tau蛋白病的治疗

1.本发明涉及治疗受试者tau蛋白病的方法、改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的方法、减少tau聚集体和神经原纤维缠结的方法，以及用于此类方法的组合物和制剂。


背景技术：

2.tau蛋白(在本文中也称为tau)在正常状态下是一种在中枢神经系统中含量丰富的高度可溶性蛋白。在健康条件下，tau蛋白与微管有关，并稳定微管，特别是神经细胞的微管。
3.tau蛋白病是一类进行性神经退行性疾病，其病理学定义为脑神经元细胞中存在过度磷酸化tau的异常聚集。当tau蛋白过度磷酸化、与微管解离并形成不溶性聚集体时，就会发生异常聚集。随着tau聚集体在神经元细胞中蓄积，它们形成神经原纤维缠结(nft)，最终导致神经元细胞死亡和认知能力下降。
4.过度磷酸化tau的聚集体与神经退行性疾病(如阿尔茨海默病(ad)、额颞叶痴呆和其他tau蛋白病)的发病机制有关。整个大脑的nft病理学进展与退行性疾病的疾病进展相关。然而，迄今为止，这些神经原纤维缠结导致疾病的机制尚不清楚。
5.tau蛋白病的早期诊断通常是不可能的。目前的临床诊断依赖于临床病史和症状进展。因此，通常仅在症状出现后，且通常在tau发生显著聚集后疾病处于晚期时，才诊断为tau蛋白病。
6.迄今为止，在tau聚集发生后(例如晚期ad(即有tau聚集体)或仅与tau聚集相关的tau蛋白病)，治疗tau蛋白病的选择有限。
7.需要用于治疗已发生tau聚集和nft形成和/或其中tau聚集是唯一病因因素的tau蛋白病的方法。


技术实现要素：

8.本发明人已经发现，通过促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr(seq id no：7)中苏氨酸(例如对应于全长野生型人tau第205位的苏氨酸(t205))的磷酸化，和/或向受试者的神经元中引入的tau蛋白的磷酸模拟物，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr(seq id no：7)中苏氨酸(例如对应于全长野生型人tau(seq id no：1)的第205位苏氨酸(t205))已经被磷酸化的tau蛋白，可以减轻认知能力下降和与tau蛋白病相关的其他症状。
9.第一方面提供治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，其包括施用制剂，该制剂：
10.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr(seq id no：7)中苏氨酸的磷酸化；和/或
11.(b)向受试者的神经元中引入的磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr(seq id no：7)中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
12.可选的第一方面提供用于治疗或预防受试者tau蛋白病的制剂，其中所述制剂：
13.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
14.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
15.制剂在制备用于治疗或预防受试者tau蛋白病的药物中的用途，其中所述制剂：
16.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
17.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
18.第二方面提供了治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，包括施用制剂，该制剂：
19.(a)促进tau的磷酸化，其为对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
20.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化。
21.可选的第二方面提供用于治疗或预防受试者tau蛋白病的制剂，其中所述制剂：
22.(a)促进tau的磷酸化，其为对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
23.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化；或
24.制剂在制备用于治疗或预防受试者tau蛋白病的药物中的用途，其中所述制剂：
25.(a)促进tau的磷酸化，其为对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
26.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化。
27.第三方面提供治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，其包括施用制剂，所述制剂：
28.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
29.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
30.可选的第三方面提供用于治疗或预防受试者tau蛋白病的制剂，其中所述制剂：
31.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
32.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
33.制剂在制备用于治疗或预防受试者tau蛋白病的药物中的用途，其中所述制剂：
34.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
35.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
36.第四方面提供治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，其包括施用提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂。
37.可选的第四方面提供提高神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂，用于治疗或预防受试者tau蛋白病；或用于提高神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂在制备用于治疗或预防受试者tau蛋白病的药物中的用途。
38.第五方面提供治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，其包括施用改变受试者神经元中编码tau的核苷酸序列，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物的的制剂，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
39.可选的第五方面提供用于治疗或预防受试者tau蛋白病的制剂，其中所述制剂改变受试者神经元中编码tau的核苷酸序列，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau；或制剂在制备用于治疗或预防受试者tau蛋白病的药物中的用途，其中所述制剂改变受试者神经元中编码tau的核苷酸序列，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
40.第六方面提供治疗或预防tau蛋白病的方法，其包括向受试者的神经元中引入：
41.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；或
42.(b)能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
43.可选的第六方面提供了：
44.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；或
45.(b)表达能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau，
46.用于治疗或预防tau蛋白病；或
47.使用以下在制备用于治疗或预防tau蛋白病的药物中的用途：
48.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；或
49.(b)表达能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
50.第七方面提供改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的方法，其包括向受试者施用制剂，该制剂：
51.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
52.(b)引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
53.可选的第七方面提供用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的制剂，其中所述制剂：
54.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
55.(b)向受试者的神经元中引入模拟磷酸化的磷酸化tau，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
56.制剂在制备用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的药物中的用途，其中所述制剂：
57.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
58.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
59.第八方面提供改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的方法，其包括施用制剂，该制剂：
60.(a)促进tau的磷酸化，其为对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
61.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau是第205位苏氨酸已经被磷酸化的人tau。
62.可选的第八方面提供用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的制剂，其中所述制剂：
63.(a)促进tau的磷酸化，其为对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
64.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化；或
65.制剂在制备用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者的认知能力的药物中的用途，其中所述制剂：
66.(a)促进tau的磷酸化，其为对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
67.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化。
68.第九方面提供改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的方法，其包括施用制剂，该制剂：
69.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
70.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
71.可选的第九方面提供用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的制剂，其中所述制剂：
72.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
73.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
74.制剂在制备用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的药物中的用途，其中所述制剂：
75.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
76.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
77.第十方面提供改善患有与tau蛋白病相关认知受损的受试者认知能力的方法，其包括施用提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂。
78.可选的第十方面提供提高神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂，用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力；或用于提高神经元中p38γ活性或
p38γ变体活性的制剂在制备用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的药物中的用途。
79.第十一方面提供改善患有与tau蛋白病相关认知受损的受试者认知能力的方法，其包括施用改变受试者神经元中编码tau苷酸序列的制剂，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
80.可选的第十一方面提供用于改善患有与tau蛋白病相关认知受损的受试者认知能力的制剂，其中所述制剂改变受试者神经元中编码tau的核苷酸序列，从而表达模拟磷酸化的磷酸化tau，其中所述磷酸化的tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中的苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau；或者制剂在制备用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的药物中的用途，其中所述制剂改变受试者神经元中编码tau的核苷酸序列，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau的205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
81.第十二方面提供改善患有与tau蛋白病相关认知受损的受试者认知能力的方法，其包括向受试者神经元中引入：
82.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；和/或
83.(b)能够改变编码tau的核苷酸序列从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物的基因编辑系统，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
84.可选的第十二方面提供了：
85.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38 γ或其变体的核酸；和/或
86.(b)能够改变编码tau的核苷酸序列从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物的基因编辑系统，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau，
87.用于改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者的认知能力；或
88.使用以下在制备用于改善患有与tau蛋白病相关认知受损的受试者的认知能力的药物中的用途：
89.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；和/或
90.(b)能够改变编码tau的核苷酸序列从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物的基因编辑系统，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
91.第十三方面提供减少或预防神经元中tau聚集的方法，其包括向神经元中引入制剂，该制剂：
92.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
93.(b)引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
94.可选的第十三方面提供用于减少或预防神经元中tau聚集的制剂，其中所述制剂：
95.(a)促进tau的磷酸化，其为tau序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
96.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
97.制剂在制备用于减少或预防受试者神经元中tau聚集的药物中的用途，其中所述制剂：
98.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
99.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
100.第十四方面提供减少或预防神经元中tau聚集的方法，其包括向神经元中引入制剂，该制剂：
101.(a)促进tau对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
102.(a)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化。
103.可选的第十四方面提供用于减少或预防神经元中tau聚集的制剂，其中所述制剂：
104.(a)促进tau对应于人tau第205位的苏氨酸磷酸化；和/或
105.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化；或
106.制剂在制备用于减少或预防受试者神经元中tau聚集的的药物中的用途，其中所述制剂：
107.(a)促进tau的磷酸化，其为对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
108.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化。
109.第十五方面提供减少或预防神经元中tau聚集的方法，其包括向神经元中引入制剂，该制剂：
110.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
111.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
112.可选的第十五方面提供用于减少或预防神经元中tau聚集的制剂，其中所述制剂：
113.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
114.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
115.制剂在制备用于减少或预防受试者神经元中tau聚集的的药物中的用途，其中所述制剂：
116.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
117.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
118.第十六方面提供在受试者中减少或预防神经元中tau聚集的方法，其包括向受试
者的神经元中引入：
119.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；和/或
120.(b)表达能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau的第205位苏氨酸已经被磷酸化的tau。
121.可选的第十六方面提供了：
122.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；和/或
123.(b)表达能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经磷酸化的tau，
124.用于减少或预防受试者神经元中的tau聚集；或
125.制剂在制备用于减少或预防受试者神经元中tau聚集的药物中的用途：
126.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；和/或
127.(b)表达能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
128.第十七方面提供减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的方法，其包括施用有效量的制剂，该制剂：
129.(a)促进tau磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
130.(b)引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
131.可选的第十七方面提供用于减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的制剂，其中所述制剂：
132.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
133.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
134.制剂在制备用于减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的的药物中的用途，其中所述制剂：
135.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
136.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
137.第十八方面提供减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的方法，其包括施用有效量的制剂，该制剂：
138.(a)促进tau对应于人tau第205位的苏氨酸的磷酸化；和/或
139.(c)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化。
140.可选的第十八方面提供用于减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的制剂，其中所述制剂：
141.(a)促进tau对应于人tau第205位的苏氨酸处磷酸化；和/或
142.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化；或
143.制剂在制备用于减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的药物中的用途，其中所述制剂：
144.(a)促进tau对应于人tau第205位的苏氨酸处磷酸化；和/或
145.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化人tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化人tau在对应于tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化。
146.第十九方面提供减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的方法，其包括向神经元中引入制剂，该制剂：
147.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
148.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
149.可选的第十九方面提供用于减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的制剂，其中所述制剂：
150.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
151.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
152.制剂在制备用于减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的的药物中的用途，其中所述制剂：
153.(a)提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体的活性；和/或
154.(b)在受试者的神经元中引入编码磷酸化tau的磷酸模拟物的核苷酸序列，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
155.第二十方面提供减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的方法，其包括向受试者的神经元中引入：
156.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；和/或
157.(b)能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau的第205位苏氨酸已经被磷酸化的tau。
158.可选的第二十方面提供了：
159.(a)p38γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；和/或
160.(b)能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau，
161.用于减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结；或
162.使用以下在制备用于减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的药物中的用途：
163.(a)p38 γ或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸；和/或
164.(b)能够改变编码tau的核苷酸序列的核酸，从而表达磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸，和/或在对应于人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
165.第二十一方面提供减少患有tau蛋白病的受试者中人tau蛋白第422位丝氨酸磷酸化的方法，该方法包括施用有效量的制剂，该制剂：
166.(a)促进tau的磷酸化，其为tau序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
167.(b)引入模磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
168.可选的第二十一方面提供用于减少患有tau蛋白病的受试者中人tau蛋白第422位丝氨酸磷酸化的制剂，其中所述制剂：
169.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
170.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
171.制剂在制备用于减少患有tau蛋白病的受试者中人tau第422位丝氨酸磷酸化的药物中的用途制剂，其中所述制剂：
172.(a)促进tau的磷酸化，其为tau序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
173.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
174.第二十二方面提供治疗或预防受试者中与人tau第422位丝氨酸磷酸化相关的tau蛋白病的方法，该方法包括施用有效量的制剂，该制剂：
175.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸处磷酸化；和/或
176.(b)引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
177.可选的第二十二方面提供治疗或预防受试者中与人tau第422位丝氨酸磷酸化相关的tau蛋白病的方法，其中所述制剂：
178.(a)促进tau的磷酸化，其为tau序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
179.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau；或
180.制剂在制备用于治疗或预防受试者中与人tau第422位丝氨酸磷酸化相关的tau蛋白病的药物中的用途制剂，其中所述制剂：
181.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化；和/或
182.(b)向受试者的神经元中引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸已经被磷酸化的tau。
183.第二十三方面提供包含tau基因(mapt基因)编辑系统或其部分、或编码tau基因(mapt基因)编辑系统或其部分的核酸的制剂，该基因编辑系统或其部分包含一个或更多个核酸，其将突变引入编码野生型tau的核苷酸序列以导致磷酸化tau的磷酸模拟物表达，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸处和/或对应于全长人tau第205位的苏氨酸已经被磷酸化的tau。
附图说明
184.图1.活性p38γ map激酶的递送改善晚期阿尔茨海默病小鼠的认知表现。图1(a)是一个实验示意图，显示在13月龄的app23(和非转基因对照)小鼠中aav9/php.b syn-p38γ
ca
和对照syn-egfp递送(静脉注射(i.v.)，100μl)实现神经元表达的时间线。在不同的实验中使用两种不同的aav滴度(10
11
或10
13
病毒颗粒/ml)。在aav递送后2个月评估认知表现和组织学和生化数据。(b)是一个图像，显示app23小鼠皮质和海马的免疫荧光分析，证实aav介导的神经元中活性p38γ
ca
(ha)的表达和app(6e10)的转基因表达。比例尺，50μm。图1(c-g)显示13月龄的app23小鼠在aav9/php.b syn-p38γ
ca
和对照syn-egfp递送(静脉注射，100μl；每毫升10
11
个病毒基因组)后2个月在莫里斯水迷宫中的记忆力评估(n＝10-11)。(c)是显示采集阶段的图：第6天的代表性游泳路径轨迹。(d)是一个图表，显示在采集阶段(第1-6天)使用所示aav治疗的app23小鼠的逃避潜伏期。(e)是一个图表，显示在(c)中采集曲线的线性回归。(f)是一个图表，显示学习曲线比较。(g)是一个图表，显示水迷宫象限的探索试验(第7天)占用率。q1，靶象限。虚线，随机占用率的阈值。图(h-i)13月龄app23小鼠在所示aav递送后2个月的莫里斯水迷宫潜伏期(静脉注射，100μl；每毫升10
13
个病毒基因组)。(对于app23aav
egfp
和app23 aav
p38γca
，n＝9；对于对照aav
egfp
和aav
p38γca
，n＝5-6)。(h)是显示采集阶段的图：第6天的代表性游泳路径轨迹。(i)是一个图表，显示采集阶段的逃避潜伏期。(j)是一个图表，显示(i)中采集曲线的线性回归。(k)是一个图表，显示学习曲线比较。(i)是一个图表，显示水迷宫象限的探索试验(第7天)占用率。q1，靶象限。数据以平均值
±
s.e.m.表示。**p＜0.01*p＜0.05ns，不显著。(双因素anova用于d、i；anova用于f、g、k、l)。
185.图2.tau毒性是由内源性p38y和苏氨酸-205(t205)磷酸化水平调节的。(a)是一个示意图，所示人野生型tau转基因小鼠(alz17)与p38γ敲除(p38γ-/-)小鼠杂交，以实现在t205 tau处tau磷酸化水平及其同源激酶p38γ水平降低。(b)是一个图像，显示来自alz17.p38γ
/
和alz17.p38γ-/-小鼠的tau和p38γ皮质切片的免疫荧光染色。比例尺，10μm。图2(c-e)显示10月龄的alz17.p38γ
/
、alz17.p38γ-/-、p38γ
/
和p38γ-/-对照小鼠在莫里斯水迷宫中的记忆力/认知表现。(n＝10)。(c)是显示采集阶段的图：第6天的代表性游泳路径轨迹。(d)是一个图表，显示具有所示基因型的小鼠在第1-6天的逃避潜伏期。(e)是一个图表，通过线性回归斜率显示学习曲线比较。(f)是一个图表，显示具有所示基因型的小鼠在第7天探索试验期间莫里斯水迷宫象限占用。q1，靶象限。虚线，随机占用率阈值。数据以平均值
±
s.e.m.表示。**p＜0.01*p＜0.05ns，不显著。(双因素anova用于d；anova用于e、f)
186.图3.内源性tau在t205处的磷酸化调节兴奋性毒性信号传递。(a)是一个示意图，显示通过基因组编辑产生的taut205a和taut205e小鼠。(b)是dna测序色谱图，显示与野生型(taut205
t/t
)相比，taut205
a/a
和taut205
e/e
小鼠中编码t205残基的tau(mapt)基因的密码子编辑成功。(c)是一个图像，显示使用用p-t205特异性tau抗体检测到的抗tau(tau5)抗体从taut205
t/t
和taut205
a/a
小鼠的皮质裂解物中免疫沉淀内源性tau。(d-e)显示taut205
e/e
小鼠免于兴奋性毒性癫痫。(d)是一个图表，显示癫痫潜伏期。(e)是一个图表，显示由戊四唑(ptz；50mg/kg，i.p.)诱导的taut205
t/t
和taut205
e/e
小鼠的平均癫痫严重程度。(n＝20-22)图3(f-g)显示，taut205
a/a
小鼠更易发生兴奋性毒性癫痫。(f)是一个图表，显示癫痫潜伏期。(g)是一个图表，显示由戊四唑(ptz；30mg/kg，i.p.)诱导的taut205
t/t
和taut205
e/e
小鼠
的平均癫痫严重程度。(n＝9-12)。数据以平均值
±
s.e.m.表示。***p＜0.001**p＜0.01*p＜0.05ns，不显著。(双因素anova用于e；anova用于f)
187.图4.内源性tau在t205处的磷酸化调节app23小鼠的认知缺陷。(a)是一个示意图，显示app23小鼠分别与taut205
a/a
或taut205
e/e
小鼠杂交以获得app23.taut205
a/a
和app23.taut205
e/e
小鼠。(b)是一个图像，显示app23.taut205
t/t
和app23.taut205
a/a
小鼠的皮质中磷酸-t205tau和人app(6e10)的免疫荧光染色。dapi，细胞核标记物。比例尺，50μm。(c)是一个图表，显示app23.taut205
t/t
(n＝72)、app23.taut205
a/a
(n＝55)和app23.taut205
e/e
(n＝38)的生存曲线。(e-h)显示app23.taut205
t/t
和app23.taut205
a/a
以及taut205
t/t
和taut205
a/a
小鼠的莫里斯水迷宫结果。(n＝6-10)。(e)是显示采集阶段的图：第4天的代表性游泳路径轨迹。(f)是一个图表，显示在第1-6天学习期间的逃避潜伏期。(g)是一个图表，显示逃避潜伏期曲线比较。(h)是一个图表，显示在探索试验(第7天)期间莫里斯水迷宫象限占用率。q1，靶象限。虚线，随机占用率阈值。图4(i-i)显示app23.taut205
t/t
和app23.taut205
e/e
以及taut205
t/t
和taut205
e/e
小鼠的莫里斯水迷宫结果。(n＝6-10)。(i)是显示采集阶段的图：第6天的轨迹。(j)显示app23.taut205
t/t
和app23.taut205
e/e
以及taut205
t/t
和taut205
e/e
小鼠第1-6天学习期间的逃避潜伏期。(k)是一个图表，显示逃避潜伏期曲线比较。(i)是一个图表，显示app23.taut205
t/t
和app23.taut205
e/e
以及taut205
t/t
和taut205
e/e
小鼠第7天探索试验结果期间莫里斯水迷宫象限占用率。q1，靶象限。虚线，随机占用率阈值。数据以平均值
±
s.e.m.表示。***p＜0.001**p＜0.01*p＜0.05ns，不显著。(mantel-cox检验用于c、d；双因素anova用于f、j；anova用于g、h、k、l)
188.图5.在阿尔茨海默病小鼠模型中，需要tau中t205介导p38γ活性的防护作用。(a)是一个示意图，显示杂交获得app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠，以测试t205对app23小鼠中p38γ的防护作用的需求。将app23小鼠与p38γ
ca
小鼠和tau-/-小鼠杂交。(b)是一个实验示意图：app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠在出生后第0天(p0)颅内注射aav，以实现tauwt或taut205a或egfp对照的神经元表达。在6个月时，研究了aav介导的tau表达和莫里斯水迷宫中的学习/记忆表现。(c)是一个图像，显示注射所示aav载体的app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠皮质切片上p38γ
ca
(ha)和人tau的免疫荧光染色。dapi，细胞核标记物。比例尺，50μm。(n＝5)。图5(d-f)显示在具有tauwt或taut205a神经元表达的app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠中使用莫里斯水迷宫评估的记忆/认知表现的结果。(n数字如标签图例所示)。(d)是显示采集阶段的图表：第4天的代表性游泳路径轨迹。(e)是显示采集阶段的图表：逃避潜伏期。(f)是显示莫里斯水迷宫的图表：第8天的探索试验结果。q1，靶象限。虚线，随机占用率阈值。数据以平均值
±
s.e.m.表示。**p＜0.01*p＜0.05ns，不显著。(双因素anova用于d；anova用于e、f)。
189.图6.用aav p38γ
ca
治疗的app23中认知测试的控制参数。(a、b)是app23小鼠的皮质(a)和海马(b)的免疫荧光分析图像，证实了神经元中活性p38γ的aav介导的表达。比例尺，50μm。
190.图7.缺失p38γ的tau转基因小鼠中没有增强tau病理。(a)是一个图像，显示来自alz17.p38γ
/
和alz17.p38γ-/-小鼠的tau和p38γ皮质切片的免疫荧光染色。比例尺，10μm。(b)是一个图表，显示10月龄的alz17.p38γ
/
、alz17.p38γ-/-、p38γ
/
和p38γ-/-对照小鼠第8天的莫里斯水迷宫视觉提示测试。(n＝10)。(c)是一个图表，显示在第7天探索试验期间具有所示基因型的小鼠的莫里斯水迷宫象限占用。q1，靶象限。虚线，随机占用率阈值。
(d)是一个图像，显示20月龄alz17.p38γ
/
和alz17.p38γ-/-的皮质切片的浸银染色。比例尺，100μm。(e)是一个图像，显示来自alz17.p38γ
/
和alz17.p38γ-/-小鼠的皮质切片上磷酸-s214tau(ps214tau)和神经丝(nf)的免疫荧光染色。比例尺，50μm。
191.图8.p38γ
ca
小鼠中神经元p38γ和tau t205磷酸化水平的升高不会增加人tau的毒性。(a)是一个示意图：人野生型tau转基因小鼠(alz17)与p38γ
ca
(γca)小鼠杂交，以实现神经元中活性t205 tau激酶p38γ水平的升高。(b)是一个图像，显示来自alz17.p38γ
ca
，alz17(10月龄)的组织切片上ha(p38γ
ca
)和人tau的免疫荧光。dapi，细胞核。比例尺，10μm。(n＝4)。(c)是一个图像，显示裂解物的pt205 tau、psd-95、p38γ、ha(p38γ
ca
)和snap25的免疫印迹，裂解物来自alz17.p38γ
/
、alz17.p38γ-/-和alz17.p38γ
ca
皮质的粗突触体(cs)制备物。来自alz17.p38γ
/
皮质的全脑裂解物(w)和非突触体部分(ns)显示为非富集对照样品。#，非特异带。(n＝3-4)。(d)是一个图像，显示来自alz17和alz17.p38γ
ca
大脑(10月龄)的皮质组织切片上磷酸t205 tau、p38γ和人tau的免疫荧光。比例尺，10μm。(n＝4)。(e)是一个图像，显示20月龄alz17和aiz17.p38γ
ca
小鼠的皮质切片的浸银染色。比例尺，100μm。(n＝4)。(f-h)显示在10月龄alz17、alz17.p38γ
ca
小鼠以及p38γ
ca
和非转基因对照小鼠中使用莫里斯水迷宫评估的记忆/认知表现。(n＝10)。(f)是一个图表，显示莫里斯水迷宫采集阶段：具有所示基因型的小鼠在第1-7天的逃避潜伏期。(g)是一个图表，通过线性回归斜率显示学习曲线比较。(h)是一个图表，显示在第8天探索试验期间具有所示基因型的小鼠的莫里斯水迷宫象限占有。数据以平均值
±
s.e.m.表示。**p＜0.01*p＜0.05ns，不显著。(双因素anova用于e；anova用于f)。
192.图9.在具有taut205基因组编辑等位基因的app23小鼠中进行认知测试的淀粉样蛋白负荷和控制参数。(a)是一个图像，显示app23.taut205
t/t
和app23.taut205
a/a
小鼠的皮质中磷酸-t205 tau和人app(6e10)的免疫荧光染色。dapi，细胞核标记物。比例尺，50μm。(n＝6)。(b)是一个图表，显示app23.taut205
t/t
(n＝40)、app23.taut205
t/a
(n＝62)和app23.taut205
a/a
(n＝55)的生存曲线。(c)是一个图表，显示app23.taut205
t/t
(n＝32)、app23.taut205
t/e
(n＝71)和app23.taut205
e/e
(n＝38)的生存曲线。(d)是一个图表，显示莫里斯水迷宫采集阶段：在app23.taut205
t/t
和app23.taut205
a/a
以及taut205
t/t
和taut205
a/a
小鼠中进行的视觉提示试验。(e)是一个图表，显示在app23.taut205
t/t
和app23.taut205
e/e
以及taut205
t/t
和taut205
e/e
小鼠中进行的莫里斯水迷宫视觉提示试验。(f)是一个图表，显示莫里斯水迷宫恢复试验：app23.taut205
t/t
和app23.taut205
e/e
以及taut205
t/t
和taut205
e/e
小鼠在探索试验期间的游泳速度。数据以平均值
±
s.e.m.表示。
193.图10.具有表达aav的神经元tauwt或taut205a的app23.tau-/-.p38γ
ca
中病毒转基因的免疫检测和认知测试的控制参数。(a)是一个图像，显示注射所示aav的app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠皮质切片上p38γ
ca
(ha)和人tau的免疫荧光染色。dapi，细胞核标记物。比例尺，50μm。(n＝5)。(b)是图像，显示注射所示aav的app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠皮质中的磷酸化t205 tau和人app(6e10)的免疫荧光染色。dapi，细胞核标记物。比例尺，50μm。(n＝5)。图10(c-g)显示在具有tauwt或taut205a神经元表达的app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠中使用莫里斯水迷宫评估的记忆/认知表现。(n如标签图例所示)。(c、d、e)是显示采集阶段的图表：所有实验组(c)、非转基因tau-/-和tau-/-.p38γ
ca
小鼠(d)以及具有所示aav介导tauwt或taut205a表达的app23.tau-/-和app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠(e)的逃避潜伏期。(f)是显示采
集阶段的图表：所有实验组的学习曲线比较。(g)是显示莫里斯水迷宫的图表：第8天的探索试验结果。q1，靶象限。虚线，随机占用率阈值。数据以平均值
±
s.e.m.表示。**p＜0.01*p＜0.05ns，不显著。(双因素anova用于c、d、e；anova用于f、g)。
194.图11是一个图表，显示野生型小鼠、表达gfp的tau58突变小鼠或表达组成型活性p38γ(cap38γ)的tau58突变小鼠在小鼠迷宫开臂中花费的时间。
195.图12是一个图表，显示野生型小鼠、表达gfp的tau58突变小鼠或表达组成型活性p38γ(cap38γ)的tau58突变小鼠在小鼠迷宫闭合臂中花费的时间以及闭合臂进入次数。
196.图13是一个图表，显示野生型小鼠、表达gfp的tau58突变小鼠或表达组成型活性p38γ(cap38γ)的tau58突变小鼠在小鼠迷宫中心花费的时间以及小鼠在迷宫中行进的距离。
197.图14显示成熟野生型人p38γ的氨基酸序列。
198.图15显示编码成熟人p38γ的核苷酸序列实例。
199.图16显示组成型活性p38γ突变体(d179a)(p38γ
ca
)实例的氨基酸序列。
200.图17显示成熟野生型全长人tau的氨基酸序列。tau内的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr用粗体表示，t205和s422用下划线标出。
201.图18显示tau的模拟磷酸化实例的氨基酸序列，其中野生型tau第205位的苏氨酸变为谷氨酸(t205e)。
202.图19是用所示抗体探测的aav-p38g
ca
和对照(aav-gfp)处理的tau58/2小鼠大脑提取物的蛋白质印迹图。
具体实施方式
203.本发明涉及治疗tau蛋白病的方法。tau蛋白病是一种与受试者脑神经元中tau蛋白聚集有关的病症，且通常与神经原纤维沉积有关，例如由tau蛋白形成的神经原纤维缠结。据信，在tau蛋白病中，tau蛋白会随时间聚集，导致形成含tau的神经原纤维沉积，最终导致神经元死亡。通常，tau蛋白病是一种与认知能力下降相关的神经退行性疾病。tau蛋白病的实例包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、进行性核上性麻痹、原发性年龄相关性tau蛋白病、慢性创伤性脑病、连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆、匹克病、球状胶质tau蛋白病、帕金森病。
204.在阿尔茨海默病(ad)和其他神经退行性疾病的早期，神经元的兴奋性毒性被认为是通过刺激tau依赖性信号传递复合物(如psd-95/tau/fyn受体复合物)引起的。本发明人先前已经表明，tau在特定位点的磷酸化导致psd-95/tau/fyn受体复合物破坏，从而预防由psd-95/tau/fyn信号传递复合物介导的兴奋性毒性和神经退行性疾病的进一步发展。
205.然而，在晚期ad和其他tau蛋白病中，tau毒性与通过tau依赖性信号传递复合物(如ptd-95/tau/fyn受体复合物)的信号传递无关，并且认为神经元毒性和死亡是由聚集的过度磷酸化tau介导的。在本发明之前，认为晚期ad和其他tau蛋白病是不可治疗的，因为一旦tau聚集发生，tau聚集的效应就无法停止或逆转，因此一旦tau聚集发生，神经元损伤和死亡是不可避免的。
206.本发明人已经发现，促进受试者的的tau的序列sspgspgtpgsrsr(seq id no：7)中苏氨酸(例如最长的人tau异构体第205位苏氨酸残基(t205))的磷酸化，或突变野生型tau
以在受试者的神经元中表达在t205处已经被磷酸化的磷酸模拟物的tau，导致tau蛋白病的认知功能改善。本文使用的用于tau的氨基酸编号基于具有441个氨基酸的最长人tau异构体的氨基酸编号，通常称为2n4r tau(并且在本文中也称为全长人tau)。最长的人tau异构体(2n4r)的氨基酸序列如图17所示，由seq id no：1表示。tau的氨基酸编号基于包含441个氨基酸(seq id no：1)的全长人tau异构体。
207.如实例中所述，本发明人已经发现，在晚期ad小鼠模型中，人野生型tau在205位(苏氨酸)的磷酸化可以改善认知功能，并且在一些情况下可以逆转tau蛋白病的影响。
208.如在实例中进一步所述，发明人已经发现，即使当tau蛋白病的症状仅由tau蛋白聚集引起时，也可以减轻或逆转tau蛋白病的症状。在这方面，发明人已经表明，在tau聚集是导致疾病进展的唯一因素的小鼠模型中，tau聚集产生的影响可以通过t205的磷酸化来逆转或降低。
209.因此，在一个方面，提供了治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，其包括向受试者施用有效量的制剂，该制剂：
210.(a)促进tau在tau的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau第205位的苏氨酸)磷酸化；和/或
211.(b)引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸)已经被磷酸化的tau。
212.在另一方面，提供了改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的方法，其包括向受试者施用有效量的制剂，该制剂：
213.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸)的磷酸化；和/或
214.(b)引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau第205位的苏氨酸)已经被磷酸化的tau。
215.认知能力是大脑处理、检索和/或存储信息的能力。认知能力的实例是记忆力。一个实施方案提供了改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者记忆力的方法，其包括向受试者施用有效量的制剂，该制剂：
216.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸处)的磷酸化；和/或
217.(b)引入tau蛋白的磷酸模拟物，其在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸)已经被磷酸化。
218.认知能力的改善是受试者的认知能力相对于用本文所述方法治疗前的受试者的认知能力的改善或增加或增强。记忆力的改善是指受试者的记忆力相对于用本文所述方法治疗前的受试者的记忆力改善或增加或增强。
219.如实例中所述，发明人还发现，在tau蛋白病小鼠模型中，与未经治疗的小鼠相比，经活化p38γ(其促进全长人tau中t205磷酸化)治疗的小鼠中，不溶性或聚集性tau中的磷酸化丝氨酸422(ps422)水平降低。
220.因此，一方面提供在患有tau蛋白病的受试者中减少人tau蛋白第422位丝氨酸磷酸化的方法，该方法包括对受试者施用有效量的制剂，该制剂：
221.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全
长人tau的第205位苏氨酸)的磷酸化；和/或
222.(b)引入模磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸)已经被磷酸化的tau。
223.另一方面提供治疗或预防受试者中与人tau第422位丝氨酸磷酸化相关的疾病或病症的方法，该方法包括对受试者施用有效量的制剂，该制剂：
224.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau第205位的苏氨酸)的磷酸化；和/或
225.(b)引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸)已经被磷酸化的tau。
226.人tau第422位丝氨酸的磷酸化与神经原纤维缠结的形成有关。
227.因此，另一方面提供减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的方法，其包括施用有效量的制剂，该制剂：
228.(a)促进tau的磷酸化，其为tau的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸)的磷酸化；和/或
229.(b)引入磷酸化tau的磷酸模拟物，其中所述磷酸化tau是在tau的序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸)已经被磷酸化的tau。
230.在一个实施方案中，该方法包括给受试者施用有效量的制剂，其促进tau的磷酸化，其为tau的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸的磷酸化。在一个实施方案中，tau的序列sspgspgtpgsrsr中的苏氨酸是全长人tau的第205位苏氨酸(t205)。
231.在一个实施方案中，该方法包括施用有效量的制剂，其促进受试者的神经元(通常是所述受试者的脑神经元)中的tau的磷酸化，其为tau的氨基酸序列sspgspgtpgsrsr中苏氨酸(例如在全长人tau的第205位苏氨酸)的磷酸化。
232.在一个实施方案中，通过施用有效量的制剂(其提高已在t205处被磷酸化的tau)来治疗受试者。
233.在一个实施方案中，通过施用导致模拟磷酸化的tau pt205表达的制剂来治疗受试者。
234.在全长人tau的第205位苏氨酸处已经被磷酸化的tau在本文中也称为tau pt205。
235.在一个实施方案中，通过施用有效量的制剂来治疗受试者，该制剂将编码野生型tau(通常是内源性野生型tau)的一个或多个基因转化为编码tau pt205的磷酸模拟物的基因。在一个实施方案中，tau pt205的模拟磷酸物是包含氨基酸序列sspgspgxpgsrsr(seq id no：8)的tau，其中x是e或d。在一个实施方案中，tau pt205的磷酸模拟物是t205e或t205d。
236.如本文所用，磷酸化tau的磷酸模拟物是tau的变体，其作用方式与磷酸化野生型tau的方式相同或基本上相同。因此，模拟磷酸化的pt205是tau的变体，其表现出与在205位苏氨酸处被磷酸化的全长野生型tau相同或相似的效果。如本文所用，tau的变体是包含野生型tau(通常是全长野生型tau(例如，seq id no：1))的一个或更多个氨基酸取代、插入或缺失的tau蛋白。
237.应理解，tau pt205的磷酸模拟物不一定包含t205处的突变，并且可能包含在tau的其他位点上的一个或更多个氨基酸残基的取代、删除或插入，其导致突变的tau具有与
t205e相同或相似的效应。
238.该制剂可包括，例如核酸、核酸类似物、蛋白质、肽或小分子或其组合。通常，制剂的施用将制剂引入受试者的神经元中。更通常地，制剂的施用将制剂引入受试者的脑神经元中。
239.在一些实施方案中，制剂包含引入受试者神经元中的核酸。在一些实施方案中，核酸在神经元中转录。在一些实施方案中，核酸在神经元中转录和翻译。在一些实施方案中，核酸包括dna。在一些实施方案中，核酸包括rna。
240.在一些实施方案中，制剂可以穿过血脑屏障，或可以配制为穿过血脑屏障。
241.在一个实施方案中，tau蛋白病是由tau聚集介导的阿尔茨海默病。
242.在一个实施方案中，tau蛋白病是由tau聚集介导的额颞叶痴呆。
243.在一个实施方案中，tau蛋白病是皮质基底节变性。
244.在一个实施方案中，tau蛋白病是进行性核上性麻痹。
245.在一个实施方案中，tau蛋白病是原发性年龄相关性tau蛋白病。
246.在一个实施方案中，tau蛋白病是慢性创伤性脑病。
247.在一个实施方案中，tau蛋白病是连锁于17号染色体伴帕金森病的额颞叶痴呆。
248.在一个实施方案中，tau蛋白病是匹克病。
249.在一个实施方案中，tau蛋白病是球状胶质tau蛋白病。
250.在一个实施方案中，tau蛋白病是帕金森病。
251.如本文所用，“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人灵长类动物、绵羊、小鼠、大鼠、犬、猫、马、牛、猪或任何其他可能患有tau蛋白病的哺乳动物。通常，受试者是人类。
252.在一个实施方案中，通过施用有效量的制剂来治疗受试者，该制剂提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性。p38γ，也称为erk6、sapk3和mapk12，是一种丝裂原活化蛋白激酶(map激酶)。在一个实施方案中，p38γ来自哺乳动物。例如，p38γ可来自人类、小鼠、犬、猫、猪、牛、大鼠、非人灵长类动物、山羊、绵羊。通常，p38γ是人p38γ。通过基序tgy中酪氨酸和苏氨酸残基的磷酸化激活野生型p38γ。野生型p38γ在激活后磷酸化tau。p38γ由丝裂原活化蛋白激酶mkk3和mkk6激活，而mkk3和mkk6叉被mapk激酶map3k磷酸化而激活。
253.如实例中所述，发明人已发现在晚期阿尔茨海默病小鼠模型中，通过p38γ在野生型人tau的t205处的磷酸化导致认知功能改善。发明者已经表明，通过将p38γ或p38γ的组成型活性变体引入患有晚期ad的小鼠的神经元中，记忆力得到改善。
254.一个实施方案提供治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，其包括施用提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂。
255.一个实施方案提供改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的方法，其包括施用有效量的提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂。
256.一个实施方案提供在患有tau蛋白病的受试者中减少人tau蛋白第422位丝氨酸磷酸化的方法，其包括施用有效量的提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂。
257.一个实施方案提供治疗或预防受试者中与人tau第422位丝氨酸磷酸化相关的tau
蛋白病的方法，其包括施用有效量的提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂。
258.一个实施方案提供减少或预防受试者神经元中tau聚集的方法，其包括施用有效量的提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂。
259.一个实施方案提供减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的方法，其包括施用有效量的提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂。
260.提高神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂可能是制剂：(a)提高神经元中p38γ的量，通常是活性p38γ的量；和/或(b)提高神经元中p38γ变体的量，通常是p38γ活性变体的量；和/或(c)提高神经元中p38γ活化的量；和/或(d)如果该变体不是活性变体，则提高神经元中p38γ变体活化的量。如本文所用，“p38γ活性”是活化的p38γ在tau的序列sspgspgtpgsrsr中磷酸化苏氨酸tau的活性，并且在野生型全长人tau的情况下，在t205处磷酸化tau。“p38γ变体的活性”指与p38y活性相同或基本相似的p38γ变体的活性。p38γ变体可以在未活化的情况下具有p38γ活性(例如，活性变体，例如组成型活性变体)，或者可以在活化后表现出p38γ活性。当治疗后神经元中p38γ活性量相对于治疗前神经元中p38γ活性量增加时，神经元中的p38γ活性升高。当治疗后神经元中变体活性量相对于治疗前神经元中变体活性量增加时，神经元中p38γ变体活性升高。p38γ活性或p38γ变体的活性可以通过施用有效量的制剂来提高，其提高：
261.(a)神经元中内源性p38γ的量，例如增加内源性p38γ的表达(转录和/或翻译)；和/或
262.(b)神经元中外源性p38γ的量；和/或
263.(c)神经元中p38γ变体的量；和/或
264.(d)神经元中内源性p38γ、外源性p38γ和/或p38γ变体的活化。
265.在一个实施方案中，p38γ活性或p38γ变体的活性通过施用有效量的制剂来提高，该制剂提高神经元中外源性p38γ或其变体的量。可以通过将p38γ或其变体引入神经元，或通过将能够表达p38γ或其变体的核酸引入神经元来提高外源p38γ或其变体的量。
266.因此，在一个实施方案中，提高受试者神经元中p38γ活性或p38γ变体活性的制剂可包含受试者神经元中的p38γ蛋白或其变体，或能够表达p38γ或其变体的核酸。本文所述实例中使用的编码全长野生型人p38γ的核酸序列和全长野生型人p38γ的氨基酸序列如图15(seq ld no：2)和图14(seq id no：3)所示。人p38γ的天然存在异构体和变体也是已知的(例如genbank登记号np_001290181，cr456515)。设想在t205处磷酸化tau的p38γ天然异构体或变体可用于本文所述的方法中。
267.在一个实施方案中，提高p38γ活性或p38γ变体活性的制剂包含编码p38γ或其变体的核酸。本领域技术人员将能够确定适当的编码p38γ或其变体的氨基酸序列的核酸序列。例如，编码p38γ的核酸可以包括在与人p38γ的野生型编码序列(seq id no：3)约60％至100％同一性范围的核酸序列。例如，使用本文所述的比对程序之一，使用标准参数，编码p38γ的核酸可以具有与p38γ的野生型编码序列至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。本领域技术人员将认识到，通过考虑密
码子简并性、阅读框定位等，可以适当地调节这些值以确定由核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。
268.在一个实施方案中，提高p38γ活性或p38γ变体活性的制剂包含p38γ变体。在一个实施方案中，提高p38γ活性或p38γ变体活性的制剂包含编码p38γ变体的核酸。如本文所用，p38γ变体是通过一个或更多个氨基酸取代、添加或缺失而不同于野生型人p38γ蛋白质的蛋白质，并且其能够在序列sspgspgtpsr中苏氨酸处磷酸化tau，例如在苏氨酸残基t205处磷酸化野生型人tau。p38γ变体在残基t205处磷酸化野生型人tau。在一个实施方案中，p38γ变体包含与野生型人p38γ的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，p38γ变体包含与seq id no：3表示的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的氨基酸序列。
269.如本文所用，与多肽有关的的“同一性％”或多肽的“与氨基酸序列的同一性％”是指当在特定的比较窗口内进行最大对应性比对时，两个序列中相同的残基的百分比，如通过序列比对算法或通过目视检查所测量的。
270.用于确定两个多肽之间同一性％的序列比对算法是本领域已知的。此类算法的实例有myers和miller(1988)的算法；smith等人(1981)的局部同源性算法；needleman和wunsch(1970)的同源比对算法；pearson和lipman(1988)的相似性搜索方法；以及karlin和altschul(1990)的算法，karlin和altschul改良的算法(1993)。用于确定两个多肽之间同一性％的这些算法的计算机实现包括，例如：clustal(从intelligenetics，mountain view，calif.获得)(pearson等人(1994))；align程序(2.0版)和wisconsin genetics软件包第8版中的gap、bestfit、blast、fasta和tfasta(获自genetics computer group(gcg)，575science drive，madison，wis.，usa)。
271.在一些实施方案中，p38γ的变体可以包括p38γ的一部分。
272.在一些实施方案中，p38γ的变体可以包括p38γ的一部分，但在其他方面不同于野生型p38γ。在这方面，发明人设想p38γ的变体可包括嵌合p38γ蛋白，其中p38γ的相互作用基序与其他激酶的部分融合，例如map激酶或其他丝氨酸/苏氨酸激酶，或携带突变以改变其活性的其他激酶的变体。例如，p38γ的变体可包括p38γ的羧基末端部分，其与选自由p38α、p38β和p38δ或携带改变其活性的突变的p38α、p38β和p38δ变体组成的组的激酶的n末端部分融合。在一些实施方案中，p38γ的变体是嵌合p38γ。在各种实施方案中，嵌合p38γ包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：etpl(seq id no：9)、ketpl(seq id no：10)、sketpl(seq id no：11)、vsketpl(seq id no：12)、rvsketpl(seq id no：13)、arvsketpl(seq id no：14)、garvsketpl(seq id no：15)、lgarvsketpl(seq id no：16)、qlgarvsketpl(seq id no：17)、rqlgarvsketpl(seq id no：18)、prqlgarvsketpl(seq id no：19)、pprqlgarvsketpl(seq id no：20)、kpprqlgarvsketpl(seq id no：21)、fkpprqlgarvsketpl(seq id no：22)、sfkpprqlgarvsketpl(seq id no：23)、lsfkpprqlgarvsketpl(seq i d no：24)、vlsfkpprqlgarvsketpl(seq id no：25)、evlsfkpprqlgarvsketpl(seq id no：26)、kevlsfkpprqlgarvsketpl(seq id no：27)、ykevlsfkpprqlgarvsketpl(seq id no：28)、tykevlsfkpprqlgarvsketpl(seq id no：29)、vtykevlsfkpprqlgarvsketpl(seq id no：30)、rvtykevlsfkpprqlgarvsketpl(seq id no：
31)、krvtykevlsfkpprqlgarvsketpl(seq id no：32)、etal(seq id no：33)、ketal(seq id no：34)、pketal(seq id no：35)、vpketal(seq id no：36)、rvpketal(seq id no：37)、arvpketal(seq id no：38)、garvpketal(seq id n0：39)、lgarvpketal(seq id no：40)、qlgarvpketal(seq id no：41)、rqlgarvpketal(seq id no：42)、prqlgarvpketal(seq id no：43)、pprqlgarvpketal(seq id no：44)、kpprqlgarvpketal(seq id no：45)、fkpprqlgarvpketal(seq id no：46)、sfkpprqlgarvpketal(seq id no：47)、lsfkpprqlgarvpketal(seq id no：48)、vlsfkpprqlgarvpketal(seq id no：49)、evlsfkpprqlgarvpketal(seq id no：50)、kevlsfkpprqlgarvpketal(seq id no：51)、ykevlsfkpprqlgarvpketal(seq id no：52)、tykevlsfkpprqlgarvpketal(seq id no：53)、vtykevlsfkpprqlgarvpketal(seq id no：54)、rvtykevlsfkpprqlgarvpketal(seq id no：55)和krvtykevlsfkpprqlgarvpketal(seq id no：56)。
273.在一个实施方案中，p38γ的变体是p38γ的活性变体。p38γ的活性变体是一种不需要通过丝裂原活化蛋白激酶mkk3和mkk6活化才能显示p38γ活性的变体。在一个实施方案中，p38γ的活性变体是p38γ的组成型活性变体。p38γ的组成型活性变体是p38γ的变体，其持续具有活性，因此不需要通过丝裂原活化蛋白激酶mkk3和mkk6活化。通常，组成型活性变体包含一个或更多个氨基酸取代，其导致连续的活性。在各种实施方案中，p38g的组成型活性变体包括氨基酸序列：
274.[0275][0276]
在一个实施方案中，p38γ的组成型活性变体包含野生型人p38γ的d179a的氨基酸取代。p38γ的组成型活性变体实例的氨基酸序列如图16所示(seq id no：4)。
[0277]
在一个实施方案中，提供了治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，其包括在受试者的神经元中施用有效量的表达p38γ或其变体(通常是p38γ的组成型活性变体)的核酸。通常，tau蛋白病与人tau蛋白第422位丝氨酸的磷酸化有关。
[0278]
在一个实施方案中，提供了改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力(例如记忆力)，其包括在受试者的神经元中施用有效量的表达p38γ或其变体(通常是p38γ的组成型活性变体)的核酸。通常，tau蛋白病与人tau蛋白第422位丝氨酸的磷酸化有关。
[0279]
在一个实施方案中，提供了治疗受试者晚期阿尔茨海默病的方法，其包括在受试者的神经元中施用有效量的表达p38γ或其变体(通常是p38γ的组成型活性变体)的核酸。通常，晚期阿尔茨海默病与人tau第422位丝氨酸的磷酸化有关。
[0280]
在一个实施方案中，提供了治疗或预防受试者晚期额颞叶痴呆的方法，其包括在受试者的神经元中施用有效量的表达p38γ或其变体(通常是p38y的组成型活性变体)的核酸。通常，额颞叶痴呆与人tau蛋白第422位丝氨酸的磷酸化有关。
[0281]
在一个实施方案中，提供了在患有tau蛋白病的受试者中减少人tau第422位丝氨酸磷酸化的方法，其包括在受试者的神经元中施用有效量的表达p38γ或其变体(通常是p38γ的组成型活性变体)的核酸。
[0282]
在一个实施方案中，提供了一种治疗或预防受试者中与人tau第422位丝氨酸磷酸化相关的tau蛋白病的方法，其包括在受试者的神经元中施用有效量的表达p38γ或其变体(通常是p38γ的组成型活性变体)的核酸。
[0283]
另一个实施方案提供减少或预防受试者神经元中tau聚集的方法，其包括在受试者的神经元中施用有效量的表达p38γ或其变体(通常是p38γ的组成型活性变体)的核酸。
[0284]
另一个实施方案提供减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的方法，其包括在受试者的神经元中施用有效量的表达p38γ或其变体(通常是p38γ的组成型活性变体)的核酸。
[0285]
在另一个实施方案中，通过施用向受试者的神经元中引入tau pt205的磷酸模拟物的制剂来治疗受试者。在一种形式中，引入tau pt205的磷酸模拟物的制剂是将磷酸模拟物突变引入野生型tau，通常是引入内源性野生型tau的制剂。如本文所用，tau pt205的磷酸模拟物是包含一个或更多个氨基酸取代、插入或缺失的tau变体，且其功能与未取代的野生型人tau在未取代的tau在苏氨酸205处磷酸化后的功能相同或基本相同。在一个实施方案中，磷酸模拟物包含磷酸模拟物取代。
[0286]
如示例中所述，发明人已经表明，在ad小鼠模型中，在神经元中表达tau的t205e变体可改善认知功能和存活率。tau的t205e变体是t205处磷酸化(pt205)的tau的磷酸模拟物。磷酸模拟物取代是蛋白质中的氨基酸取代，其导致蛋白质在未取代的蛋白质磷酸化后以与未取代的蛋白质相同或基本相同的方式起作用。模拟磷酸物取代的磷酸化tau是在tau的位点上的氨基酸取代，其导致在野生型tau在特定位点磷酸化后，以与野生型tau相同或基本相同的方式发挥作用的tau蛋白。
[0287]
在一个实施方案中，该方法包括治疗受试者以引入tau的磷酸模拟物，其包括tau在t205处的磷酸模拟物取代。
[0288]
在一个实施方案中，tau的模拟磷酸物取代是在tau的第205位处苏氨酸取代为谷氨酸或天冬氨酸(t205e或t205d)，具有基于包含441个氨基酸的最长人tau异构体的氨基酸编号。全长野生型人tau(seq id no：1)和tau t205e(seq id no：5)的氨基酸序列见图17和图18。
[0289]
通常，tau的变体是人tau的变体。在其他实施方案中，tau变体可以是来自非人哺乳动物的tau变体。例如，tau变体可以是来自小鼠、犬、猫、猪、牛、大鼠、非人灵长类动物、山羊、绵羊的tau变体。
[0290]
在一个实施方案中，提供了治疗或预防受试者tau蛋白病的方法，其包括在受试者神经元中施用包含导致tau产生的核苷酸序列的核酸，所述tau与野生型人tau的不同之处在于第205位的苏氨酸被谷氨酸或天冬氨酸取代(t205e或t205d)。
[0291]
在一个实施方案中，提供了改善患有与tau蛋白病相关的认知受损的受试者认知能力的方法，其包括在受试者神经元中施用包含导致tau产生的核苷酸序列的核酸，所述tau与野生型人tau的不同之处在于第205位的苏氨酸被谷氨酸或天冬氨酸取代(t205e或t205d)。
[0292]
在一个实施方案中，提供了治疗受试者晚期阿尔茨海默病的方法，其包括在受试者神经元中施用包含导致tau产生的核苷酸序列的核酸，所述tau与野生型人tau的不同之处在于第205位的苏氨酸被谷氨酸或天冬氨酸取代(t205e或t205d)。
[0293]
在一个实施方案中，提供了治疗受试者晚期额颞叶痴呆的方法，其包括在受试者神经元中施用包含导致tau产生的核苷酸序列的核酸，所述tau与野生型tau的不同之处在于205位(t205e或t205d)的苏氨酸被谷氨酸或天冬氨酸取代。
[0294]
在一个实施方案中，提供了在患有tau蛋白病的受试者中减少人tau蛋白第422位丝氨酸磷酸化的方法，其包括在受试者神经元中施用包含导致tau产生的核苷酸序列的核酸，所述tau与野生型tau的不同之处在于第205位的苏氨酸被谷氨酸或天冬氨酸取代(t205e或t205d)。
[0295]
在一个实施方案中，提供了治疗或预防受试者中与人tau第422位丝氨酸磷酸化相关的tau蛋白病的方法，其包括在受试者神经元中施用包含导致tau产生的核苷酸序列的核酸，所述tau与野生型人tau的不同之处在于第205位的苏氨酸被谷氨酸或天冬氨酸取代(t205e或t205d)。
[0296]
另一个实施方案提供减少或预防受试者神经元中tau聚集的方法，其包括在受试者神经元中施用包含导致tau产生的核苷酸序列的核酸，所述tau与野生型tau的不同之处在于第205位的苏氨酸被谷氨酸或天冬氨酸取代(t205e或t205d)。
[0297]
另一个实施方案提供减少或预防受试者神经元中神经原纤维缠结的方法，其包括在受试者神经元中施用包含导致tau产生的核苷酸序列的核酸，所述tau与野生型tau的不同之处在于第205位的苏氨酸被谷氨酸或天冬氨酸取代(t205e或t205d)。
[0298]
在一个实施方案中，核酸包含编码tau t205e或t205d的核苷酸序列。
[0299]
在一些实施方案中，可以通过将突变引入到神经元中编码野生型tau的核苷酸序列中，将磷酸化tau的磷酸模拟物引入到神经元中。通常，将突变引入神经元的内源性tau基因中。因此，在一个实施方案中，核酸是基因编辑系统或基因编辑系统的一部分，或编码基因编辑系统或基因编辑系统的一部分，用于在受试者的神经元中将模拟磷酸物突变引入编码野生型tau的核苷酸序列中，通常引入内源性tau基因中。在一个实施方案中，核酸包括基因编辑系统，或基因编辑系统的一部分，用于在受试者的神经元中将模拟磷酸物突变引入编码野生型tau的核苷酸序列中，通常引入内源性tau基因中。在一个实施方案中，核酸包含编码tau基因编辑系统或其部分的核苷酸序列，其将突变引入野生型tau基因以引起tau的模拟磷酸物表达。通常，tau磷酸模拟物是t205e或t205d。在一个实施方案中，基因编辑系统是crispr/cas复合物，通常是crispr/cas9复合物，其将谷氨酸或天冬氨酸取代人tau第205位苏氨酸引入到tau基因中。通常，编码基因编辑系统或其一部分的核酸包含导向rna或编码导向rna(grna)的核酸。通常，grna是单导向rna或一对导向rna。
[0300]
如本文所用，术语“tau基因”与“mapt基因”具有相同的含义。
[0301]
在其中制剂包含能够在受试者的神经元中表达p38γ或其变体或tau变体或基因编辑系统的核酸的实施方案中，编码p38γ或其变体、或tau变体或基因编辑系统的核酸序列通常可操作地连接到调节序列，以在受试者的神经元中直接表达p38γ或其变体、或tau变体或基因编辑系统。能够在受试者的神经元中表达p38γ或其变体、或tau变体或基因编辑系统的核酸可包括包含p38γ或其变体、或tau变体的编码序列或编码基因编辑系统的表
达盒。表达盒是包含编码序列和调控序列的核酸，其共同作用以在细胞中表达由编码序列编码的蛋白质。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的dna或rna序列。它可以构成“不间断的编码序列”，即缺少内含子，例如在cdna中，或者它可以包括一个或更多个由适当剪接接头结合的内含子。
[0302]
表达盒通常包括调控序列。“调控序列”是位于编码序列上游(5
′
非编码序列)、内部或下游(3
′
非编码序列)的核苷酸序列，且其影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或翻译。调控序列是本领域已知的，且可以包括例如转录调控序列，如启动子、增强子、翻译前导序列、内含子和多聚腺苷酸化信号序列。编码序列通常可操作地连接到启动子。启动子是在某些条件下能够结合rna聚合酶并启动通常位于该启动子下游(3
′
方向)的编码序列转录的dna区域。编码序列还可操作地连接到终止信号。表达盒还可以包括正确翻译编码序列所需的序列。包括编码序列的表达盒可以是嵌合的。本文所用的“嵌合”载体或表达盒是指包括来自至少两个不同物种的核酸序列的载体或盒，或具有来自相同物种的核酸序列，其以“天然”或野生型物种中不存在的方式连接或关联。表达盒中的编码序列可以受组成型启动子或可调控启动子的控制，其仅在特定组织或细胞类型中或当宿主细胞暴露于某些特定刺激时启动转录。例如，在包含编码p38γ的核酸的表达盒中，编码序列可以可操作地连接到p38γ基因非天然的启动子，例如在神经元中表达编码序列或在神经元中可诱导的启动子。在一个实施方案中，启动子是神经启动子。合适的神经启动子的实例包括突触素(syn)、钙离子-钙调素依赖性蛋白激酶(camkii)、微管蛋白αl(ta1)、神经元特异性烯醇化酶(nse)、血小板衍生生长因子β链(pdgf)、mfp、dox、gfap、前脑啡肽原、多巴胺β-羟化酶(dβh)、催乳素、鸡β肌动蛋白、朊病毒蛋白、鼠thy1.2、髓磷脂碱性启动子、或上述任何一种与增强子结合，例如部分巨细胞病毒启动子。可用于在神经元中表达核酸序列的其他启动子的实例包括sv40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(ltr)启动子；腺病毒主要晚期启动子(ad-mlp)；单纯疱疹病毒(hsv)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子，例如cmv立即早期启动子区(cmvie)、劳氏肉瘤病毒(rsv)启动子、合成启动子、杂交启动子等。诱导型或可控型启动子包括，例如，在存在或不存在米非司酮、多西环素、四环素或他莫昔芬时其转录活性被改良的启动子。
[0303]
当编码蛋白质的核酸(编码序列)相对于调控序列排列以允许蛋白质在细胞中表达时，将其与调控序列可操作地连接。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则启动子可操作地连接到编码区。
[0304]
如本文所用，核酸序列的“表达”是指包含编码序列的核酸序列的转录和/或翻译，以产生由编码序列编码的多肽，或包含编码基因编辑序列(例如crispr/cas序列)的序列。
[0305]
在一个实施方案中，制剂是载体。在这种载体中，将编码p38γ或其变体、或tau的变体、或tau基因编辑系统的核酸序列、或包含这种序列的表达盒插入适当的载体序列中。术语“载体”指适于将基因转移到宿主细胞(如神经元)的核酸。术语“载体”包括质粒、柯斯质粒、裸dna、病毒载体等。在一个实施方案中，载体是质粒载体。质粒载体是可插入额外序列的双链环状dna分子。质粒可以是表达载体。质粒和表达载体是本领域已知的，并在例如sambrook et al.molecular cloning：a laboratory manual，4th ed.vol.1-3，cold spring harbor，n.y.(2012)中描述。
[0306]
在一些实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体包含病毒序列，其根据病毒载体允
许病毒颗粒产生和/或整合到宿主细胞基因组中和/或病毒复制。可与本文所述方法和组合物一起使用的病毒载体包括能够将核酸引入神经元(通常为大脑神经元)的任何病毒载体。病毒载体的实例包括腺病毒载体；慢病毒载体；腺相关病毒载体；狂犬病病毒载体；单纯疱疹病毒载体；sv40；多瘤病毒载体；痘病毒载体。
[0307]
在一个实施方案中，病毒载体是用于包装在腺相关病毒中的腺相关病毒(aav)载体。在一个实施方案中，aav载体是选自由以下组成的组的血清型：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav6.2、aav7、aav8、aav9、aavrh10、aavrh20、aavrh39、aavrh43和aavcy5载体或其变体。在一个实施方案中，病毒载体是血清型aav1、aav9、aavrh10或aavcy5。在一个实施方案中，aav载体的血清型是aav1。在另一个实施方案中，aav载体的血清型是aav9。在另一个实施方案中，aav载体的血清型是aavrh10。在另一个实施方案中，aav载体的血清型是aavcy5。使用重组aav将核酸引入细胞是本领域已知的，并在例如us20160038613；grieger和samulski(2005)adeno-associated virus as a gene therapyvector：vector development，production and clinical applications，advances in biochemical engineering/biotechnology 99：119-145中描述；生产重组aav的方法是本领域已知的，并在例如harasta et al(2015)neuropsychopharmacology 40：1969-1978中描述。w02017/147654中描述了用于在神经元细胞中表达p38γ和p38γca的腺相关病毒载体的实例。
[0308]
在另一个实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。慢病毒载体的生产和使用方法是本领域已知的，并在例如naldini et al.(1996)in vivo gene delivery and stab le transduction of nondividing cells by a lentiviral vector，science，272：263-267；lois et al.(2002)germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors，science，295：868-872；vogel et al(2004)，a singlelentivirus vector mediates doxycycline-regulated expression of transgenes in the brain.hum gene ther.2004；15(2)：157-165中描述。
[0309]
也可以考虑将腺病毒用于核酸制剂的递送。因此，在另一个实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒载体是本领域已知的，并在例如kozarsky and wilson，current opinion in genetics and development 3：499-503(1993)；southgate et al.(2008)gene transfer into neural cells in vitro using adenoviral vectors，current protocols in neuroscience，unit 4 23，chapter 4；akli et al.(1993)transfer of a foreign gene into the brain using adenovirus vectors.nature genetics，3(3)：224-228中描述。
[0310]
另一方面提供如本文所述的载体，通常为如本文所述的病毒载体。
[0311]
通常使用本领域已知的方法将病毒载体包装到病毒颗粒中。然后，病毒颗粒可用于在体外或体内转移细胞系，包括神经细胞系或神经组织。因此，另一方面提供包含本文所述载体的病毒颗粒。
[0312]
另一个方面提供了制剂，其包含如本文所述的tau基因编辑系统或其部分，或编码tau基因编辑系统或其部分的核酸。在一个实施方案中，tau基因编辑系统或其部分将突变引入野生型tau基因，通常是内源性tau基因，以引起tau的磷酸模拟物表达。通常，tau的磷酸模拟物是t205e或t205d。在一个实施方案中，tau基因编辑系统包括靶向野生型tau基因的crispr/cas，通常是crispr/cas9，与将谷氨酸或天冬氨酸取代tau序列sspgspgtpgsrsr
中苏氨酸(通常是野生型人tau第205位的苏氨酸)引入野生型tau基因(通常是内源性野生型tau基因)的供体核酸组合。
[0313]
通常，tau基因编辑系统或其部分包括导向rna(grna)或编码导向rna的核酸，其与tau基因序列的编码区的一部分(通常在编码tau t205序列处或附近)互补。通常，grna是单导向rna或一对导向rna。用于靶向小鼠和人tau的合适的导向rna序列对的实例包括如下所示的序列：
[0314]
导向rna1：
[0315]
小鼠：cgagcgactgccaggcgttc(seq id no：69)
[0316]
人：ggagcggctgccgggagtgc(seq id no：70)
[0317]
导向rna2：
[0318]
小鼠：cccggctctcccggaacgcc(seq id no：71)
[0319]
人：cccggctccccaggcactcc(seq id no：72)。
[0320]
通常，tau基因编辑系统包含与供体核酸结合的crispr/cas9复合物。
[0321]
通常，导向rna还包含结合核酸内切酶的序列，例如cas蛋白，通常是cas9蛋白。通常，导向rna包含前间区序列邻近基序(pam)序列和用于结合cas蛋白的细菌crrna和tracrrna的融合体。因此，导向rna为cas核酸内切酶提供了靶向特异性和支架/结合能力。在这方面，导向rna序列将核酸内切酶(如cas)引导至靶位点，在那里核酸内切酶在靶dna中产生双链断裂。为了使用tau基因编辑系统引入突变，将grna和cas蛋白或编码cas蛋白的核酸与包含突变tau序列的供体序列一起引入细胞，以整合到内源野生型tau基因中。供体核酸通常通过同源定向修复将突变tau序列整合到tau等位基因中。用于突变小鼠和人tau基因(mapt基因)的供体序列的实例如下：
[0322]
小鼠：
[0323][0324]
人：
[0325][0326]
在一个实施方案中，用于突变人tau基因的供体序列包含编码选自由以下组成的组的氨基酸序列的核苷酸序列：spgspgxpgsrsr(seq id no：74)、sspgspgxpgsrsrt(seq id no：75)、sspgspgxpgsrsrt(seq id no：76)、ysspgspgxpgsrsrtp(seq id no：77)、gysspgspgxpgsrsrtps(seq id no：78)、sgysspgspgxpgsrsrtpsl(seq id no：79)、rsgysspgspgxpgsrsrtpslp(seq id no：80)、drsgysspgspgxpgsrsrtpslpt(seq id no：81)、gdrsgysspgspgxpgsrsrtpslptp(seq id no：82)、sgdrsgysspgspgxpgsrsrtpslptpp(seq id no：83)、ksgdrsgysspgspgxpgsrsrtpslptppt(seq id no：84)、pksgdrsgysspgspgxpgsrsrtpslptpptr(seq id no：85)、ppksgdrsgysspgspgxpgsrsrtpslptpptre(seq id no：86)、eppksgdrsgysspgspgxpgsrsrtpslptpptrep(seq id no：87)、geppksgdrsgysspgs
pgxpgsrsrtpslptpptrepk(seq id no：88)和sgeppksgdrsgysspgspgxpgsrsrtpslptpptrepk(seq id no：89)，
[0327]
其中x是e或d。
[0328]
在一个实施方案中，用于突变人tau基因的供体序列包含与seq id no：6至少60％、更通常至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列。
[0329]
在一个实施方案中，用于突变人tau基因的供体序列包含与seq id no：6至少60％、更通常至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％同一性的核苷酸序列，并编码氨基酸序列sgeppksgdrsgysspgspgxpgsrtpslptpptrepk，其中x是e或d。
[0330]
使用crispr/cas9进行基因组编辑的方法是本领域已知的，并在例如美国专利号10，240，145；和us 201180127783中描述；
[0331]
在各种实施方案中：
[0332]
(i)grna与编码cas蛋白的rna和ds或ss供体dna一起施用；
[0333]
(ii)grna与cas蛋白和ds或ss供体dna一起施用；
[0334]
(iii)编码grna的dna与编码cas蛋白的dna和ds或ss供体dna一起施用；
[0335]
(iv)编码grna的dna与gas蛋白和ds或ss供体dna一起施用；
[0336]
(v)编码grna的dna与编码cas蛋白的rna和ds或ss供体dna一起施用；
[0337]
应当理解，编码grna的dna或编码cas蛋白质的dna包括可操作地连接到本文所述的适当调控序列的grna序列或cas编码序列。
[0338]
还应当理解，tau编辑系统的每个组分(例如，grna、核酸内切酶和供体序列)可以一起或单独施用。
[0339]
在一些实施方案中，通过载体将tau基因编辑系统引入受试者的神经元中。例如，可以在aav载体系统中将tau基因编辑系统引入受试者的神经元中。
[0340]
本文所述的制剂可配制成药物组合物。因此，在另一个方面，提供了包含本文所述制剂的药物组合物。组合物包括在药学上可接受的载体中的制剂。用药物载体配制制剂的方法是本领域已知的，并在例如《雷明登药学大全》(17th ed.mack publishing company，easton，pa.1985)；《古德曼
·
吉尔曼治疗学的药理学基础》(11th edition，mcgraw-hill professional，2005)中描述。
[0341]
可接受的载体、稀释剂和佐剂对于接受者是无毒的，并且优选在所用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂，如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如edta；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；和/或非离子表面活性剂，如吐温、普朗尼克或聚乙二醇(peg)。
[0342]
可通过颅内、静脉内、腹腔、皮下、肌内、鼻内或鞘内注射向受试者施用剂。适用于颅内、静脉内、腹腔、皮下、肌内、鼻内或鞘内使用的组合物包括用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌水溶液或分散液和无菌粉末。药学上可接受的载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和
植物油。例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散情况下保持所需的粒度，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来防止微生物的作用。在许多情况下，其优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。
[0343]
在将制剂包装在病毒颗粒中的实施方案中，药物组合物可包括允许制剂有效的任何浓度的病毒颗粒。在这类实施方案中，药物组合物可包含0.1％至99.9％(按重量计)量的病毒颗粒。药学上可接受的载体包括水、缓冲水、盐溶液(例如生理盐水或平衡盐溶液(例如汉克或厄尔平衡溶液))、甘氨酸、透明质酸等。
[0344]
待施用的病毒颗粒的滴度将根据例如待使用的特定载体、施用方式、病症程度、个体而变化，并且可以通过本领域标准方法测定。
[0345]
本文所述的制剂可以配制成通过非病毒方法(如显微注射、电穿孔、微粒轰击、脂质体摄取、基于纳米颗粒的递送等)引入神经元细胞中。
[0346]
在一个实施方案中，本文所述制剂可以被配制成一种或更多种脂质体、脂质复合物或脂质纳米颗粒。在一个实施方案中，本文所述制剂被配制成脂质体。脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂材料形成的膜和水性内部。水性部分包含待递送的组合物。脂质体设计可包括例如调理素或配体，以改善脂质体对组织的附着或激活例如内吞等事件。
[0347]
脂质体的形成可能取决于理化性质，例如制剂和脂质体成分、脂质囊泡分散于其中的介质的性质、制剂的有效浓度、囊泡的应用和/或递送过程中涉及的任何附加过程、用于预期应用的囊泡的优化尺寸、多分散性和有效期，以及批间可再现性和大规模生产安全有效的脂质体产品的可能性。
[0348]
用于递送制剂的脂质体和脂质纳米颗粒的生产方法是本领域已知的，并在例如us 5,264,221中描述。
[0349]
术语“施用”应理解为向需要治疗的受试者提供化合物或制剂。
[0350]
术语“有效量”是指将引起所寻求的系统、组织或受试者的生物反应的制剂的量。
[0351]
应理解，任何特定受试者的特定剂量水平和给药频率可能会发生变化，并且将取决于多种因素，包括例如所用特定化合物或制剂的活性、该化合物或制剂的代谢稳定性和作用时长、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用方式和时间、药物组合、特定病症的严重程度和接受治疗的受试者。
[0352]
还提供了试剂盒，其包括包含该制剂的容器。容器可以仅仅是包含胃肠外剂型的制剂的瓶子，每种剂型包含单位剂量的制剂。该试剂盒还包括印刷说明书。制品将包括标签等，指示根据本方法对受试者的治疗。在一种形式中，制品可以是包含胃肠外剂型的制剂的容器。例如，制剂可以以一次性容器中的可注射溶液的形式存在。
[0353]
如本文所用，“治疗”指影响受试者、组织或细胞以获得期望的药理学和/或生理学效应，并包括抑制该病症，即阻止其发展；或减轻或改善病症的影响，即导致病症影响的逆转或消退。
[0354]
如本文所用，“预防”是指预防可能处于患有该病症风险的细胞或受试者发生病症，但不一定意味着该病症最终不会发展，或受试者最终不会出现病症。预防包括延迟细胞或受试者病症的发生。
[0355]
在本发明的后续权利要求和前述描述中，除上下文因明示语言或必要含义而另有
要求外，“包含(comprise)”一词或诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”等变体的使用具有包容性，即，指示所述特征的存在，但不排除在本发明的各种实施方案中进一步特征的存在或添加。
[0356]
本说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。本领域技术人员应理解，在不脱离广义描述的本发明的精神或范围情况下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变更和/或修改。因此，认为本实施方案在所有方面都是说明性的而非限制性的。
[0357]
本技术要求澳大利亚临时申请序号2019903530的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0358]
为了举例说明本发明的性质以便可以更清楚地理解，提供了以下非限制性实施例。
[0359]
实施例
[0360]
材料和方法
[0361]
小鼠
[0362]
在神经元中表达人k670n/m671l突变app的app23小鼠(sturchler-pierrat et al.，1997)、在神经元中表达人非突变tau的alz17小鼠(probst et al.，2000)、tau-/-(tucker et al.，2001)、p38γ-/-{perdiguero，2007#164}小鼠、在神经元中表达组成型活性p38γca的转基因小鼠(ittner et al.，2016)和在脑中表达p301s突变人tau的转基因tau58小鼠(van eersel et al.，2015)已在前面描述过。所有小鼠系均维持在c57bi/6背景下。动物实验得到了新南威尔士大学动物伦理委员会的批准。使用来自尾部活检的异丙醇沉淀dna作为模板，通过聚合酶链反应对小鼠进行基因分型。表1中描述了通过聚合酶链反应(pcr)对靶等位基因和转基因进行基因分型的寡核苷酸引物。
[0363]
基因组编辑
[0364]
如前所述，使用crispr/cas9靶向小鼠mapt基因(delerue and lttner，2017；yang et al.，2014)。简而言之，使用计算工具{ran，2013#417}(http：//crispr.mit.edu)设计了两个靶向内源性小鼠mapt基因的密码子t194(与人密码子t205同源)的导向。这些单导向rna(sgrna)采用非克隆方法生成，其中使用偶联t7的正向引物通过pcr生成线性模板。使用px330的sgrna支架(addgene#42230，feng zhang博士赠送)作为模板。按照制造商的说明(neb#e2050s)，使用t7快速高效rna合成试剂盒将得到的线性dna在体外转录成sgrna。使用nucaway离心柱(thermofisher#am10070)纯化sgrna。将cas9蛋白(neb#m0646t)、sgrna和供体单链寡聚体(ssoligo)原核注射入c57bi/6受精卵，得到活幼仔。通过测序克隆的每只幼仔的单个等位基因，对首建鼠进行初步鉴定。简而言之，通过pcr从小鼠dna中扩增mapt外显子9(ensembl ensmust00000106989.2)的序列，并使用hifi assembly(new england biolabs)克隆至pbluescript(stratagene)中。对至少5个克隆/幼仔进行测序，以鉴定在苏氨酸-194处具有正确密码子交换的潜在首建鼠。将具有已验证的密码子交换的首建鼠与c57bi/6小鼠杂交，分别建立taut205a和taut205e系。使用来自尾部活检的异丙醇沉淀的dna作为四引物arms-pcr的模板，对taut205a和taut205e小鼠进行基因分型{ye，2001#395}。使用引物1设计了用于四引物arms pcr的寡核苷酸引物(http：//primer1.soton.ac.uk/primer1.html)。表1中列出了导向rna的序列、在mapt中t205处密码子交换的同源修复模板以及四引物arms pcr的寡核苷酸引物。
[0365]
表1.用于小鼠品系基因分型的寡核苷酸引物。
[0366][0367]
记忆力测试
[0368]
在莫里斯水迷宫(mwm)范式{vorhees，2006#35；ittner，2016#217；tan，2018#390}中测试了空间学习/记忆力。简而言之，在有微光间接照明的房间中，为小鼠mwm定制的具有白色非反射内表面的水箱(直径122cm，高度50cm)中装满了含有稀释的无刺激性白色染料的水(19-22℃)。在4个象限的垂直位置围绕水箱放置四个不同的远端提示。在靶象限(q1)中，将平台(10cm2)浸没在水面以下1cm。用ccd摄像机记录了视频，并用anymaze软件进行了分析。对于空间采集，每个阶段进行四次试验，每次60秒。对于所有试验，起始位置沿起始象限的外缘随机分配。为了测试参考记忆，进行了时长60秒的无平台探索试验，并分析了在每个象限内所花费时间的记录。对于视觉提示的对照采集(以排除视觉受损)，在平台顶部贴标记，每个阶段进行四次试验(60秒)。所有小鼠进行年龄和性别匹配，并在4月龄时进行检测。排除表现出持续漂浮行为的小鼠。基因型对记录试验和分析视频跟踪的工作人员盲态。使用anymaze软件跟踪游泳路径。测定平均游泳速度，以排除运动障碍。
[0369]
行为测试
[0370]
小鼠在高架十字迷宫上测试10分钟，以使用先前公布的标准方案评估抑制解除和焦虑(ke et al.，2015)。
[0371]
癫痫发作
[0372]
如前所述(ittner et al.，2010)，戊四唑(ptz，sigma-aldrich)诱发癫痫。简而言之，按30mg/kg或50mg/kg体重腹腔内注射ptz。癫痫分级为：0、无癫痫；1、活动不能；2、尾部伸展；3、前肢阵挛；4、全身阵挛；5、跳跃式癫痫；6、完全伸展；7、癫痫持续状态。
[0373]
质粒构建体
[0374]
表2列出了用于基于pcr生成质粒构建体的寡核苷酸引物。用于产生aav颗粒的构建体基于paav-hsyn1-egfp-wpre(addgene#58867)。如(ittner et al.，2016)中所述，使用hifi assembly(new england biolabs)将egfp编码序列替换为p38γ
ca
编码序列(p38γasp179ala)、tauwt(人tau40 441氨基酸)或taut205a。前面描述了具有密码子交换t205a的
tau构建体(ittner et al.，2016)。所有质粒均在大肠杆菌dh5d或xl-1blue中扩增。在大肠杆菌stbl3中增殖aav载体以避免重组事件。通过测序验证了所有构建体。
[0375]
表2.用于分子克隆的寡核苷酸引物。
[0376][0377][0378]
腺相关病毒的生产及应用
[0379]
aav载体的包装按{harasta，2015#80}所述进行。简而言之，为了包装aav颗粒，将293t细胞接种在含10％fbs的完全dmem(sigma)中70-80％汇合。转染前3小时，将培养基更换为含5％fbs的imdm(sigma)。使用polyethyleneimine-max(pei-max，polysciences)作为转染试剂，用含有病毒基因组的质粒、作为辅助质粒的pfdelta6和含有rep和cap序列的aav-php.b质粒转染细胞。转染后72小时收获细胞和上清液。通过添加40％peg8000/2.5m nacl至终浓度为8％peg8000/0.5m nacl澄清上清液，并在4℃孵育至少2小时。将澄清上清液以2000g离心30分钟。用脱氧胆酸钠(0.5％终浓度)和benzonase(约500u)在37℃处理来自澄清上清液和细胞沉淀的合并沉淀40分钟。加入nacl，在56℃孵育40分钟并冻融后，将溶液在4℃以5000g离心30分钟。通过超迷离心使用碘克沙醇梯度纯化上清液(475900g、18℃、2小时)。在5000g和4℃下，在amicon 100kda 15ml浓缩器中将aav颗粒浓缩并交换至pbs中。在用qpcr滴定后，将等分试样储存在-80℃下。通过定量聚合酶链反应(qpcr)确定滴度。aav滴度为(以病毒基因组/ml计)：aav-php.b-syn1-egfp(1.46x10
14
)、aav-php.b-syn1-p38γ
ca
(1.37x10
14
)、aav-php.b-syn1-tauwt(8.42x10
13
)、aav-php.b-syn1-taut205a(2.80x10
13
)。在出生后第0天(p0)使用未稀释的aav或用无菌生理盐水(0.9％nacl)稀释后静脉注射(i.v.)应用。对于p0注射，如(ittner et al.，2016)所述，将1μl(1x109病毒颗粒)aav颗粒在3个部位分别双侧注射到低温麻醉新生小鼠的脑中。为全身递送，将100μl aav颗粒溶液(10
11
或10
13
个病毒颗粒/ml)注入小鼠尾静脉。
[0380]
小鼠大脑裂解物和免疫印迹
[0381]
用磷酸盐缓冲液(pbs ph7.4)经心灌注后提取小鼠皮质组织。皮质组织在ripa缓冲液(20mm tris ph8.0、150mm nacl、1mm edta、1mm na3vo4、1mm naf、1mm磷酸甘油、2.5mm na2h2p2o7、1mm pmsf、蛋白酶抑制剂(complete，roche)、1％np-40替代物(sigma-aldrich)、0.1％sds、0.5％脱氧胆酸钠)中用杜恩斯匀浆器(heidolph)在冰上匀浆。通过离心(16，000
×
g/10min/4℃)清除裂解物。测定蛋白浓度(dc蛋白测定法，biorad)。如前所述(ittner et al.，2012)进行蛋白质印迹分析。通过化学发光在x线片或数字成像系统(chemidoc mp，biorad)上对条带进行可视化。使用imagej 2.0.0-rc-49/1.51d(nih)对蛋白质印迹结果进行密度定量。本研究中使用的抗体是：抗psd95抗体(millipore)、抗aβ抗体(6e10)，抗tau抗体(dako)、抗tau抗体(tau-1，millipore)、抗tau抗体(tau13，abcam)、抗磷酸化苏氨酸205tau抗体(abcam)、抗磷酸化丝氨酸214tau抗体(millipore)、抗甘油醛脱氢酶抗体
(anti-gapdh，millipore)、抗p38γ抗体(r&d)、抗ha7抗体(sigma)、抗ha抗体(cell signaling technologies)，抗snap25抗体(millipore)、抗神经丝抗体(nf200，abcam)。
[0382]
免疫沉淀法
[0383]
如前所述(ittner et al.，2010)，从组织裂解物中进行免疫沉淀。简而言之，在冰上将皮质或海马组织在ripa缓冲液(20mm tris ph8.0、150mm nacl、1mm edta、1mm na3v04、1mm naf、1mm磷酸甘油、2.5mm na2h2p207、1mm pmsf、蛋白酶抑制剂(complete，roche)、1％np-40替代物(sigma-aldrich)、0.1％sds、0.5％脱氧胆酸钠)中匀浆。通过离心(16，000
×
g/10min/4℃)清除裂解物。测定蛋白浓度(dc蛋白测定法，biorad)，且取200μg裂解液与抗体一起(1∶400)在旋转器上4℃孵育3小时。将平衡和封闭的蛋白g珠(new england biolabs)与裂解液一起在旋转器上4℃孵育45分钟。然后，在sds-page之前，将珠洗涤3次，并在样品缓冲液中于95℃孵育5分钟。使用image j 2.0.0-rc-49/1.51d(nih)进行定量密度分析。
[0384]
组织切片和染色
[0385]
用磷酸盐缓冲液经心脏灌注小鼠，然后用4％多聚甲醛(pfa)灌注，并在4％pfa中固定后过夜。在excelsior组织处理机(thermo)中处理组织以进行石蜡包埋。如前所述(ittner et al.，2015)，进行银染(gallyas)以使tau转基因小鼠脑中的tau聚集体和nft样结构可视化。来自注射aav小鼠的大脑切片用抗tau(tau13；abcam)或ha-tag(ha-7；sigma-aldrich)的一抗染色以可视化病毒转基因表达。所有组织切片均在配备dp70彩色相机(olympus)的bx51明场/落射荧光显微镜(uplanfl n镜头[∞/0.17/fn26.5]：10x/0.3、20x/0.5、40x/0.75、60x/1.25oil和100x/1.3oil)上成像。
[0386]
免疫荧光法
[0387]
如前所述(ittner et al.，2010)，对组织切片进行免疫荧光染色。简而言之，对组织切片进行脱蜡、再水化、用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤、用在pbs中的0.02％np-40处理并使用封闭缓冲液(pbs中3％马血清/1％牛白蛋白)封闭。在封闭缓冲液中稀释的一抗在4℃孵育过夜或在室温孵育1小时。用pbs洗涤后，为可视化细胞核的封闭缓冲液(添加或不添加dapl)稀释的二抗在室温孵育1小时。然后洗涤细胞，并使用抗荧光淬灭封片剂(prolong gold，life technologies)封片。使用的二抗与alexa 488、555、568或647染料偶联(分子探针)。在配备有dp70彩色照相机(0lympus)的bx51明场/落射荧光显微镜(uplanfl n透镜[∞/0.17/fn26.5]：10x/0.3、20x/0.5、40x/0.75、60x/1.25oil和100x/1.3oil)上使用cellsens软件(olympus)进行落射荧光成像。如前所述(ittner et al.，2015)，对组织学小鼠脑切片(8μm)进行浸银染色。使用image j(https：//imagej.nih.gov/ij/)在具有淀粉样蛋白-β(6e10)免疫荧光染色的皮质切片的显微照片上测定淀粉样斑块计数和大小。标准化斑块计数到组织表面积。
[0388]
统计分析
[0389]
使用graphpad prism 6.0版进行统计分析。对成对比较进行学生t检验，同时通过anova分析多个数据组。采用平方和最小化进行线性回归及相关分析。采用对数秩mantel-cox检验分析生存数据。所有值均以平均值
±
平均值的标准误差(sem)表示。
[0390]
结果
[0391]
在一个实施例中，发明人使用了13个月高龄的具有人突变淀粉样β前体蛋白(app)
转基因表达的阿尔茨海默病app23小鼠模型，其中它们已进展到重度记忆缺陷，并且用不同滴度aav处理它们以在神经元中表达组成型活性p38γ(p38γ
ca
)或增强型绿色荧光蛋白(egfp)的作为对照(图1a)。在15个月大时，在接受处理小鼠中检测了记忆表现(图1a)。经低(10
10
aav颗粒)或高(10
12
aav颗粒)aav滴度处理的app23小鼠脑中p38γ
ca
的表达通过融合到p38γ
ca
的ha标签的染色可视化(图1b)。由6e10抗体可视化的aβ染色模式未随p38γ
ca
表达而改变。这证实了全身性aav递送时app23小鼠脑中p38γ
ca
成功表达。
[0392]
在15月龄时，小鼠在莫里斯水迷宫(mwm)中的记忆评估显示，与aav-egfp治疗的app23同窝胎仔中的持续性记忆缺陷相比，用低滴度aav-p38γ
ca
治疗的app23小鼠的记忆表现显著改善(图1c-g)。aav-p38γ
ca
治疗的app23小鼠表现出与年龄匹配的非转基因对照小鼠相似的记忆形成。综上所述，这些结果证明，用低滴度的aav-p38γ
ca
治疗ad小鼠有效恢复其在高龄时的记忆缺陷。
[0393]
同样，对接受较高滴度aav-p38γ
ca
或aav-egfp处理的小鼠的记忆评估显示app23小鼠的现有记忆缺陷有效逆转(图1h-i)。因此，用高滴度的aav-p38γ
ca
治疗老年app23小鼠显示出与用aav-p38γ
ca
或aav-egfp治疗的非转基因小鼠相当的记忆形成和巩固，而用aav-egfp治疗的app23小鼠在mwm测试期间表现出持续不良的记忆表现。综上所述，这些结果证明，用高滴度的aav-p38γ
ca
治疗ad小鼠有效恢复其在高龄时的记忆缺陷。
[0394]
在另一个实施例中，发明人将人非突变tau转基因alz17小鼠与p38γ缺陷p38γ-/-小鼠杂交(图2a)。这导致alz17.p38γ-/-小鼠脑中缺乏p38γ，正如与alz17.p38γ
/
小鼠相比，alz17.p38γ-/-皮质中的内源性p38γ和tau的免疫染色所显示的那样(图2b)。这证实了alz17.p38γ-/-小鼠脑中p38γ成功减少。
[0395]
alz17.p38γ-/-小鼠和alz17.p38γ
/
小鼠在mwm中的记忆评估证实，alz17.p38γ
/
小鼠不存在记忆缺陷，其记忆形成和巩固与p38γ
/
和p38γ-/-同窝胎仔相当(图2c-f)。相反，与alz17.p38γ
/
小鼠相比，alz17.p38γ-/-小鼠的记忆形成显著延迟，记忆巩固显著降低。这证明，在tau蛋白病小鼠模型中不存在aβ的情况下，p38γ限制了人过度磷酸化tau水平升高的毒性作用。
[0396]
在另一个实施例中，发明人使用crspr/cas9基因编辑技术修饰了编码tau的内源性小鼠mapt基因，以在不同的小鼠品系中引入t205e或t205a突变(图3a)。将所得品系与纯合子杂交，分别获得t205e/e小鼠和t205a/a小鼠。通过对从两个品系获得的基因组dna进行测序并与非突变型t205t/t小鼠进行比较，证实了基因组编辑成功(图3b)。通过使用t205处磷酸化的tau的特异性抗体的免疫沉淀证实了t205a/a的基因组编辑成功伴由此产生的翻译鼠蛋白中氨基酸交换(图3c)。综上所述，发明人已经产生了具有突变tau表达的两种新型小鼠品系，t205e/e和t205a/a。
[0397]
为了确定内源性tau蛋白中t205变异的功能影响，t205e/e和t205a/a小鼠均接受了诱导性癫痫的既定兴奋性毒性试验范式。服用50mg/kg戊四唑后，与杂合t205t/e和非突变t205t/t对照中快速发展和教严重的癫痫相比，t205e/e小鼠出现更严重癫痫的潜伏期增加和平均癫痫严重程度降低(图3d-e)。相反，注射30mg/kg戊四唑后与t205t/t同窝胎仔相比，t205a/a小鼠表现出更严重癫痫的快速发展和平均癫痫严重程度的显著增加(图3f-g)。综上所述，该数据表明，模拟磷酸化的t205e/e突变的存在减少，同时预防磷酸化的t205a/a突变增强，对诱发的兴奋性毒性癫痫易感。因此，该数据证明，t205 tau磷酸化对体内癫痫
有防护作用。
[0398]
在另一个实施例中，发明人将t205e/e和t205a/a小鼠与app23小鼠杂交，以确定t205tau磷酸化在与ad相关的记忆缺陷中的作用(图4a)。使用抗t205(pt205)处磷酸化的tau和aβ(6e10)抗体对小鼠脑进行免疫染色，证实了app23.t205a/a小鼠中不存在t205 tau磷酸化(图4b)。与app23.t205t/t动物相比，app23.t205e/e小鼠的存活率显著提高，而app23.t205a/a显示死亡率进一步上升的趋势(图4c)。该数据证明t205 tau磷酸化在调节app23小鼠存活率中的关键作用。
[0399]
mwm中的记忆测试显示，与app23.t205t/t小鼠中的记忆缺陷相比，app23.t205a/a小鼠的记忆形成和巩固进一步恶化(图4e-h)。相反，app23.t205e/e小鼠被阻断出现app23.t205t/t小鼠中所见的记忆缺陷(图4i-i)。值得注意的是，在mwm中，t205a/a和t205e/e小鼠表现出正常的记忆形成。该数据证明，taut205处磷酸化限制了app23小鼠的记忆缺陷，而在未治疗小鼠的测试范式中其不影响记忆。
[0400]
在另一个实施例中，发明人在tau缺陷背景下杂交app23小鼠，并进一步将所得app23.tau-/-小鼠与在神经元中表达转基因p38γ
ca
的品系杂交，产生app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠(图5a)。然后在出生时使用非突变tau(tauwt)的tau变体或阻止磷酸化的t205a tau(taut205a)将aav注射到脑中来重建app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠脑中tau表达，随后6月龄时进行记忆力测试(图5b)。用抗p38γ
ca
的ha标签的抗体和抗脑的人tau抗体进行的免疫荧光染色证实了在注射aav的app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠中p38γ
ca
的表达和tau的成功重建(图5c)。
[0401]
对注射aav的app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠的记忆测试显示，在注射aav-tauwt的app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠中，记忆表现得到改善，而用aav-taut205a的重建未能预防app23.tau-/-.p38γ
ca
小鼠中的记忆缺陷(图5d-f)。作为比较，app23.tau-/-小鼠的aav-tauwt和aav-taut205a注射(在p38γ不存在的情况下)均未改善记忆表现。重建tauwt的tau-/-小鼠用作正常记忆任务表现的参照。综上所述，该数据证明tau的t205处磷酸化是p38γ
ca
在ad小鼠中发挥疗效所必需的。
[0402]
在另一个实施例中，发明人将人非突变tau转基因alz17小鼠与神经元中表达p38γ
ca
的转基因小鼠杂交，得到aiz17.p38γ
ca
小鼠(图8a)。用抗p38γ
ca
的ha标签的抗体和抗人tau的抗体进行的大脑免疫荧光染色显示tau和p38γ
ca
在脑神经元中共表达(图8b)。来自小鼠大脑的突触小体制剂的蛋白质印迹显示，与alz17.p38γ
/
对照相比，在alz17.p38γ
ca
小鼠的突触后中tau的t205处磷酸化增加(图8c)。相比之下，在其突触后也缺乏p38γ的alz17.p38γ-/-小鼠中不再检测到tau的t205处磷酸化(图8c)。突触后密度蛋白95(psd-95)和突触小体相关蛋白25(snap25)的检测证实在制备过程中突触小体的富集相等。p38γ存在于alz17.p38γ
/
和alz17.p38γ
ca
小鼠的突触小体中，而不存在于alz17.p38γ-/-小鼠的突触小体中，这与其基因型一致。使用抗tau抗体和抗t205处磷酸化tau抗体的大脑免疫荧光染色显示，与alz17小鼠相比，alz17.p38γ
ca
小鼠中的t205 tau磷酸化增加(图8d)。然而，老年小鼠大脑的银染显示，与alz17同窝胎仔相比，alz17.p38 γ
ca
小鼠脑中的神经原纤维缠结(nft)没有明显增加(图8e)。mwm中aiz17.p38γ
ca
小鼠的记忆测试显示无记忆缺陷，其表现与aiz17或p38γ
ca
或非转基因对照无法区分(图8f-h)。综上所述，该数据证明，在aiz17小鼠中p38γ
ca
表达增加了t205 tau磷酸化(包括在突触后)，但未加速tau病理或导致记忆
缺陷。
[0403]
在另一个实施例中，发明人用低滴度和高滴度的治疗性aav-p38 γ
ca
或对照aav-gfp治疗3月龄的人p301s突变tau转基因tau58小鼠。3月龄时，tau58小鼠在高架十字迷宫(epm)试验中表现出抑制解除表型(＝开放臂时间增加)，随时间进一步恶化。5月龄时，与aav-gfp治疗的tau58小鼠相比，使用高滴度aav-p38γ
ca
治疗的tau58小鼠显示出开放臂时间缩短(图11)。此外，与aav-gfp治疗的tau58对照相比，aav-p38γ
ca
治疗的tau58小鼠表现出活动过度的滴度依赖性改善(图12-13)。综上所述，该数据证明p38γ
ca
的表达可有效恢复tau蛋白病小鼠模型中与tau病理相关的缺陷。
[0404]
p38γ对tau磷酸化和聚集的影响
[0405]
为了确定tau t205处磷酸化对tau磷酸化和聚集的影响，使用aav-p38γ
ca
或对照(aav-gfp)对tau58/2小鼠进行治疗。
[0406]
来自aav-p38
ca
和对照(aav-gfp)治疗的tau58/2小鼠的脑顺序提取证明，在接受p38γ治疗后，不存在明显的tau磷酸化，也不存在不溶性。在3月龄时，脑神经元中表达p301s突变tau并形成暗示人阿尔茨海默病和额颞叶痴呆的进展性tau病理学的tau58/2小鼠静脉注射编码p38
ca
的aav用于神经元表达(可操作地连接到人突触素启动子)或静脉注射绿色荧光蛋白(g印)作为对照。在11月龄时，按使用日益严格的缓冲液(rab(0.1m mes/1mm egta/0.5mm mgso4，750mm nacl，20mm naf，1mm na3vo4，0.1％roche蛋白酶抑制剂，ph 7.4)、ripa(50mm tris/150mm nacl/1％nonidet p-40/5mm edta/0.5％脱氧胆酸钠/0.1％sds，ph 8.0)和70％甲酸)(rab＞ripa＞fa)的顺序提取分析所有大脑以分别获得可溶性、中等大小可溶性和不溶性蛋白质。用使用ha、gtp、tau13、gadph和ptaus422抗体的蛋白质印迹法分析提取物。ha抗体用于确认p38γ
ca
表达，和gfp抗体用于鉴定对照。结果见图19。用tau13抗体检测全人转基因tau，而用位点特异性抗体(ptau t205和ptau s422)检测磷酸化tau。在p38γ
ca
表达时，我们未发现tau水平、其磷酸化或tau的不溶性发生变化(即增加)，证实了aav-p38gca治疗不会加速tau病理的进展。事实上，在来自aav-p38γ
ca
治疗的tau58/2小鼠的不溶性部分，发现晚期疾病表位ptau s422处的不溶性tau磷酸化减少。
[0407]
tau的丝氨酸-422处磷酸化(ps422)是一种疾病相关的修饰，且在阿尔茨海默病和其他tau蛋白病中已发现tau在丝氨酸422处出现磷酸化增加。ps422表位的出现与神经原纤维缠结的形成和认知能力下降有很强的相关性。因此，鉴于ps422与认知能力下降之间的密切联系，p38γ减少来自tau58/2小鼠大脑的tau不溶性部分中ptau s422的能力，指示p38γ能够逆转或减少认知能力下降和与脑神经元中tau的丝氨酸422磷酸化相关或由其介导的tau蛋白病。
[0408]
综上所述，该数据表明p38γ
ca
表达可预防或减少tau病理进展。
[0409]
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