治疗癌症的新型药物组合的制作方法

1.本发明涉及基于受体酪氨酸激酶抑制剂的组合的癌症治疗方法。


背景技术：

2.癌症是全球主要死因，2018年估计总计有960万人因此死亡。最常见的癌症是肺癌、乳腺癌和结直肠癌，而肺癌、结直肠癌和胃癌是最常见的癌症死亡原因(the global cancer observatory,2019.factsheet on cancers/39)。
3.肝细胞癌(hcc)是全球第五大最常见的肿瘤，也是最常见的原发性肝癌类型。hcc最常发生于慢性肝病患者，如由乙型肝炎或丙型肝炎感染引起的肝硬化。hcc有多种治疗选择，包括治愈性切除、肝移植、射频消融、经动脉化疗栓塞、放射栓塞和全身性多受体酪氨酸激酶抑制剂如索拉非尼(sorafenib)给药。
4.据报道，治愈性切除hcc后患者的5年生存率为30％-50％。射频消融等局部消融疗法被认为是极早期和早期癌症患者的标准治疗，导致其5年生存率处于40％-70％范围内(raza and sood,2014.world j gastroenterol 20:4115
–
4127)。经动脉化疗栓塞(tace)正在成为中期hcc患者的标准治疗方法，尤其是在使用栓塞微球时。据报道，tace在15％-62％的患者中实现了部分反应，肿瘤发展显著延迟，中位数生存期提高了16-20个月(llovet and bruix,2003.hepatology37:429-42)。
5.由于进展迅速和诊断延误，大多数肝癌患者在晚期被诊断出。对于晚期hcc患者，索拉非尼(nexavar)是2018年之前唯一获得美国食品药品监督管理局(fda)批准用于治疗的药物。它是一种口服的有效抗血管生成多激酶抑制剂。除了遭受不良副作用和高成本之外，在临床试验中，与安慰剂相比，索拉非尼仅提高了不到3个月的生存期(llovet et al.,2008.n engl j med 359:378-390；cheng et al.,2009.lancet oncology 10:25-34)。索拉非尼和表皮生长因子受体抑制剂(如厄洛替尼(erlotinib))的组合治疗在人类结直肠癌细胞和肺癌细胞中表现出协同抗肿瘤作用(martinelli et al.,2010.clin cancer res 16:4990
–
5001)，但并未改善患有晚期hcc的患者的生存期(zhu et al.,2015.j clin oncol 33:559-566)。
6.与索拉非尼相比，另一种多受体酪氨酸激酶抑制剂乐伐替尼(lenvatinib)在晚期hcc的一线治疗中表现出不逊于索拉非尼的总生存期(13.6个月相比于12.3个月)，成为该疾病治疗方案的有效替代选择(kudo et al.,2018.lancet 391:1163
–
1173)。虽然乐伐替尼表现出改善的临床活性，但仍远不能满足临床需求。
7.因此，需要通过靶向分子试剂如受体酪氨酸激酶抑制剂而提高晚期癌症患者如晚期hcc患者的反应率(response rate)和总体生存期。


技术实现要素：

8.为了找到能够与乐伐替尼在肝细胞癌(hcc)等癌症中协同作用的潜在药物靶点，采用乐伐替尼的合成杀伤力筛选使用靶向hcc细胞系snu449中的人激酶组的crispr-cas9
基因筛选进行。结果表明，egfr与乐伐替尼组合的抑制作用导致了snu449细胞增殖的显著抑制。
9.这种效果是令人惊讶的，因为先前的研究表明，口服活性的egfr酪氨酸激酶抑制剂厄洛替尼在与厄洛替尼组合使用时并未表现出索拉非尼疗效改善(zhu et al.,2015.j clin oncol 33:559-566)。厄洛替尼和索拉非尼的组合缺乏协同或加成效应，表明egf信号传导在晚期hcc中可能并非关键所在(gao et al.,2015.world j gastroenterol 21:12059-12070)。
10.因此，本发明提供了乐伐替尼和表皮生长因子受体(egfr)抑制剂的组合，用于对其需要的患有肝细胞癌的患者的治疗方法。令人惊讶的是，据发现，肝细胞癌细胞对乐伐替尼和egfr抑制剂的组合治疗产生了协同反应，而其他细胞如肺癌细胞、胰腺癌细胞和结肠癌细胞则没有。
11.所述egfr抑制剂优选是egfr酪氨酸激酶抑制剂(tki)，或防止配体与egfr结合的结合分子。所述egfr抑制剂优选是或包括吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、来那替尼(neratinib)、奥希替尼(osimertinib)、帕尼单抗(panitumumab)、凡德他尼(vandetanib)、奈昔单抗(necitumumab)、达克替尼(dacomitinib)或其组合。所述患有癌症的患者可能先前已经用多受体酪氨酸激酶抑制剂如乐伐替尼和/或索拉非尼治疗，并且可能已经对所述一种或多种多受体酪氨酸激酶抑制剂产生抗性。
12.所述肝细胞癌优选具有高水平的egfr表达。egfr表达水平优选使用h-评分法进行测定，藉此方法基于以不同强度下染色并在不同放大倍数下观察的细胞百分比，将0-300的分数赋予患者(mazi
è
resa et al.,2013.lung cancer82:231-237)。用h-评分法测定的高水平egfr优选具有≥200的分数。用h-评分法测定的低水平egfr表达优选具有《200的分数。
13.根据本发明使用的组合治疗方法优选与免疫疗法组合或交替进行，并且优选与pd1/pdl1抑制剂组合或交替进行。
14.本发明还提供了一种包括乐伐替尼和表皮生长因子受体(egfr)抑制剂的药物制剂。所述药物制剂可以包含含有乐伐替尼的药物制剂和含有egfr抑制剂的药物制剂。
15.本发明还提供一种用于治疗肝细胞癌的方法的药物制剂。
16.本发明还提供了一种套件试剂盒，其包括乐伐替尼和egfr抑制剂作为组合制剂，用于同时、单独或按序用于治疗受试者的肝细胞癌。
17.本发明还提供了一种治疗受试者肝细胞癌的方法，该方法包括同时、单独或按序向受试者给予乐伐替尼和egfr抑制剂。所述治疗方法优选还包括提供一种免疫检查点抑制剂，优选pd1/pdl1抑制剂。
附图说明
18.图1.合成致死筛选确定egfr抑制作用赋予肝癌细胞中对乐伐替尼的敏感性。(a)肝癌细胞系用浓度渐增的乐伐替尼治疗约两周。通过集落形成分析测试评价细胞生长。(b)肝癌细胞系用浓度渐增的乐伐替尼治疗约4天。通过celltiter-blue分析测试评价活力。(c)egfr敲低(knockdown)的水平通过三个独立shrna的蛋白印迹进行测定。hsp90蛋白水平用作上样对照。(d)靶向egfr的三个独立shrna会增强snu449细胞中对乐伐替尼的反应。这
些细胞在有或无渐增浓度的乐伐替尼的情况下培养约10天。
19.图2.乐伐替尼和egfr抑制剂的组合在体外对egfr
高
肝癌细胞系实现了强协同作用。肝癌细胞系中的高水平egfr表达与所述组合的协同作用相关。具有低或高水平egfr的肝癌细胞系用浓度渐增的乐伐替尼和egfr抑制剂(吉非替尼或厄洛替尼)进行治疗，并使用incucyte分析测试法测定细胞生长。
20.图3.在肝癌中乐伐替尼与egfr抑制之间的生化相互作用。肝癌细胞中对乐伐替尼治疗的抗性是通过egfr的反馈激活进行介导。用乐伐替尼、吉非替尼、厄洛替尼或其组合治疗肝癌细胞的生化反应通过蛋白印迹分析进行记录。分析了egfr和erk1/2的激活作用。hsp90作为对照。
21.图4.egfr抑制剂和乐伐替尼协同抑制异种移植模型中的肝癌生长。(a，b)吉非替尼和乐伐替尼的组合抑制snu449异种移植模型中的肿瘤生长。snu449细胞在裸小鼠(nude mice)中作为肿瘤异种移植物进行生长。肿瘤建立后(～200mm3)小鼠用载体(vehicle)、乐伐替尼(4mg/kg)、吉非替尼(80mg/kg)或乐伐替尼(4mg/kg) 吉非替尼(80mg/kg)治疗27天。(a)显示了平均肿瘤体积
±
平均值的标准误差(每组n＝6只小鼠)。(b)显示了平均体重
±
平均值的标准误差(每组n＝6只小鼠)。
22.图5.通过免疫组织化学染色确定的人肿瘤中的egfr表达水平。h-评分法基于不同放大倍数下观察到的不同强度下染色的细胞百分比为每位患者赋予0-300的分数。区分阈值设置为200。所有样品均分为低(h-评分《200)或高(≥200)egfr表达。
23.图6.乐伐替尼和egfr抑制剂吉非替尼的组合在体外未在几种肺癌细胞(a)、胰腺癌细胞(b)和结肠癌细胞(c)中获得反应，正如所示。癌细胞用乐伐替尼、egfr抑制剂吉非替尼或其组合以指定浓度进行治疗。5-10天后将细胞固定并染色。
具体实施方式
24.定义
25.正如本文所用，术语“乐伐替尼”是指化合物4-[3-氯-4-(环丙基氨基甲酰氨基)苯氧基]-7-甲氧基喹啉-6-甲酰胺或其衍生物和/或药用盐。所述盐优选是乐伐替尼甲磺酸盐。乐伐替尼是一种合成可口服抑制剂，尤其是血管内皮生长因子受体2(vegfr2)酪氨酸激酶的合成可口服抑制剂，具有潜在的抗肿瘤活性。乐伐替尼会抑制三种主要的血管内皮生长因子受体vegfr1、2和3，以及成纤维细胞生长因子受体(fgfr)1、2、3和4，血小板衍生生长因子受体(pdgfr)α，c-kit和ret原癌基因，它们都是酪氨酸激酶。
[0026]
正如本文所用，术语“索拉非尼”是指化合物4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰氨基]苯氧基]-n-甲基吡啶-2-甲酰胺或其衍生物和/或药用盐。所述盐优选是甲苯磺酸索拉非尼。索拉非尼会抑制三种主要的血管内皮生长因子受体vegfr1、2和3，以及pdgfr和丝氨酸/苏氨酸快速加速纤维肉瘤(raf)激酶。
[0027]
正如本文所用，术语“表皮生长因子受体(egfr)抑制剂”是指egfr信号传导的抑制剂。egf是通过与细胞表面受体结合而调节细胞存活的关键生长因子。通过结合配体如egf而激活这些细胞表面egf受体，刺激信号转导途径，这最终导致凋亡途径阻断。egfr抑制剂有效阻碍或抑制配体如egf与其受体的结合，或例如，通过抑制受体的酪氨酸激酶活性，阻碍或抑制egfr活化。当与其他受体酪氨酸激酶相比时，优选的egfr抑制剂对egfr具有选择
性，这意味着当与其他受体酪氨酸激酶相比时，该分子在抑制egfr方面的效力至少高出两倍，优选至少高出五倍。
[0028]
正如本文所用，术语“表皮生长因子受体家族”是指作为细胞外蛋白配体的表皮生长因子家族(egf家族)成员的受体的相关受体家族。所述家族包括四种密切相关的受体酪氨酸激酶，称为her1(egfr、erbb1)、her2(neu、erbb2)、her3(erbb3)和her4(erbb4)。本发明上下文中优选的受体是her1(egfr，erbb1)。所述受体能够形成均二聚体和异二聚体，如her1/her2。
[0029]
正如本文所用，术语“egfr”是指作为蛋白激酶超家族成员的跨膜糖蛋白。这种蛋白是表皮生长因子家族成员的受体。egfr是一种与表皮生长因子结合的细胞表面蛋白。该蛋白与配体的结合会诱导受体二聚化和酪氨酸自磷酸化并导致细胞增殖。该基因表征为hgnc登录号3236、entrez基因登录号1956和ensembl登录号ensg00000146648。该编码的蛋白质表征为uniprot登录号p00533。
[0030]
正如本文所用，术语“成纤维细胞生长因子(fgf)”是指调节广谱生物学功能(包括细胞增殖、存活、迁移和分化)的细胞信号传导分子家族。人fgf家族目前由22个结构相关成员组成。fgf能够结合并激活fgf受体，这些受体是跨膜糖蛋白，这些跨膜糖蛋白是蛋白激酶超家族的成员。目前，已知有4种fgf受体，称为fgfr1-4。
[0031]
如本文所用，术语“组合”是指向对此有需要的患者给予有效量的乐伐替尼和egfr抑制剂。乐伐替尼和egfr抑制剂可以在一种药物制剂中提供，或作为两种不同的药物制剂提供。
[0032]
正如本文所用，术语“有效量”是指对于待治疗的癌症产生作用的药物化合物如乐伐替尼和egfr抑制剂的量。
[0033]
正如本文所用，术语“癌”是指具有上皮源的癌症。
[0034]
正如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”是指阻断免疫细胞与其他细胞或细胞因子之间的抑制性相互作用并可以由此增加对癌细胞的杀伤的分子。检查点相互作用分子的实例有pd-1/pd-l1和ctla-4/b7-1/b7-2。优选的免疫检查点抑制剂是阻断pd-1和pd-l1之间相互作用的分子。所述阻断pd-1和pd-l1之间相互作用的分子优选是pd1的抗体和/或pdl1的抗体。
[0035]
治疗方法
[0036]
本文提供了一种治疗患有肝细胞癌的个体的方法，包括向所述个体提供乐伐替尼和egfr抑制剂。
[0037]
本文还提供了egfr抑制剂在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的用途，其中所述治疗还包括乐伐替尼。
[0038]
本文还提供了乐伐替尼在制备用于治疗肝细胞癌的药物中的用途，其中所述治疗还包括egfr抑制剂。
[0039]
本文还提供了适用于治疗肝细胞癌的乐伐替尼和egfr抑制剂的组合。肝细胞癌是将会受益于乐伐替尼和egfr抑制剂组合治疗的癌症的优选实例。
[0040]
患有癌症的患者可以根据东部肿瘤协作集团(eastern cooperative oncology group)(ecog)表现状态(performance status)进行评分，这是一种整体健康状况的标度测量，其中0表示完全活跃，而5表示死亡。
management res11:3847
–
3860)。乐伐替尼会抑制vegfr家族，ki为1nmol/l，对于ret的ki为1.5nmol/l，对于fgfr1的ki为221nmol/l，对于fgfr2的ki为8.21nmol/l，对于fgfr3和kit的ki值分别为151nmol/l和11nmol/l(capozzi et al.,2019.cancer management res11:3847
–
3860)。
[0050]
合适的egfr抑制剂包括吉非替尼(n-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺；优选日剂量为50-500mg，如约125-250mg)、厄洛替尼(n-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺；优选日剂量为50-500mg，如约150mg)、拉帕替尼(n-[3-氯-4-[(3-氟苯基)甲氧基]苯基]-6-[5-[(2-甲基磺酰基乙基氨基)甲基]呋喃-2-基]喹唑啉-4-胺；优选日剂量为500-2500mg，如约1250mg)、西妥昔单抗(重组表皮生长因子受体结合抗体片段(f
ab
)，优选周剂量25-300mg，优选约100mg；或100-500mg/m2，优选250-400mg/m2)、来拉替尼(neratinib)((e)-n-[4-[3-氯-4-(吡啶-2-基甲氧基)苯胺基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺；优选日剂量为100-500mg，如约240mg)、奥希替尼(osimertinib)(n-[2-[2-(二甲氨基)乙基-甲氨基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]氨基]苯基]丙-2-烯酰胺；优选日剂量10-250mg，如约80mg)、帕尼单抗(panitumumab)(特异性结合人表皮生长因子受体(egfr)的重组人igg2单克隆抗体，优选每周或每两周剂量200-1000mg，优选约600mg；或2-10mg/kg，优选约6mg/kg)、凡德他尼(vandetanib)(n-(4-溴-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺；优选日剂量为100-2500mg，如约600mg)、耐昔妥单抗(necitumumab)(防止egf与其受体结合的重组单克隆igg1抗体；优选周剂量200-2000mg，优选约800mg)，达克替尼(dacomitinib)((e)-n-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基]-4-哌啶-1-基丁-2-烯酰胺；优选日剂量为5-250mg，如约45mg)、阿法替尼(afatinib)((e)-n-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-[(3s)-四氢呋喃(oxolan)-3-基]氧基喹唑啉-6-基]-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺；优选日剂量为5-250mg，如约40mg)、卡纳替尼(canertinib)(n-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-(3-吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-6-基]丙-2-烯酰胺；优选日剂量为5-1000mg，如约100mg)或其组合。
[0051]
优选的egfr抑制剂是吉非替尼和厄洛替尼。优选的组合是乐伐替尼和吉非替尼，以及乐伐替尼和厄洛替尼。
[0052]
最优选的组合包括乐伐替尼和吉非替尼。用于治疗患有肝细胞癌的患者的方法中作为表皮生长因子受体(egfr)抑制剂的所述乐伐替尼和吉非替尼的组合优选包括以约8mg/天的日剂量对体重小于60kg的癌症患者，对体重超过60kg的癌症患者以12mg/天的日剂量，联合日半剂量0.125g/天的吉非替尼给予乐伐替尼。如果该组合耐受性良好，则例如，一周后，可以将吉非替尼的日剂量调整至约0.25g/天的全剂量。
[0053]
在根据本发明使用的组合中，乐伐替尼与egf抑制剂同时、分开或依次给药。当作为两种不同的药物制剂给药时，它们可以在同一天或不同天，并使用类似或不同的给药方案，如每天一次、每天两次、每两周一次、口服和/或输注，向对此需要的患者给药。所述组合优选根据取决于待治疗的患者(年龄、体重、治疗史等)的方案进行重复给药，这能够由熟练的医师确定。所述方案可以包括每天给药长达1-30天，如2天、10天或21天，然后是1-14天如7天的周期，其中不给予抑制剂。
[0054]
用于根据本发明治疗肝细胞癌的方法中的所述乐伐替尼和egfr抑制剂的组合可
以进一步与免疫检查点抑制剂如pd1/pdl1抑制剂和/或ctla-4的抗体进行组合。
[0055]
合适的免疫检查点抑制剂是pd1/pdl1抑制剂如抗体，包括派姆单抗(pembrolizumab)(merck)、纳武单抗(nivolumab)(bristol-myers squibb)、匹迪珠单抗(pidilizumab)(medivation/pfizer)、medi0680(amp-514；astrazeneca)和pdr001(novartis)；融合蛋白，如pd-l2 fc融合蛋白(amp-224；glaxosmithkline)；阿替丽珠单抗(atezolizumab)(roche/genentech)、阿维单抗(avelumab)(merck/serono and pfizer)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(astrazeneca)、bms-936559(bristol-myers squibb)；和小分子抑制剂，如pd-1/pd-l1抑制剂1(wo2015034820；(2s)-1-[[2,6-二甲氧基-4-[(2-甲基-3-苯基苯基)甲氧基]苯基]甲基]哌啶-2-羧酸)、bms202(pd-1/pd-l1抑制剂2；wo2015034820；n-[2-[[[2-甲氧基-6-[(2-甲基[1,1'-联苯基]-)-3-基]甲氧基]-3-吡啶基]甲基]氨基]乙基]-乙酰胺)和pd-1/pd-l1抑制剂3(wo/2014/151634；(3s,6s,12s,15s,18s,21s,24s,27s,30r,39s,42s,47as)-3-((1h-咪唑-5-基)甲基)-12,18-双((1h-吲哚-3-基)甲基)-n,42-双(2-氨基-2-氧代乙基)-36-苄基-21,24-二丁基-27-(3-胍基丙基)-15-(羟甲基)-6-异丁基-8,20,23,38,39-五甲基-1,4,7,10,13,)。其他抗pd1分子包括纬拉妥珠单抗(ladiratuzumabvedotin)(seattle genetics)。
[0056]
用于根据本发明的治疗肝细胞癌的方法中使用的所述乐伐替尼和egfr抑制剂的组合可以进一步与成纤维细胞生长因子抑制剂组合，该成纤维细胞生长因子抑制剂包括azd4547(n-[5-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙基]-1h-吡唑-3-基]-4-[(3s,5r)-3,5-二甲基哌嗪-1-基]苯甲酰胺；优选每日一次或每日两次，口服剂量为10-250mg，如约80mg)；ly2874455(2-{4-[(e)-2-{5-[(1r)-1-(3,5-二氯-4-吡啶基)乙氧基]-1h-吲唑-3-基}乙烯基]-1h-吡唑-1-基}乙醇；优选每日一次或每日两次，口服剂量1-100mg，如约8-24mg)；ch5183284(debio-1347；[5-氨基-1-(2-甲基-3h-苯并咪唑-5-基)吡唑-4-基]-(1h-吲哚-2-基)甲酮；优选每天一次或每日两次，口服剂量为5-1000mg，如约10-150mg)；英菲格拉替尼(infigratinib)(bgj398；3-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-1-[6-[4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯胺基]嘧啶-4-基]-1-甲基脲；优选每天一次或每天两次，口服剂量50-10000mg，如约150mg)；培米加替尼(pemigatinib)(incb054828；11-(2,6-二氟-3,5-二甲氧基苯基)-13-乙基-4-(吗啉-4-基甲基)-5,7,11,13-四氮杂三环[7.4.0.02,6]十三烷-1,3,6,8-四烯-12-酮；优选每日一次或每日两次，口服剂量1-100mg，如约13.5mg)；罗加替尼(rogaratinib)(4-[[4-氨基-6-(甲氧基甲基)-5-(7-甲氧基-5-甲基-1-苯并噻吩-2-基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基]甲基]哌嗪-2-酮；优选每日一次或每日两次，口服剂量为10-1500mg，如约800mg)；prn1371(8-[3-(4-丙烯酰基-1-哌嗪基)丙基]-6-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)-2-(甲基氨基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8h)-酮；优选每天一次或每天两次，口服剂量1-150mg，如约35mg)；褔巴替尼(futibatinib)(tas-120；1-[(3s)-3-[4-氨基-3-[2-(3,5-二甲氧基苯基)乙炔基]吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]吡咯烷-1-基]丙-2-烯-1-酮；优选每天一次或每天两次，口服剂量1-200mg，如约4-24mg)；非索加替尼(fisogatinib)(blu-554；n-[(3s,4s)-3-[[6-(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)喹唑啉-2-基]氨基]噁烷-4-基]丙-2-烯酰胺；优选每日一次或每日两次，口服剂量10-600mg，如约200mg)；h3b-6527(n-{2-[(6-{[(2,6-二氯-3,5-二甲氧基苯基)氨基甲酰基](甲基)氨基}-4-嘧啶基)氨基]-5-(4-乙基-1-哌嗪基)苯基}丙烯酰胺；优选每天一次或每天两次，口服剂量100-2000mg，如约
500-1000mg)；或其组合。
[0057]
此外，用于治疗肝细胞癌的方法中的乐伐替尼和egfr抑制剂的组合可以与一种或多种化学治疗剂，包括细胞毒剂、免疫调节剂和免疫毒剂进行组合。
[0058]
所述一种或多种化疗剂包括烷基化剂如白消安、美法仑、卡铂、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、卡莫司汀、尼莫司汀、洛莫司汀、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺、萘维滨和阿曲他明，抗生素如利霉素、多柔比星、阿霉素、伊达比星、表柔比星和普卡霉素，抗代谢物如磺胺、叶酸拮抗剂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶(5-fu)、亚叶酸(leucovorine)、具有5-fu的亚叶酸、具有叶酸钙(calcium folinate)和亚叶酸盐(leucovorin)的5-fu、卡培他滨、巯基嘌呤、克拉屈滨、喷司他汀、甲氨蝶呤、雷替曲塞、培美曲塞、硫鸟嘌呤，和喜树碱衍生物如拓扑替康和伊立替康，激素及其拮抗剂如氟他胺、戈舍瑞林、米托坦和他莫昔芬，芥子气衍生物如美法仑、卡莫司汀和氮芥，以及生物碱(alkaloid)如紫杉烷、多西他赛、紫杉醇、依托泊苷、长春新碱、长春碱和长春瑞滨。
[0059]
用于根据本发明使用的所述乐伐替尼和egfr抑制剂的组合可以与诸如以下的g2检查点消除剂组合或交替使用：如sb-218078(9,10,11,12-四氢-9,12-环氧-1h-二吲哚[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮杂辛(benzodiazocine)-1,3(2h)-二酮)和ucn-01((3r,9s,10r,11r,13r)-2,3,10,11,12,13-六氢-3-羟基-10-甲氧基-9-甲基-11-(甲基氨基)-9,13-环氧-1h,9h-二吲哚并[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]吡咯并[3,4-j][1,7]苯并二氮杂壬(benzodiazonin)-1-酮)；粘着斑激酶抑制剂(focal adhesion kinase inhibitor)，如苯磺酸氨氯地平(amlodipine besylate)(苯磺酸；3-o-乙基5-o-甲基2-(2-氨基乙氧基甲基)-4-(2-氯苯基)-6-甲基-1,4-二氢吡啶-3,5-二羧酸酯)，德法替尼(defactinib)(n-甲基-4-[[4-[[3-[甲基(甲基(甲基磺酰基)氨基]吡嗪-2-基]甲基氨基]-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基]氨基]]苯甲酰胺)或gsk2256098(2-[[5-氯-2-[(5-甲基-2-丙烷-2-基吡唑-3-基)氨基]吡啶-4-基]氨基]-n-甲氧基苯甲酰胺)；和/或抗代谢物，如磺酰胺类、叶酸拮抗剂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶(5-fu)、亚叶酸、具有5-fu的亚叶酸、具有卡培他滨的5-fu、巯基嘌呤、克拉屈滨、喷司他汀、甲氨蝶呤、雷替曲塞、培美曲塞，硫鸟嘌呤和喜树碱衍生物如拓扑替康和伊立替康。
[0060]
本发明还提供了一种治疗受试者肝细胞癌的方法，该方法包括，无论是否与免疫检查点抑制剂、fgf抑制剂、化疗剂或其组合结合与否，同时、分开或依次向受试者给予乐伐替尼和egfr抑制剂。
[0061]
组合物
[0062]
根据本发明使用的乐伐替尼和egfr抑制剂的组合可以在一种药物制剂中提供，或作为两种或更多种不同药物制剂提供。正如本领域技术人员所知，所述单一或不同的药物制剂还包含药用赋形剂。对于口服给药，优选的药物制剂由片剂提供。术语“片剂”涵盖“胶囊(capsule)”和“囊片(caplet)”。
[0063]
药用赋形剂包括稀释剂，粘合剂或制粒成分，碳水化合物如淀粉，淀粉衍生物如乙酸淀粉和/或麦芽糖糊精，多元醇如木糖醇、山梨糖醇和/或甘露醇，乳糖如α-乳糖一水合物、无水α-乳糖、无水β-乳糖、喷雾干燥乳糖和/或凝聚乳糖，糖如葡萄糖、麦芽糖、葡萄糖结合剂(dextrates)和/或菊粉(inulin)或其组合，确保有效压片的助流剂(流动助剂)和润滑剂，以及增强味道的甜味剂或调味剂。
[0064]
因此，本发明提供了一种包含乐伐替尼和egfr抑制剂的药物组合物。所述药物组合物优选用于治疗患有肝细胞癌的患者的方法。
[0065]
本发明还提供了一种包含乐伐替尼和egfr抑制剂的套件试剂盒，作为用于同时、单独或按序用于治疗受试者肝细胞癌的联合制剂。所述套件试剂盒还可以包含含有合适免疫检查点抑制剂如pd1/pdl1抑制剂的药物组合物。所述试剂盒还可以包含含有免疫检查点抑制剂、fgf抑制剂、化疗剂或其组合的药物组合物。
[0066]
为了清楚和简明描述的目的，本文将特征描述为相同或单独的方面及其优选实施方式的一部分，然而，应当理解的是，本发明的范围可以包括具有所有或一些所述特征的组合的实施方式。
[0067]
现在将通过以下实施例举例说明本发明，这些实施例以举例说明而非限制的方式提供，并且应当理解的是，在不背离本发明的精神和所附权利要求的范围的情况下，可以对所描述的方法和所指示的量作出许多变化。
[0068]
实施例
[0069]
实施例1
[0070]
为了研究肝癌细胞系如何在体外对乐伐替尼作出反应，我们使用长期增殖分析测试和短期celltiter-blue活力分析测试确定了乐伐替尼在11种肝癌细胞系中的效能。结果表明，大多数细胞系在体外对乐伐替尼并非不敏感(图1中a，b)。
[0071]
为了找到能够在hcc中与乐伐替尼协同作用的潜在药物靶点，我们使用靶向hcc细胞系snu449中的人激酶组的crispr-cas9基因筛选用乐伐替尼进行合成致死率筛选。用慢病毒激酶组grna库感染snu449细胞，并在不存在或存在乐伐替尼的情况下培养14天。在此之后，从处理过和未处理过的细胞中都分离出基因组dna，并在三个生物重复物中通过对包含于每个grna载体中的条形码进行下一代测序而确定grna的相对丰度，正如以下文献中所述(evers et al.,2016.nat biotechnol 34:631-3)。几种靶向egfr的独立grna载体被鉴定为在乐伐替尼存在下被特异性耗尽，这表明egfr抑制作用与乐伐替尼一起是合成致死的。为了验证这一发现，我们用三种egfr shrna载体感染了snu449细胞(所有这些载体都降低了egfr水平；图1中c)，并在有或没有乐伐替尼的情况下培养这些细胞约10天。结果表明，egfr与乐伐替尼联合的抑制作用导致snu449细胞的增殖受到显著抑制(图1中d)。
[0072]
随后，用乐伐替尼和egfr抑制剂(吉非替尼和厄洛替尼)的组合治疗表达相对高水平egfr(snu449、jhh1和huh6)或低水平egfr(mhcc97h、snu398和hepg2)的肝癌细胞系。短期细胞增殖分析测试结果表明，在高egfr水平的肝癌细胞系中观察到这两种抑制剂之间的强协同作用，但在低水平egfr的肝癌细胞系中没有观察到(图2)。在长期集落形成分析测试中观察到相当的结果(数据未显示)。
[0073]
为了解决在肝癌中乐伐替尼和egfr抑制之间协同作用内在的分子机制，我们用可识别egfr信号通路成分激活状态的磷酸蛋白特异性抗体测试了药物处理细胞的裂解物。我们观察到用乐伐替尼治疗所有三种高egfr肝癌细胞系导致egfr的tyr 1068磷酸化强烈增加，这反映了受体的激活，以及其下游激酶erk1/2的磷酸化(图3)。这一观察结果表明，乐伐替尼治疗引发了egfr的强力反馈激活。此外，用乐伐替尼和吉非替尼或厄洛替尼组合对这些细胞的共治疗防止了egfr的这种反馈激活，以及erk1/2的激活(图3)。乐伐替尼、吉非替尼或两种药物组合治疗的rna测序后的gsea分析进一步指示出与组合治疗后egfr信号传导
下调相关的额外基因集富集(数据未显示)。同样，实时pcr的结果表明，组合治疗显著降低了mapk/erk信号传导的10个保守转录靶标(phlda1、spry2、spry4、dusp4、dusp6、ccnd1、epha2、epha4、etv4和etv5)的表达水平，表明组合治疗能够阻断这些肝癌细胞中的mapk通路活性(数据未显示)。
[0074]
为了评价体外研究结果是否能够在体内重现，将snu449(高egfr水平)细胞注射到裸小鼠体内。肿瘤建立后，异种移植物用载体、乐伐替尼、吉非替尼或这种组合治疗约27天。我们的结果表明，乐伐替尼和吉非替尼的组合引起了snu449细胞的完全生长抑制，没有任何毒性，而单一药物治疗在体内几乎没有抗肿瘤作用(图4中a，b)。为了研究egfr在原发性肝癌肿瘤中的表达水平，我们使用包含298个hcc样本的组织微阵列(tma)通过免疫化学分析对egfr进行分析。肿瘤组织中的egfr水平分为阴性(negative)、低、中或高表达。当通过放大规则的h-评分法评价时，总数的大约52.6％(157例)被确定为egfr阳性hcc患者(图5)。这些结果表明，临床上超过50％的hcc患者可能受益于乐伐替尼和egfr抑制剂的组合。
[0075]
实施例2
[0076]
不同肺癌细胞(a549、nci-h1975和nci-h2030)、胰腺癌细胞(aspc-1、mia paca-2、panc 10.05和panc-1)和结肠癌细胞(hct116、lovo、sw620和widr)用乐伐替尼、egfr抑制剂吉非替尼或乐伐替尼和egfr抑制剂吉非替尼的组合进行生长和治疗。所用的浓度为0、0.625、1.25和2.5μm的吉非替尼和0、2.5和5μm的乐伐替尼。10-14天后对细胞进行固定并染色。所有细胞系均能够从atcc.org的美国典型培养物保藏中心(american type culture collection)获得。
[0077]
正如图6所示，乐伐替尼和egfr抑制剂吉非替尼的组合并不会降低这些癌细胞的生长。