或途径，将重组细胞施用至个体。可以通过任何适当的途径施用重组细胞或其分化的后代，所述适当的途径导致递送至个体的期望位置，所施用的细胞或细胞组分的至少一部分在此位置保持存活。所述细胞在施用至个体之后的活力时间段可以短至几小时(例如，二十四小时)，至几天，至长达几年，或者甚至长期移植持续个体的寿命。
126.在预防性提供时，在一些实施方案中，在要治疗的疾病或病症的任何症状之前将本文所述的重组细胞施用至个体。因此，在一些实施方案中，重组干细胞群的预防性施用用于预防疾病或病症的症状的发生。
127.在治疗性提供时，在一些实施方案中，在疾病或病症的症状或指征发作时(或之后)，例如，在疾病或病症发作时，提供重组干细胞。
128.为了在本文所述的各种实施方案中使用，如本文公开的重组细胞的有效量可以是至少102个细胞、至少5
×
102个细胞、至少103个细胞、至少5
×
103个细胞、至少104个细胞、至少5
×
104个细胞、至少105个细胞、至少2
×
105个细胞、至少3
×
105个细胞、至少4
×
105个细胞、至少5
×
105个细胞、至少6
×
105个细胞、至少7
×
105个细胞、至少8
×
105个细胞、至少9
×
105个细胞、至少1
×
106个细胞、至少2
×
106个细胞、至少3
×
106个细胞、至少4
×
106个细胞、至少5
×
106个细胞、至少6
×
106个细胞、至少7
×
106个细胞、至少8
×
106个细胞、至少9
×
106个细胞、或其倍数。重组细胞可以衍生自一个或多个供体，或者可以从自体来源(即，所治疗的人受试者)获得。在一些实施方案中，将所述重组细胞在施用于有需要的个体之前在培养物中扩增。
129.在一些实施方案中，通过方法或途径将包含重组细胞的组合物(即，包含表达本文所提供的任何嵌合受体的多个重组细胞的组合物)递送至个体中导致将细胞组合物至少部分定位于期望部位。细胞组合物可以通过导致个体中的有效治疗的任何适当途径来施用，例如，施用导致递送至个体中的期望位置，其中所递送的组合物的至少一部分(例如，至少1
×
104个细胞)被递送至期望部位持续一段时间。施用方式包括注射、输注、滴注等。“注射”包括而不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、珠网膜下、脊柱内、脑脊髓内和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，所述途径是静脉内的。对于细胞的递送，可以进行通过注射或输注来施用。
130.在一些实施方案中，将重组细胞全身施用，换言之并非将重组细胞群直接施用至目标部位、组织或器官，而是使得其进入个体的循环系统，并由此经历代谢和其他类似过程。
131.使用组合物的治疗用于疾病或病症的治疗的功效可以由熟练的临床医师来确定。然而，本领域技术人员将了解，如果疾病的任一种或全部体征或症状或标记物发生改进或改善，则认为治疗是有效治疗。功效还可以通过个体恶化的失败来测量，如通过住院或对医疗干预的需要所评估(例如，疾病的进程被停止或至少被减慢)。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的和/或在本文中描述。治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病进程，例如，停止或减慢症状的进展；或(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；(3)预防或减少症状发展的可能性。
132.如上文所讨论，治疗有效量包括治疗组合物在被施用至个体时足以促进特定作用的量，所述个体如患有疾病、怀疑患有疾病或具有患上疾病的风险的个体。在一些实施方案中，有效量包括足以预防或延迟疾病的症状的发展、改变疾病的症状的进程(例如但不限于，减缓疾病的症状的进展)或逆转疾病的症状的量。应理解，对于任何给定的病例，本领域普通技术人员使用常规实验可以确定适当的有效量。
133.包括所公开的治疗组合物的治疗用于疾病的治疗的功效可以由熟练的临床医师来确定。然而，如果疾病的至少任一种或全部体征或症状发生改进或改善，则认为治疗是有效的。功效还可以通过个体恶化的失败来测量，如通过住院或对医疗干预的需要所评估(例如，疾病的进程被停止或至少被减慢)。测量这些指示物的方法是本领域技术人员已知的
和/或在本文中描述。治疗包括对个体或动物的疾病的任何治疗(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)并且包括：(1)抑制疾病，例如，停止或减慢症状的进展；(2)缓解疾病，例如，导致症状消退；或者(3)预防或减少症状发展的可能性。
134.在一些实施方案中，个体是哺乳动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物是人。在一些实施方案中，所述个体患有或怀疑患有与由细胞表面配体或抗原介导的细胞信号传导的抑制相关的疾病。适合于通过本公开文本的组合物和方法治疗的疾病包括但不限于癌症、自身免疫病、炎性疾病和感染性疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症或慢性感染。另外的疗法
135.如上所讨论的，可以将本文所述的重组细胞和药物组合物与一种或多种另外的治疗剂例如化学治疗剂或抗癌剂或抗癌疗法组合施用。与一种或多种另外治疗剂“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序连续施用。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的治疗剂、化学治疗剂、抗癌剂或抗癌疗法选自化学疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、毒素疗法和手术。“化学疗法”和“抗癌剂”在本文中可互换使用。可以使用各种类别的抗癌剂。非限制性例子包括：烷化剂、抗代谢物、蒽环素、植物碱、拓扑异构酶抑制剂、鬼臼毒素、抗体(例如，单克隆的或多克隆的)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼(或))、激素治疗、可溶受体和其他抗肿瘤药。用于调节细胞的活性的方法
136.在另一方面，本文提供了用于调节细胞的活性的各种方法。所述方法包括：(a)提供本公开文本的重组细胞，以及(b)使其与选定的配体接触，其中所述选定的配体与所述胞外结合结构域的结合诱导配体诱导型蛋白水解切割位点的切割并释放转录调控因子，其中所释放的转录调控因子调节所述重组细胞的活性。本领域技术人员在阅读本公开文本后将理解，所公开的方法可以在体内、离体或体外进行。
137.可以使用本公开文本的方法调节的细胞的活性包括但不限于细胞的选定基因的表达、细胞的增殖、细胞的凋亡、细胞的非凋亡性死亡、细胞的分化、细胞的去分化、细胞的迁移、分子从细胞分泌、细胞的细胞粘附以及细胞的细胞溶解活性。
138.在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节细胞的基因产物的表达。在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节细胞中异源基因产物的表达。异源基因产物是通常并非由细胞产生的基因产物。例如，可以用包含编码异源基因产物的核苷酸序列的核酸对细胞进行遗传修饰。
139.在一些实施方案中，所述异源基因产物是分泌的基因产物。在一些实施方案中，所述异源基因产物是细胞表面基因产物。在一些情形中，所述异源基因产物是胞质基因产物。在一些实施方案中，所释放的转录调控因子同时调节细胞中两种或更多种异源基因产物的表达。
140.在一些实施方案中，细胞中的异源基因产物选自趋化因子、趋化因子受体、嵌合抗原受体、细胞因子、细胞因子受体、分化因子、生长因子、生长因子受体、激素、代谢酶、病原体衍生的蛋白质、增殖诱导剂、受体、rna指导的核酸酶、位点特异性核酸酶、t细胞受体(tcr)、嵌合抗原受体(car)、毒素、毒素衍生的蛋白质、转录调控因子、转录激活物、转录阻遏物、翻译调节因子、翻译激活物、翻译阻遏物、激活性免疫受体、抗体、凋亡抑制剂、凋亡诱导剂、工程化t细胞受体、免疫激活物、免疫抑制剂以及抑制性免疫受体。
141.在一些实施方案中，所释放的转录调控因子调节所述细胞的分化，并且其中所述细胞是免疫细胞、干细胞、祖细胞或前体细胞。
142.当使用相同的结合结构域和icd时，本公开文本的嵌合受体与标准synnotch受体相比提供更高程度的表达。在一些实施方案中，根据配体/结合结构域对及其亲和力，本公开文本的notch受体可以提供比相应synnotch受体高约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的表达增强。
143.另外，本公开文本的嵌合受体可以提供转录调控，所述转录调控响应于t细胞激活的程度，而与配体结合无关。这允许在使用中具有额外的灵活性，例如在尽管不存在嵌合受体配体但当被激活时仍期望增强或阻遏t细胞应答的情况下。系统和试剂盒
144.本文还提供系统和试剂盒，其包括本文提供并描述的嵌合多肽、notch受体、重组核酸、重组细胞或药物组合物以及用于它们的制备和使用的书面说明书。例如，在一些实施方案中，本文提供系统和/或试剂盒，其包括以下中的一种或多种：如本文所述的嵌合多肽、如本文所述的notch受体、如本文所述的重组核酸、如本文所述的重组细胞或如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本公开文本的系统和/或试剂盒还包括一个或多个注射器(包括预填充注射器)和/或导管(包括预填充注射器)，用于将所提供的嵌合多肽、notch受体、重组核酸、重组细胞或药物组合物中的任一种施用至个体。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，所述另外的治疗剂可以与其他试剂盒组分同时或依序施用，用于期望目的，例如，用于调节细胞的活性、抑制靶癌细胞或治疗有需要的个体的健康状况(例如，疾病)。
145.任何上述系统和试剂盒还可以包含一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照多肽、阳性对照多肽、用于体外产生所述嵌合受体多肽的试剂。
146.在一些实施方案中，系统或试剂盒的组分可以在分开的容器中。在一些其他实施方案中，系统或试剂盒的组分可以组合在单个容器中。
147.在一些实施方案中，系统或试剂盒还可以包含使用所述试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，可以将说明书印刷在基材(如纸或塑料等)上。说明书可以作为药品说明书存在于试剂盒中，存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关)等。说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如cd-rom、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在一些情况下，实际说明书不存在于试剂盒中，但是可以提供用于从远程来源获得说明书的手段(例如，通过互联网)。这个实施方案的例子是包括网址的试剂盒，在其中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
148.本公开文本中所提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。
149.不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且诸位发明人保留质疑所引用文献的准确性和相关性的权利。应清楚地理解，尽管本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但是该提及并不意味着承认
这些文件中的任何文件构成了本领域中公知常识的一部分。
150.本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本之后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本技术的精神和范围内。实施例
151.除非另有说明，否则本公开文本的实践将采用本领域技术人员众所周知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。在上面引用的文献中对此类技术进行了充分解释。
152.在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。实施例1嵌合受体和应答元件构建体的设计和构建
153.此实施例描述了嵌合notch受体家族的设计和构建。本公开文本的各种示例性受体的详细信息可以在下表1和表2中见到。表1.这个表格提供本公开文本的每一种嵌合notch受体、其相应跨膜结构域(tmd)以及tmd序列的相应序列标识的简要描述。还提供衍生出跨膜结构域的基因以及在uniprot knowledgebase(www.uniprot.org)的相应登录号。synnotch是标准合成notch受体。微型notch：不包含notch受体的lin-12-notch重复(lnr)和/或异二聚化结构域(hd)的嵌合notch受体。截短的cd8铰链notch是包括在ecd与tmd之间并入的来自cd8α的截短的铰链结构域的嵌合notch受体。
表2.这个表提供了对每种嵌合notch受体和相应组分(其中组分由逗号分开)的简要描述。除非另有说明，否则条目是指人来源的蛋白质。
154.上文表1-表2中描述的嵌合受体是通过将单链抗原结合片段cd19 scfv(porter dl等人,2011)与相应受体支架和合成转录调控因子gal4-vp64融合来构建。对于这些受体的构建，将编码表1和序列表中提供的氨基酸序列的dna片段从含有所指示蛋白质的dna序列的合成基因片段或质粒进行pcr扩增，并且使用标准克隆技术(例如，单链突出端pcr、融合pcr和in-fusion克隆)与侧接的翻译起始和终止序列一起组装至慢病毒表达载体phr-sin-pgk的bamhi克隆位点中。
155.用于这些实验的转录调控因子gal4-vp64含有与激活结构域vp64融合的来自酵母gal4转录因子的dna结构域，所述激活结构域vp64由单纯疱疹蛋白vp16的最小激活结构域(氨基酸437-447)的四聚体重复组成。所有受体都含有用于膜靶向的n末端cd8α信号肽(malpvtalllplalllhaarp)(seq id no:100)和myc标签(eqkliseedl)(seq id no:101)，所述标签便于用缀合至荧光染料(α-myccell signaling technology，目录号2233)的抗体便捷地确定表面表达。将所述受体各自克隆至含有磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子的修饰的慢病毒phr
′
sin:csw载体中(k.t.roybal等人,cell(2016)167(2):419-32)，用于下文实施例3-4中所述的所有原代t细胞实验。
156.phr'sin:csw载体也被修饰以产生应答元件质粒。为此目的，将用于结合gal4 dbd结构域(ggagcactgtcctccgaacg)(seq id no:102)的靶序列的五个拷贝克隆至最小pybtata启动子的5'侧。反应元件质粒中还包括pgk启动子，所述pgk启动子组成型地驱动黄
色荧光报告蛋白(mcitrine)的表达以便捷地鉴定成功转导的t细胞。
157.为了构建所有诱导型bfp载体，经由位于gal4应答元件的3'侧的多克隆位点中的bamhi位点克隆蓝色荧光报告蛋白(bfp)的编码序列。对于所有诱导型car载体的构建，将car在c末端用绿色荧光报告蛋白(gfp)标记，并且经由位于gal4反应元件3'的多克隆位点中的bamhi位点进行克隆。所有构建体都是根据制造商的说明书经由克隆试剂盒(克隆，clontech#st0345)克隆的。实施例2原代人t细胞分离和培养
158.此实施例描述了原代人t细胞的分离和培养，所述原代人t细胞随后用于以下实施例3中描述的各种细胞转导实验。
159.在这些实验中，原代cd4
t细胞和原代cd8
t细胞在单采术后从血液中分离，并且使用人t细胞分离试剂盒(人cd4

和cd8

富集混合物；stemcell technologies目录号15062和15063)通过阴性选择富集。血液获自太平洋血液中心(blood centers of the pacific)(加利福尼亚州旧金山市)，如大学机构审查委员会(university institutional review board)批准的。将t细胞冷冻保存在具有20％人ab血清(valley biomedical inc.，#hp1022)和10％dmso的生长培养基(rpmi-1640，ucsf细胞培养核心)中。解冻后，对于所有实验，在补充有30单位/毫升il-2(nci brb临床前储存库)的含有x-vivo
tm 15(lonza#04-418q)、5％人ab血清和10mm中和的n-乙酰基l-半胱氨酸(sigma-aldrich#a9165)的人t细胞培养基中培养t细胞。实施例3用慢病毒载体稳定转导人t细胞
160.所述实施例描述用于人t细胞的慢病毒转导的通用方案。
161.通常，经由用phr'sin:csw转基因表达载体和病毒包装质粒pcmvdr8.91和pmd2.g使用mirus-lenti(mirus，#mir 6606)转染lenti-x
tm
293t细胞(clontech#11131d)产生用水疱性口炎病毒包膜g蛋白(vsv-g)假型化的慢病毒载体(泛嗜性载体)。通常，将原代t细胞在同一天解冻，并且在培养24小时后，用具有结合至表面的抗cd3抗体和抗cd28抗体的珠粒(人t激活物cd3/cd28life technologies#11131d)以1:3细胞:珠粒比刺激原代t细胞。在48小时，收获病毒上清液，并且将原代t细胞暴露于病毒，持续24小时。在t细胞刺激后第5天，去除珠粒，并且进行t细胞扩增，直到第14天，此时它们静止并且可以用于测定。用beckton dickinson(bd biosciences)facsaria
tm ii流式细胞仪分选t细胞用于测定。在分选期间门控出展现基础car表达的与门t细胞。实施例4体外刺激原代t细胞
162.这个实施例描述了为了展现通过本文所述的嵌合notch多肽对原代t细胞的体外刺激而进行的实验。
163.对于所有体外t细胞刺激，将1
×
105个t细胞与发送细胞以1:1比率在平底96孔组织培养板中共培养。在24小时用bd fortessa
tm x-50分析培养物的报告物激活。所有流式细胞术分析都在flowjo
tm
软件(treestar,inc.)中进行。实施例5
164.这个实施例描述以与daudi肿瘤等同的水平表达cd19的髓性白血病“发送”细胞的生成。
165.所用的癌细胞系是k562髓性白血病细胞(atcc#ccl-243)和daudi b细胞淋巴母细胞(atcc#ccl-213)。k562细胞用慢病毒转导以按与daudi肿瘤等同的水平稳定表达人cd19。cd19水平是通过将细胞用α-cd19 apc(#302212)染色来确定。针对转基因的表达分选所有细胞系。实施例6报告物jurkat t细胞的产生
166.这个实施例描述报告jurkat t细胞的生成，其随后用于筛选跨膜结构域(tmd)和/或停止转移序列(sts)。
167.在这些实验中，将e6-1 jurkat t细胞(atcc#tib-152)用携带诱导型bfp报告基因和组成型mcitrine报告基因的报告质粒进行慢病毒转导，如先前所述(k.t.roybal等人,cell,164:1-10,2016)。使用beckton dickinson(bd biosciences)facsaria
tm ii流式细胞仪针对mcitrine表达分选报告物阳性jurkat细胞并且进行扩增。
168.用受体转基因表达载体产生慢病毒颗粒，如先前所述(l.morsut等人,cell(2016)164:780-91)。用单独的受体转导报告物阳性jurkat细胞，并且在96孔板中扩增用于实验。实施例7
169.这个实验描述了为了展现由本文所述的嵌合notch多肽在体外对jurkat t细胞的刺激而进行的实验。
170.对于所有体外jurkat t细胞刺激，将1
×
105个jurkat t细胞与发送细胞以1:1比率在平底96孔组织培养板中共培养。在24小时针对受体(myc)表达和报告物激活用bd fortessa x-50
tm
分析培养物。所有流式细胞术分析都在flowjo
tm
软件(treestar,inc.)中进行。使用上文方案在人原代t细胞中确认具有阳性tmd和sts命中以及阴性命中的选择的受体。实施例8
171.这个实施例描述为了取代三种不同嵌合notch受体中的异源跨膜结构域的作用而进行的实验，如通过被置于所得嵌合notch受体的控制下的bfp报告基因的表达水平所确定。
172.在这些实验中，将对应于来自88种已知的人γ分泌酶靶标的跨膜结构域(haapalaso,j alzheimers dis(2011)25(1):3-28)和来自模式生物的notch家族成员的氨基酸序列并入三种不同嵌合notch受体(synnotch、微型notch和铰链notch)中。
173.在jurkat细胞中进行初始筛选，并且在用t淋巴细胞进行的测定中进一步验证从初始筛选鉴定的候选物(命中)。结果示于图5中。实施例9
174.这个实施例描述为了显示tmd调控notch激活而进行的实验。
175.如图7中所示，用含有具有tmd变体的notch受体的慢病毒构建体转导表达bfp报告物构建体的jurkat t细胞。将jurkat与对照cd19(-)或cd19( )k562细胞1:1共培养。随后使用fortessa x-50(bd biosciences)测量bfp报告基因激活。将在cd19 k562与k562条件下来自bfp 细胞的mfi的信噪比针对所述两种条件中的mfi变化绘图。
实施例10
176.此实施例描述了铰链-notch构建体中notch1跨膜结构域(tmd)的突变分析。
177.制备在铰链-notch构建体的tmd结构域中具有不同丙氨酸突变的变体。在铰链-notch的tmd中从301位(f)至322位(s)的每个氨基酸残基单独突变为丙氨酸。将原代人cd4 t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabeads(gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达tmd突变体变体，而另一种慢病毒构建体含有bfp转录报告物。在初始t细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。在图8a中，左小图示出了通过抗myc标签染色测量的不同受体的相对表达(y轴)与报告物构建体标记物表达(x轴)的关系，而右小图代表了在双阳性细胞中tmd突变体变体的受体表达的mfi量化。
178.如图8b中所示，将表达抗cd19受体的t细胞与对照cd19(-)k562细胞或对照cd19( )k562细胞以1:1的比率共培养。随后使用fortessa x-50(bd biosciences)测量诱导型bfp报告基因的转录激活。左小图示出了激活概况的流式图。右小图代表绘制为线图的bfp％。结果指示tmd的c末端中甘氨酸(g)残基和缬氨酸(v)残基的重要性。实施例11
179.此实施例描述了针对铰链-notch构建体中跨膜结构域(tmd)和sts结构域的突变分析。
180.在此实施例中使用四种类型的示例性铰链notch受体(seq id no:131-134)，所有这些都包含抗cd19 scfv结构域、截短的cd8铰链结构域和gal4vp64结构域。对于sts和tmd结构域的选择，这四种构建体包含：clstn1 tmd和clstn1 sts(seq id no:131)、clstn2 tmd和clstn2 sts(seq id no:132)、clstn1 tmd和notch1 sts(seq id no:133)、clstn2 tmd和notch1 sts(seq id no:134)。将原代人cd4 t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabeads(gibco)激活，并且用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达具有所指示的tmd/sts组合的铰链受体，而另一种慢病毒构建体表达转录报告物及组成型表达的抗alppl2 car。在初始t细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。如图9中所示，将1x105个表达受体的双阳性t细胞与以下共培养：1x105个k562细胞(
“‑
car”小图，蓝色)、或1x105个cd19 k562细胞(
“‑
car”小图，红色)。类似地，在car活性的存在下通过与以下共培养来测试1x105个表达受体的双阳性t细胞：1x105个alppl2 k562细胞(“ car”组，蓝色)或1x105个alppl2 cd19 k562细胞(“ car”组，红色)。随后使用fortessa x-50(bd biosciences)测量诱导型bfp报告基因的转录激活。实施例12
181.这个实施例描述能够展现本公开文本中所述的notch构建体和tmd变体在被工程化至t细胞中时的功能的实验，其是通过测量和比较某种或某些细胞因子(例如，il-2)的产生来进行。
182.具体而言，对于t细胞的自分泌和旁分泌扩增，用本公开文本的notch tmd变体工程化的t细胞可以用于测试配体触发的工程化细胞因子的分泌。可以测试具有各种tmd修饰的notch tmd受体的表达谱。将原代人t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabeads(gibco)激活并用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达例如针对mcam抗原的car，并且一种慢病毒构建体表达notch tmd变体受体及诱导型超级il2(在gal4-uas控制下)。在初始t细胞刺激后第5天分选含有两种构建体的细胞，并且进一步扩增用于激活测试。通过抗myc标签染色
确定受体表达。实施例13
183.这个实施例描述能够展现配体触发的超级il2的表达改进car-t细胞的细胞活力的实验。
184.将1x105个表达notch tmd变体受体的双阳性t细胞在不含il-2的培养基中与以下共培养：无k562细胞，与cd19 k562细胞以触发notch构建体，与mcam k562细胞以触发car激活，或者与mcam 和cd19 k562细胞以触发两种受体的激活。在9天后，通过前向散射和侧向散射测量使用fortessa x-50(bd biosciences)评估活t细胞比例。两种受体的共激活导致最多活细胞，其次是notch激活(以及随后的超级il2诱导)、仅car激活，以及没有任一种受体激活。实施例14
185.这个实施例描述能够展现使用notch tmd变体的t细胞的可调的增殖的实验。
186.将原代人t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabeads(gibco)激活并用两种慢病毒构建体转导，一种慢病毒构建体表达例如针对mcam抗原的car，并且一种慢病毒构建体表达notch tmd变体及诱导型超级il2(在gal4-uas控制下)。针对无notch对照测试不同的notch tmd变体。类似地，在没有car表达的情况下生成原代人t细胞。将t细胞根据制造商的方案用celltrace violet(invitrogen)染色，在不含il-2的培养基中与cd19 k562靶细胞共孵育，并且在不同时间点使用fortessa x-50(bd biosciences)进行测量，以通过ctv信号衰减来评估增殖。实施例15
187.这个实施例描述能够展现使用notch变体的tmd变体的超级il2的可调的分泌的实验。
188.将原代人t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabeads(gibco)激活并用慢病毒构建体转导，所述慢病毒构建体包含notch tmd变体及诱导型超级il2(在gal4-uas控制下)。针对无notch对照测试不同的notch tmd变体。将t细胞与mcam cd19 k562细胞在缺少il-2的培养基中共孵育，并且在不同时间点，使用instant elisa试剂盒(invitrogen)根据制造商的方案用酶标仪(tecan)测量上清液il-2。还可以用表达例如针对mcam的car的另外的慢病毒载体生成原代人t细胞。表达car的细胞对il-2的增强的摄取在仅car t细胞和表达notch tmd变体的t细胞中导致上清液il2的损失。实施例16
189.这个实施例描述能够展现使用notch构建体的tmd变体的超级il2的可调的分泌增强旁观者t细胞的增殖的实验。
190.将原代人t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabeads(gibco)激活并用慢病毒构建体转导，所述慢病毒构建体包含notch tmd变体受体及诱导型超级il2(在gal4-uas控制下)。针对无notch对照测试不同的notch tmd变体。将表达这样的notch tmd变体的t细胞与用celltrace far red(invitrogen)染色的表达针对mcam的car的“旁观者”t细胞或与无car共孵育。将t细胞与mcam cd19 k562细胞在缺少il-2的培养基中共孵育，并且通过在fortessa x-50(bd biosciences)上测量信号衰减来评估旁观者t细胞的增殖。实施例17
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