治疗牛乳腺炎的方法与流程

2022-02-22 07:00:28 来源：中国专利 TAG：

序列表声明

于2020年3月22日建立的标题为82071SequenceListing.txt的ASCII文件(包括112,531个字节)与本申请同时提交，通过引用并入本文。

技术领域和背景技术

本发明，在其一些实施方式中，涉及用于治疗牛乳腺炎的益生菌组合物，并且更具体地但不排他地，涉及用于治疗牛乳腺炎的包含生物膜产生细菌的组合物。

牛乳腺炎是乳制品行业最严重的问题之一，影响牛奶产量、成分和质量。它的治疗费用非常昂贵，因此寻找新的和可持续的乳腺炎治疗解决方案是该行业的当务之急。迄今为止，最流行的牛乳腺炎治疗方法是使用抗生素，从健康和环境的角度来看，这可能是有问题的。

已知细菌是牛乳腺炎的主要原因。与牛乳腺炎相关的细菌的例子包括大肠杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphylococcus,CNSs)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。一些已知会引起牛乳腺炎的细菌菌株也会在下游应用中引起食物中毒。

奶牛乳房的外皮始终处于易受微生物感染和污染的环境中。奶牛的乳头水箱和条纹管是通向奶牛乳房内部的大门，因此它们的微生物群不断受到外部细菌污染的挑战，因此使它们成为有价值的分离物的良好候选者。对奶牛的乳头池和条纹管微生物群进行了几项研究⁸，其中一些与牛乳腺炎有关^9,10。Maria Carolina Espeche等人¹¹进行了一项研究，重点研究奶牛条纹管中的乳酸菌(LAB)，确定牛链球菌(Streptococcus bovis)和肠系膜旁肠球菌(Weissella paramesenteroides)为主要分离株。需要使用分离的细菌作为抗病原体细菌的试剂，并且可以为此目的服务于食品工业¹²。

背景技术包括Espeche,M.C.等人；兽医微生物学(Veterinary microbiology)，135,346-357(2009)。

技术实现要素：

根据本发明的一方面，提供了一种治疗或预防牛类动物的乳腺炎的方法，其特征在于，所述方法包含：向动物施用一治疗有效量的至少一微生物，所述微生物选自于由枯草杆菌(Bacillus subtilis)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、内生芽孢杆菌(B.endophyticus)、安全芽孢杆菌(Bacillus safensis)、内生芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、微细棒状杆菌(Corynebacterium minutissimum)、无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)、干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、水原拉梅尔芽孢杆菌(Rummeliibacillus suwonensis)及乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)所组成的群组，从而治疗或预防动物的乳腺炎。

根据本发明的实施方式，所述至少一微生物选自于由枯草杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、安全芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌、戊糖乳杆菌、假肠膜明串珠菌、藤黄微球菌、水原拉梅尔芽孢杆菌及乳酸片球菌所组成的群组。

根据本发明的实施方式，所述至少一微生物是枯草杆菌。

根据本发明的一个方面，提供了一种治疗或预防牛类动物的乳腺炎的方法，其特征在于，所述方法包含：将包括至少一益生菌微生物以及一生物膜产生细菌的一治疗有效量的一组合物局部施用于所述动物的一乳房，其中所述益生菌微生物被所述生物膜产生细菌包裹，从而治疗或预防所述动物的乳腺炎。

根据本发明的实施方式，所述益生菌微生物通过存在于在至少两个挤奶周期中未发生乳腺炎事件的一牛类动物的一乳房上来鉴定。

根据本发明的实施方式，所述生物膜产生细菌通过存在于在至少两个挤奶周期中未发生乳腺炎事件的一牛类动物的一乳房上来鉴定。

根据本发明的实施方式，所述施用包括局部施用。

根据本发明的实施方式，所述微生物以一乳头浸渍剂、一乳膏、一洗剂或一喷雾剂的形式施用。

根据本发明的实施方式，所述组合物以一乳头浸渍剂、一洗剂或一喷雾剂的形式施用。

根据本发明的实施方式，所述微生物是芽孢杆菌属。

根据本发明的实施方式，所述生物膜产生细菌是芽孢杆菌属。

根据本发明的实施方式，所述生物膜产生细菌是选自由无枝菌酸棒状杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)及乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)所组成的群组中的一属。

根据本发明的实施方式，所述益生菌选自于由微细棒状杆菌、干燥棒状杆菌、假肠膜明串珠菌、藤黄微球菌、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)及水原拉梅尔芽孢杆菌所组成的群组。

根据本发明的实施方式，所述乳腺炎是由选自于由金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)及凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphylococcus,CNSs)(Staphylococcus)所组成的群组的一病原体引起的。

根据本发明的实施方式，在所述施用之前，所述生物膜产生细菌包裹所述益生菌。

根据本发明的实施方式，在所述施用后，所述生物膜产生细菌包裹所述益生菌。

根据本发明的实施方式，所述生物膜产生细菌通过以下方式包裹所述益生菌：

(a)在产生包括所述益生菌及所述生物膜产生细菌的一生物膜的多个条件下，在一生长基质中体外共培养所述益生菌与所述生物膜产生细菌；以及

(b)从所述生长基质中分离所述生物膜。

根据本发明的实施方式，所述生长基质包括一生长培养基。

根据本发明的实施方式，所述生长培养基选自于由LB培养基、LBGM培养基、牛奶及微生物修复基质(MRS)所组成的群组。

根据本发明的实施方式，当所述生物膜产生细菌是所述芽孢杆菌属，并且所述益生菌是乳杆菌目时，所述生长基质是LBGM培养基、牛奶或微生物修复基质。

根据本发明的实施方式，所述生长基质是微生物修复基质。

根据本发明的实施方式，所述多个条件包括约6.5至8的一pH。

根据本发明的实施方式，所述多个条件包括6.8至7.5的一pH。

根据本发明的实施方式，所述生长基质包括乙偶姻。

根据本发明的实施方式，所述方法还包含在所述分离之后对所述生物膜进行脱水。

根据本发明的实施方式，所述益生菌微生物是一细菌。

根据本发明的实施方式，所述细菌包括不超过50种的细菌。

根据本发明的实施方式，所述生物膜产生细菌是单一种的生物膜产生细菌。

根据本发明的一方面，提供了一种物质的组合物，包含：至少两个种的细菌，选自于由枯草杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌、微细棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌、干燥棒状杆菌、乳酸乳球菌、假肠膜明串珠菌、藤黄微球菌、植物乳杆菌、水原拉梅尔芽孢杆菌及罗伊氏乳杆菌所组成的群组的一属，其中所述物质的组合物被配制用于局部递送。

根据本发明的实施方式，所述至少两个种的细菌选自于由枯草杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、安全芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌、戊糖乳杆菌、乳酸乳球菌、假肠膜明串珠菌、藤黄微球菌、水原拉梅尔芽孢杆菌、植物乳杆菌及乳酸片球菌所组成的群组的一属。

根据本发明的实施方式，所述至少两个种中的一个是枯草杆菌。

根据本发明的实施方式，所述组合物包括不超过50个种的细菌。

根据本发明的实施方式，所述至少两个种中的至少一个种产生一生物膜。

根据本发明的实施方式，所述生物膜包裹所述至少两个种中的第二种。

根据本发明的实施方式，所述组合物被配制成一乳头浸渍剂、一洗剂、一喷雾剂或一乳膏。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法及材料可以用于本发明的实施例的实践或测试中，但是下面描述了示例性的方法及/或材料。如有抵触，以专利说明书及其定义为准。另外，材料、方法及示例仅是说明性的，并非意图是限制性的。

附图说明

本发明的一些实施例在此仅通过示例并参考附图来描述。现在具体详细地参考附图，强调所显示的细节是通过示例的方式并且出于对本发明的实施例的说明性讨论的目的。在这点上，结合附图的描述使本领域技术人员清楚可以如何实践本发明的实施例。

附图中：

图1是用于分离相关乳头腔(teat cistern)和乳头沟(streak canal)细菌候选，以用于未来乳腺炎治疗的管道过滤过程的示意图；

图2A至图2B是细菌分离株选择和过滤阶段，(A)乳腺炎长期抗性奶牛体细胞计数(SCC)显示奶牛最有可能携带具有抗乳腺炎特征的细菌种群；以及(B)MALDI Biotyper分离株鉴定的系统发生树(系统发生树)；

图3A至图3C是相关分离株的抗菌指标针对：(A)一般食物病原体；(B)凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphylococcus,CNSs)；以及(C)已知的牛乳腺炎引起细菌病原体；以及

图4A至图4B是植物乳杆菌(L.plantarum)通过分泌挥发性化合物抑制各种病原体的生长，将植物乳杆菌接种在LB-MRS分隔板的MRS侧，并在有氧条件下在37℃下培养3天，然后在平板的LB侧接种不同的病原体：蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)；(A)代表性图像证明植物乳杆菌的挥发性化合物分泌对大肠杆菌存活的致死作用；(B)显示存活率的图表。

具体实施方式

本发明，在其一些实施方式中，涉及用于治疗牛乳腺炎的益生菌组合物，并且更具体地但不排他地，涉及用于治疗牛乳腺炎的包含生物膜产生细菌(biofilm-generating bacteria)的组合物。

在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应当理解，本发明的应用不一定限于以下描述中阐述的或由实施例举例说明的细节。本发明能够有其他实施例或能够以各种方式实践或实施。

牛乳腺炎(Bovine mastitis,BM)是奶牛生产中一种代价高昂的疾病。乳腺炎的预防和治疗通常通过使用会对牛奶质量产生负面影响的抗菌产品来进行。

本发明人现在提出益生菌微生物用于预防和治疗这种疾病的用途。

本发明人分析了在对乳腺炎表现出长期抗性的奶牛的乳房微生物组中发现的细菌，并提出将这些细菌用作益生菌来治疗和预防这种疾病。具体而言，本发明人在345个初始分离株库(initial isolates library)中发现了57个潜在菌株，它们显示出与抗微生物活性、生物膜形成以及抗生素敏感性相关的有趣特征。

在一个实施方式中，提供了一种治疗或预防牛类动物的乳腺炎的方法，包括向动物施用一治疗有效量的至少一微生物，所述微生物选自于由枯草杆菌(Bacillus subtilis)、索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、内生芽孢杆菌(B.endophyticus)、安全芽孢杆菌(Bacillus safensis)、内生芽孢杆菌(Bacillus endophyticus)、液化淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、微细棒状杆菌(Corynebacteriumminutissimum)、无枝菌酸棒状杆菌(Corynebacterium amycolatum)、干燥棒状杆菌(Corynebacterium xerosis)、戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)、假肠膜明串珠菌(Leuconostoc pseudomesenteroides)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、水原拉梅尔芽孢杆菌(Rummeliibacillus suwonensis)及乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)所组成的群组，从而治疗或预防动物的乳腺炎。

在另一个实施方式中，所述微生物选自于由枯草杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、安全芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌、戊糖乳杆菌、假肠膜明串珠菌、藤黄微球菌、水原拉梅尔芽孢杆菌及乳酸片球菌所组成的群组。

在另一个实施方式中，所述微生物选自于由枯草杆菌、乳酸片球菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌及戊糖乳杆菌所组成的群组。

在另一个实施方式中，所述微生物是枯草杆菌属。

确认细菌属的身份的方法是本领域已知的，并且包括MALDI TOFF以及16S rRNA测序。

可用于治疗乳腺炎的示例性细菌是与上述物种至少96％、97％、98％、99％或是甚至100％相同的细菌。

示例性细菌种是包含与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：30中列出的序列至少96％、97％、98％、99％或是甚至100％相同的16S rRNA序列的细菌种。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于那些已知的方式、手段、技术和程序，或是化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者从已知的方式、方法、技术和程序中发展而来的那些方式、手段、技术和程序。

如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展，基本上改善病症的临床或美学症状，或是基本上防止病症的临床或美学症状的出现。

牛乳腺炎是乳腺的炎症反应，与感染病原体的存在有关。尽管直接观察其临床形式时该疾病是明显的，但潜在性乳腺炎(sub-clinical)比临床乳腺炎更普遍，由于它通常在临床形式之前并且更难以发现，因此此疾病可能成为长期感染并且更难以克服。此外，乳腺炎的潜在性形式涉及微生物菌落的存在，这些微生物菌落可导致畜群内其他动物的交叉污染和感染。

在一个实施方式中，牛乳腺炎是临床表现出的牛乳腺炎。

在另一个实施方式中，牛乳腺炎是潜在性牛乳腺炎。

根据本发明治疗的牛通常是反刍动物(例如，奶牛、野牛、水牛、羚羊、叉角羚(pronghorn)、蓝牛羚(nilgai))。

根据一具体实施方式，牛是奶牛。

根据一特定实施方式，牛是泌奶牛。

可根据本发明的此方面进行治疗(预防性或主动性)的特定奶牛品种包括但不限于艾尔郡牛(Ayrshire)、瑞士褐牛(Brown Swiss)、澳大利亚商业奶牛(Australian commercial dairy cow)、奶牛短角牛(Dairy shorthorn)、荷斯坦牛(Holstein)、更赛牛(Guernsey)、萨希瓦尔牛(Sahiwal)、伊拉瓦拉牛(Illawarra)、娟珊牛(Jersey)、默兹-莱茵-伊塞尔牛(Meuse-Rhine-Issel)、红色无角牛(Red Poll)、西门塔尔牛(Simmental)、澳大利亚红种牛(Australian Red breed)、澳大利亚弗里西亚萨希瓦尔牛(Australian Friesian Sahiwal)以及澳大利亚挤奶瘤牛(Australian milking zebu)，或是其杂交。

施用于牛类动物的益生菌微生物通常局部施用于乳头/乳房区域。因此，微生物可以以乳头浸渍剂、乳膏、洗剂或喷雾剂的形式施用。

本发明人建议施用至少一种、至少两种、至少三种或更多种细菌。

根据一具体实施方式，至少一种被施用的细菌是生物膜产生细菌(biofilm producing bacteria)。

如本文所用，术语“生物膜(biofilm)”是指包含(例如，嵌入或包封)在它们产生的胞外聚合物质的基质中的细菌群落。通常，与自由漂浮的浮游(planktonic)细菌相比，存在于生物膜中的细菌在生长速率和基因转录方面表现出改变的表型。可能存在于生物膜中的胞外聚合物质的示例包括胞外多糖(例如，由epsA-O操纵子的产物合成的那些)和淀粉样纤维(amyloid fibers)(例如，由tapA-sipW-tasA操纵子编码的那些)。因此，基质通常包含细胞外DNA和蛋白质，以及碳水化合物。

应当理解，生物膜产生细菌还可能有益于治疗/预防乳腺炎。

优选地，生物膜产生细菌对人或牛受试者是非致病性的(即，不会对人或牛受试者造成身体伤害或疾病)。

在一个实施方式中，生物膜产生细菌属于芽孢杆菌属(genus Bacillus)。

如本文所用，术语“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知的生物膜产生细菌的所有成员，包括但不限于枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、液化淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、耐盐芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。

根据一个特定的实施方式，芽孢杆菌属包括枯草杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、安全芽孢杆菌、内生芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌。

人们认识到芽孢杆菌属继续进行分类重组。因此，此属旨在包括已重新分类的种，包括但不限于例如嗜热脂肪芽孢杆菌之类的生物，其现在被命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)”。在氧气存在的情况下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的定义特征，尽管这一特征也适用于最近命名的环状脂肪酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、无氧芽胞杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、线芽胞杆菌属(Filobacillus)、纤细芽胞杆菌属(Gracilibacillus)、盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、解脲芽胞杆菌属(Ureibacillus)和枝芽胞杆菌属(Virgibacillus)。

在一个实施方式中，生物膜产生细菌属于枯草杆菌种。

本发明考虑的枯草杆菌的示例性菌株包括但不限于枯草杆菌MS1577和127185/2(MS302；乳品分离株)和NCIB3610。

本发明考虑的副地衣芽孢杆菌(Bacillus paralicheniformis)的示例性菌株包括但不限于副地衣芽孢杆菌MS303和副地衣芽孢杆菌S127。

本发明考虑的示例性地衣芽孢杆菌菌株包括但不限于地衣芽孢杆菌MS310和地衣芽孢杆菌MS307。

根据一个特定的实施方式，生物膜产生细菌不包括蜡样芽孢杆菌(B.cereus)。

根据一具体实施方式，产生生物膜的芽孢杆菌是枯草杆菌、内生芽孢杆菌、安全芽孢杆菌和/或液化淀粉芽孢杆菌。

根据另一个实施方式，产生生物膜的细菌是选自由无枝菌酸棒状杆菌、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)组成的群组中的一属。

在一个实施方式中，在施用前培养生物膜产生细菌，使得它们产生生物膜。

生物膜产生细菌可以在施用前与另外的有益细菌共培养。

在另一个实施方式中，在增强另外的有益细菌包封至生物膜中的条件下，将生物膜产生细菌与另外的有益细菌共培养。

用于治疗牛乳腺炎的有益细菌的例子包括但不限于微细棒状杆菌、干燥棒状杆菌、假肠膜明串珠菌、藤黄微球菌、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、海氏肠球菌(Enterococcus hirae)和水原拉梅尔芽孢杆菌。

其他示例包括以下所示的菌：牛链球菌(Streptococcus bovis)CRL 1710、牛链球菌CRL 1715、牛链球菌CRL 1717、牛链球菌CRL 1718、牛链球菌CRL 1725、牛链球菌CRL 1726、牛链球菌CRL 1728、牛链球菌CRL 1729、牛链球菌CRL 1730、牛链球菌CRL 1731、牛链球菌CRL 1737、牛链球菌CRL 1738、牛链球菌CRL 1739、牛链球菌CRL 1742、牛链球菌CRL 1743、牛链球菌CRL 1745、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CRL 1711、海氏肠球菌CRL 1712、海氏肠球菌CRL 1732、芒地肠球菌(Enterococcus mundtii)CRL 1713、芒地肠球菌CRL 1656、植物乳杆菌CRL 1716、魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)CRL 1719、魏斯氏菌CRL 1721,魏斯氏菌CRL 1723、魏斯氏菌CRL 1733、魏斯氏菌CRL 1740、魏斯氏菌CRL 1741、少糖肠球菌(Enterococcus saccharominimus)CRL 1720、解糖肠球菌(Enterococcus saccharolyticus)CRL 1735、恶味乳杆菌(Lactobacillus perolens)CRL 1724、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)CRL 1655、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)CRL 1736、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)CRL 1744、乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp lactis)CRL 1746、罗伊氏乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)CRL 1734以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)CRL 1657。

为了产生共培养物，通常将有益培养物和生物膜产生培养物分开培养，以产生发酵剂(starter culture)。通常选择发酵剂的培养基和条件，以优化每种细菌的生长。

考虑的发酵剂包括干燥的发酵剂、脱水的发酵剂、冷冻的发酵剂或浓缩的发酵剂。

发酵剂培养至少2小时、4小时、8小时、12小时，直到繁殖出足够数量的细菌。

选择将有益细菌与生物膜产生细菌共培养的方法，以使其能够增殖两种类型的微生物，并且根据特定实施方式，将两种微生物并入生物膜中。

在一个实施方式中，共培养在通常用于培养有益细菌的生长基质中(或上)进行。生长基质(growth substrate)可以是固体或液体培养基。优选地，在培养过程中摇动共培养物。

可用于培养细菌的生长基质的示例包括但不限于牛奶及微生物修复基质(MRS)培养基、LB培养基、TBS培养基、酵母提取物、大豆蛋白胨、酪蛋白胨和肉胨。

培养基的其他示例列于下文的表1中。

表1

在特定实施方式中，用于将有益细菌与芽孢杆菌共培养的培养基包含锰。在另一实施方式中，培养基包含葡萄糖。在又一实施方式中，用于共培养的培养基包含锰和葡萄糖。

可在其上进行培养的示例性固体表面包括广泛的基质，范围从各种聚合物材料(硅酮、聚苯乙烯、聚氨酯和环氧树脂)到金属和金属氧化物(硅、钛、铝、二氧化硅和金)。为了改变固体表面的形貌，可以在这些材料上进行制造技术(软微影技术(soft lithography)和双铸成型(double casting molding)技术、微接触印刷、电子束光刻、纳米压印光刻、光刻、电沉积方法等)。

培养或共培养的条件可适于增强细菌的繁殖和/或增强生物膜的产生和/或增强有益细菌掺入产生生物膜的细菌中。此类条件包括但不限于环境参数，例如pH值、营养浓度、有益细菌与生物膜产生细菌之间的比率和温度。

在一个实施方式中，培养或共培养在生物反应器(bioreactor)中进行。

如本文所用，术语“生物反应器”是指适于支持有益细菌培养的装置。

生物反应器可适于支持生物膜的产生。在这种情况下，生物反应器通常包括一个或多个用于生物膜的支撑物，其可在其上形成膜，并且所述支撑物适于提供显着的表面积，以促进生物膜的形成。本发明的生物反应器可适用于连续生产。

应当理解，当在生物反应器系统中产生生物膜时，可以通过改变系统的微流体(例如绝对应力)来改变共培养的条件。

本发明此方面的培养(或共培养)可以在用于增加细菌繁殖和/或增强生物膜形成的附加试剂的存在下进行。此类试剂包括，例如乙偶姻。

可以改变乙偶姻的量和添加时间，以促进最佳的生物膜生产。在一个实施方式中，使用大约0.01-5％的乙偶姻。在另一个实施方式中，使用大约0.01-4％的乙偶姻。在另一个实施方式中，使用大约0.01-3％的乙偶姻。在另一个实施方式中，使用大约0.01-2％的乙偶姻。在另一个实施方式中，使用大约0.01-1％的乙偶姻。在另一个实施例中，使用大约0.01-0.5％的乙偶姻。

共培养物可以繁殖足够长的时间，以产生结合有益细菌与生物膜生成细菌的生物膜。

根据一个实施方式，共培养物生长至有益细菌的最大平台生长期(maximal plateau growth phase)，此时可收获它们，以实现最大生物膜产生。

根据另一个实施方式，共培养物生长至生物膜产生细菌的最大平台生长期，此时可收获它们，以获得最大生物膜产生。

因此，细菌可以培养至少3小时、至少6小时、至少12小时、至少24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间。在一个实施方式中，细菌培养不超过1周、2周、3周、4周、5周或6周。

一旦繁殖出足够数量的有益细菌(并且任选地封装在生物膜中)，就可以收获(即从生长基质中去除)细菌(或生物膜本身)。

在与生长基质分离后，生物膜(和/或并入其中的细菌)可以进行干燥(即脱水)、冷冻、喷雾干燥或冷冻干燥。优选地，以保持细菌活力的方式处理生物膜。

根据一个实施方式，益生菌被配制用于局部递送。局部制剂的实例包括但不限于美国专利申请号2015027296和US 20150182586中公开的那些，其内容通过引用并入本文。

在一个实施方式中，本文所述的益生菌组合物包含不超过100种细菌、不超过90种细菌、不超过80种细菌、不超过70种细菌、不超过60种细菌细菌，不超过50种细菌，不超过40种细菌，不超过30种细菌，不超过20种细菌，不超过10种细菌，不超过5种细菌，不超过4种细菌，不超过3种细菌，甚至不超过2种细菌。

应当理解，应选择包含在局部制剂中的试剂，使得它们不会损害其中细菌群的生存力。本发明人进一步考虑使用聚合物质或胶束，其可以暂时固定细菌细胞并为它们提供部分保护。

在一个实施方式中，局部制剂包含浓乳膏或润肤剂(用粘度控制剂制成)、薄膜、聚合物、胶乳等。除了有助于表面润湿外，局部制剂还可包含非离子表面活性剂，可有助于进一步增强组合物的阻隔性能。此类表面活性剂的实例可包括但不限于聚氧乙烯-聚氧丙二醇(以Pluronic F108销售)。另一种常用的阻隔剂作为Pluronic P105销售。在美国专利第4,113,854号中描述了提供乳头有效覆盖的乳胶材料。合适的屏障形成剂包括例如胶乳、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖、瓜尔胶、约翰尼斯树胶、纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羧乙基纤维素、羧甲基纤维素、淀粉、羟乙基淀粉、阿拉伯树胶、凝胶多糖、支链淀粉、葡聚糖、聚磺酸、聚丙烯酰胺、高分子量聚丙烯酸酯、高分子量交联聚丙烯酸酯、卡波姆、甘油、海藻酸钠、钙盐交联海藻酸钠、黄原胶、聚(乙烯醇)(PVA)和聚(N-乙烯基吡咯烷酮)(poly(N-vinylpyrrolidone))(PVP)。屏障形成剂的优选实施方式包括黄原胶、羧甲基纤维素、海藻酸钠、与钙盐交联的海藻酸钠、PVA、羟乙基纤维素、PVP和(2,5-二氧-4-咪唑烷基)-脲((2,5-dioxo-4-imidazolidinyl)-urea)(尿囊素)。

在所公开的益生菌组合物中可以使用发泡剂。发泡剂使液体组合物充气以产生泡沫，该泡沫可增加组合物的表面积并改善与待处理表面(例如动物乳头)的接触。通常，发泡剂采用压缩气体的形式，或在某些条件下会分解以释放气体的材料。合适的气体包括但不限于氮气、氩气、空气、二氧化碳、氦气及其混合物。此外，固体二氧化碳(干冰)、液氮、过氧化氢和其他通过状态变化或通过分解释放气体的物质也考虑与本发明组合物一起使用。通常，可以使用高泡表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸、烷基芳基聚醚硫酸钠、十二烷基醚硫酸钠、癸基硫酸钠、氧化椰油胺、C12-C14全椰子酰胺甜菜碱，产生稳定的泡沫。当压缩气体形式的搅拌与溶液混合时产生泡沫，通过将气体鼓泡到溶液中或通过喷雾设备喷雾溶液或溶液-气体混合物。合适的气体包括但不限于氮气、空气、二氧化碳及其混合物。泡沫也可以通过动物在组合物中行走的机械作用产生，或者通过将大气与组合物混合的其他机械方式产生。可以通过让动物穿过含有泡沫的区域或通过让动物穿过足浴溶液来施用组合物，此足浴溶液具有漂浮在溶液顶部的泡沫。

众所周知，表面活性剂用于发泡，并广泛用作洗手皂和手工/手洗餐具洗涤剂中的发泡剂，并且此类表面活性剂可在发泡可提高性能并增加组合物与特定基材的接触时间的应用中用作发泡剂。这样的例子。合适的阴离子表面活性剂可以选自线性烷基苯磺酸、线性烷基苯磺酸盐、烷基α-磺甲基酯、α-烯烃磺酸盐、醇醚硫酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、二烷基磺基琥珀酸盐及其碱金属、碱土金属、胺和铵盐。具体实例是直链C10-C16烷基苯磺酸、直链C10-C16烷基苯磺酸盐或它们的碱金属、碱土金属、胺和铵盐，例如十二烷基苯磺酸钠、C14-C16α-烯烃磺酸钠、甲基α-磺甲基酯钠和甲基α-磺基脂肪酸二钠盐。合适的非离子表面活性剂可选自烷基多糖苷(alkyl polyglucoside)、烷基乙氧基化醇(alkyl ethoxylated alcohol)、烷基丙氧基化醇(alkyl propoxylated alcohol)、乙氧基化丙氧基化醇(ethoxylatedpropoxylated alcohol)、脱水山梨糖醇(sorbitan)、脱水山梨糖醇酯、链烷醇酰胺(alkanol amide)。具体实例包括聚合度为1至3的C8-C16烷基多糖苷，例如聚合度为1.5的C8-C10烷基多糖苷(Glucopon^RTM 200)、聚合度为1.45的C8-C16烷基多糖苷(Glucopon^RTM 425)，聚合度为1.6的C12-C16烷基多糖苷(Glucopon^RTM625)。两性表面活性剂可选自烷基甜菜碱和烷基两性乙酸盐。合适的甜菜碱包括椰油酰胺丙基甜菜碱，合适的两性乙酸盐包括椰油两性乙酸钠、月桂基两性乙酸钠和椰油两性二乙酸钠。基于C12-C14烷基链长原料的烷基氧化胺，例如衍生自椰子油、棕榈仁油的那些，也是合适的发泡剂。

根据预期的使用环境，可以添加粘度控制剂以配制微生物组合物。在一个实例中，一些组合物具有优化的溶液粘度以赋予产品垂直粘附在乳头上是有利的。这种类型的粘性产品，尤其是具有合适的触变性、假塑性或粘弹性凝胶强度的粘性产品，可最大限度地减少产品的滴落以避免浪费，并且在乳头浸液组合物中特别有利。乳头浸渍组合物可受益于范围从1cPs至3000cPs的优选动态粘度。包括硬表面消毒剂在内的其他应用具有范围从约1cPs到300cPs的优选动态粘度。本申请中所指的粘度是Brookfield粘度，用Brookfield LV粘度计在环境温度(25摄氏度)下用转子#2@在3至30rpm转速下测量，单位为cP。在各种实施方式中，可添加增稠剂以实现50cPs至10000cPs或100cPs至4000cPs的粘度范围。

合适的粘度控制剂包括半纤维素，例如阿拉伯木聚糖和葡甘露聚糖；植物胶材料，例如瓜尔胶和johannistree树胶；纤维素及其衍生物，例如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素或羧甲基纤维素；淀粉和淀粉衍生物，例如羟乙基淀粉或交联淀粉；微生物多糖，例如黄原胶、海藻多糖，例如海藻酸钠、角叉菜胶、凝胶多糖、支链淀粉或葡聚糖、硫酸葡聚糖、乳清、明胶、壳聚糖、壳聚糖衍生物、聚磺酸及其盐、聚丙烯酰胺和甘油。优选的粘度控制剂是不同类型的纤维素及其衍生物，特别是羟烷基纤维素、甲基纤维素和甘油。高分子量(MW>1,000,000)交联聚丙烯酸型增稠剂是BF Goodrich(现为Lubrizol)以其Carbopol^RTM商标销售的产品，尤其是Carbopol^RTM 941，它是此类聚合物中对离子最不敏感的，以及Carbopol^RTM940和Carbopol^RTM934。Carbopol^RTM树脂，也称为“卡波姆”，在美国专利第5,225,096号中有所报道，是亲水性高分子量、交联丙烯酸聚合物。Carbopol^RTM941的分子量约为1,250,000，Carbopol^RTM940的分子量约为4,000,000，Carbopol 934的分子量约为3,000,000。Carbopol^RTM树脂与聚烯基聚醚交联，例如约1％的蔗糖聚烯丙醚，每个蔗糖分子平均具有约5.8个烯丙基。Carbopol^RTM树脂的更多详细信息可从B.F.Goodrich(Lubrizol)获得，例如参见B.F.Goodrich目录GC-67，Carbopol^RTM水溶性树脂。粘土和改性粘土如膨润土或合成锂皂石也可用作增稠剂。通常添加共增稠剂以提高凝胶基质的稳定性，例如胶体氧化铝或二氧化硅、脂肪酸或其盐可提高凝胶稳定性。典型的粘度控制成分包括黄原胶、羧甲基纤维素、海藻酸钠、与钙盐交联的海藻酸钠、聚磺酸及其盐、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇(PVA)、羟乙基纤维素和聚N-乙烯基吡咯烷酮(PVP)。

缓冲剂和pH调节剂：组合物的pH值可以通过添加酸性或碱性成分来选择性地调节。在一个实施例中，酸性pH是优选的。用作pH调节剂的合适的酸可以包括例如柠檬酸、乙酸、乳酸、磷酸、亚磷酸、氨基磺酸、硝酸、亚硝酸和盐酸。矿物酸可用于大幅降低pH值。可以通过添加碱性试剂例如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、酸二膦酸一钠或其组合来提高pH或使其更碱性。传统的酸缓冲剂例如柠檬酸、乳酸、磷酸也可用于维持所需的pH值。组合物的pH值可以通过添加酸性或碱性或缓冲材料来调节。

pH的物理性质可以通过添加酸或碱来调节，并且广泛优选在2.0至8.0的范围内用于乳头浸渍组合物和旨在接触皮肤的其他组合物。在更优选的意义上，此范围是从2.0到5.0，并且更优选的范围是从2.5到4.5。硬表面和商业消毒剂可能具有较低的pH值，例如2.0或1.0。

润湿剂或表面活性剂也称为表面活性剂。典型的润湿剂用于润湿应用表面，降低应用表面的表面张力，使产品可以轻松渗透到表面并去除不需要的污垢。组合物的润湿剂或表面活性剂提高配方的整体去污力，溶解或乳化一些否则不会溶解或乳化的有机成分，并促进活性成分深入渗透到预期应用表面的表面，例如乳头皮肤。

用于润湿的合适有效的表面活性剂可包括阴离子、阳离子、非离子、两性离子和两性表面活性剂。本发明应用中使用的润湿剂和表面活性剂可以是高泡型、低泡型和无泡型。合适的阴离子表面活性剂可以选自线性烷基苯磺酸、线性烷基苯磺酸盐、烷基α-磺甲基酯、α-烯烃磺酸盐、醇醚硫酸盐、烷基硫酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、二烷基磺基琥珀酸盐、以及它们的碱金属、碱土金属、胺和铵盐。具体实例是直链C10-C16烷基苯磺酸、直链C10-C16烷基苯磺酸盐或它们的碱金属、碱土金属、胺和铵盐，例如十二烷基苯磺酸钠、C14-C16α-烯烃磺酸钠、甲基α-磺甲基酯钠和甲基α-磺基脂肪酸二钠盐。合适的非离子表面活性剂可选自烷基多糖苷、烷基乙氧基化醇、烷基丙氧基化醇、乙氧基化丙氧基化醇、脱水山梨糖醇、脱水山梨糖醇酯、链烷醇酰胺。具体实例包括聚合度为1至3的C8-C16烷基多糖苷，例如聚合度为1.5的C8-C10烷基多糖苷(Glucopon^RTM200)、聚合度为1.45的C8-C16烷基多糖苷(Glucopon^RTM425)、聚合度为1.6的C12-C5烷基多糖苷(Glucopon^RTM 625)和聚乙氧基化聚氧丙烯嵌段共聚物(泊洛沙姆(poloxamers))，例如包括由BASF Chemical Co.商业化的Pluronic^RTM泊洛沙姆。两性烷基表面活性剂可以选自甜菜碱和两性乙酸烷基酯。合适的甜菜碱包括椰油酰胺丙基甜菜碱，合适的两性乙酸盐包括椰油两性乙酸钠、月桂基两性乙酸钠和椰油两性二乙酸钠。

本领域技术人员将认识到，因为在此组合物中包含至少一种表面活性剂(例如，阴离子表面活性剂)作为协同微生物剂，所以这些表面活性剂也会对混合物的润湿性能产生影响。

皮肤调理剂：皮肤调理剂也可任选地用于所公开的组合物中。皮肤调理剂可以在暴露于不利条件之前或之后为人或动物皮肤提供额外保护。例如，皮肤调理剂可以包括保湿剂，例如甘油、山梨糖醇、丙二醇、D-泛醇、聚乙二醇(PEG)200-10,000、聚乙二醇酯、酰基乳酸酯、聚季铵盐-7、甘油椰油酸酯/月桂酸酯(Glycerol Cocoate/Laurate,)、PEG-7甘油椰油酸酯(PEG-7Glycerol Cocoate)、硬脂酸、水解丝肽、丝蛋白、芦荟凝胶、瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵(Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride)、烷基聚葡萄糖苷/月桂酸甘油酯(Alkyl Poly Glucoside/Glyceryl Luarate)、乳木果油和可可脂；防晒剂，如二氧化钛、氧化锌、甲氧基肉桂酸辛酯(OMC)、4-甲基亚苄基樟脑(4-methylbenzylidene camphor，4-MBC)、氧苯酮和高水杨酸酯；止痒或麻木剂，例如芦荟、炉甘石、薄荷、薄荷脑、樟脑、抗组胺药、皮质类固醇、苯佐卡因(benzocaine)和盐酸帕罗沙明(paroxamine HCl)。

药物载体：益生菌组合物的典型载体或基质是去离子水，但本领域技术人员将容易理解，可以使用除水之外的其他溶剂或相容材料来实现细菌的有效浓度。在一些实施方式中，基于组合物的总重量，组合物可包含至少约60重量百分比(wt％)的水，并且优选至少约70wt％的水。丙二醇、乙二醇醚和/或乙醇也可以单独或与水组合用作载体。

载体还可包含有助于细菌繁殖和保持活性的营养物。

在一个实施方式中，至少一种本文所述的益生菌以生物膜的形式提供给牛类动物。

在另一个实施方式中，至少两种本文所述的益生菌以生物膜的形式提供给牛类动物，其中一种益生菌(通常单独不能产生生物膜)被第二种益生菌(通常单独能够产生生物膜)包裹。

在又一个实施方式中，本文所述的益生菌尚未预培养以形成生物膜。相反，在生物膜形成之前将益生菌提供给牛类动物。在生物膜仅在施用后才开始产生的条件下，可以将游离的、无限制的益生菌局部施用至牛动物的乳头/乳房区域。

如本文所用，术语“约”是指约±10％。

术语“包含”(comprises)、“包含”(comprising)、“包括”(includes)、“包括”(including)、“具有”(having)及其词形变化是指“包括但不限于”。

术语“由......组成”(consisting of)意指“包括并且限于”。

术语“基本上由......组成”(consisting essentially of)是指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤及/或部件，但前提是另外的成分、步骤及/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本特征及新特征。

本文所使用的单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述(the)”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。例如，术语“一化合物”或“至少一化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。

在整个申请中，本发明的各种实施方式可以以一范围形式呈现。但应当理解是，范围形式的描述仅仅是为了方便及简洁，不应被解释为对本发明的范围的强行限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及范围内的单个数值。例如，对从1到6的一范围的描述应视为已明确公开了例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及在所述范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5及6。无论范围的宽度皆适用。

每当在本文中指示一数值范围时，其意在包括在指示的范围内的任何引用数字(分数或整数)。短语“在一第一指示数字与一第二指示数字之间的范围”以及“自一第一指示数字至一第二指示数字的范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一及第二指示数字以及它们之间的所有分数及整数。

当参考特定序列表时，所述参考应理解为还包括与其互补序列基本对应的序列，包括，例如由测序错误、克隆错误或导致碱基替换、碱基缺失或是碱基添加的其他改变导致的微小序列变异(minor sequence variations)，前提是此类变异的频率小于50个核苷酸中的1个；或是，小于100个核苷酸中的1个；或是，小于200个核苷酸中的1个；或是，小于500个核苷酸中的1个；或是，小于1000个核苷酸中的1个；或是，小于5,000个核苷酸中的1个；或是，小于10,000个核苷酸中的1个。

应当理解，为了清楚起见，在分开的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地、或以任何合适的子组合、或适当地在本发明的任何其他描述的实施方式中提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必要特征，除非所述实施方式在没有那些元素的情况下不起作用。

如上文所述以及如以下权利要求书所述，本发明的各种实施方式及方面在以下示例中得到实验支持。

示例：

现在参考以下示例，这些示例与以上描述一起以非限制性方式说明了本发明的一些实施方式。

通常，本文使用的命名法和本发明使用的实验室程序包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的解释。参见，例如，“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A laboratory Manual)”Sambrook等人，(1989)；“分子生物学中的当前协议(Current Protocols in Molecular Biology)”第I-III卷Ausubel，R.M.，编辑；(1994)；Ausubel等人，“分子生物学的当前协议(Current Protocols in Molecular Biology)”，John Wiley and Sons，巴尔的摩，马里兰州(1989)；Perbal，“分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”，John Wiley&Sons，纽约(1988)；Watson等人，“重组DNA(Recombinant DNA)”，《科学美国人(Scientific American Books)》，纽约；比伦等人，(编辑)“基因组分析：实验室手册系列(Genome Analysis:A Laboratory Manual Series)”，卷1-4，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约(1998)；美国专利中阐述的方法，第4,666,828号；第4,683,202号；第4,801,531号；第5,192,659号和第5,272,057号；“细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Handbook)”，第I-III卷Cellis，J.E.，编辑，(1994)；“动物细胞培养-基本技术手册(Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique)”，Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994)，第三版；“免疫学的当前协议(Current Protocols in Immunology)”卷I-III，Coligan J.E.，编辑，(1994)；Stites(编辑)，“基础和临床免疫学(Basic and Clinical Immunology)”(第8版)，Appleton&Lange，诺沃克，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编辑)，“细胞免疫学的选择方法(Selected Methods in Cellular Immunology)”，W.H.Freeman and Co.，纽约(1980)；可用的免疫测定法在专利和科学文献中有广泛的描述，例如参见美国专利第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号和第5,281,521号；“寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)”Gait,M.J.，编辑，(1984)；“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”Hames,BD,and Higgins SJ,编辑(1985)；“转录与转译(Transcription and Translation)”，Hames,BD,及Higgins SJ编辑(1984)；“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”Freshney,RI,编辑(1986)；“固定化细胞和酶(Immobilized Cells and Enzymes)”IRL出版社，(1986)；“分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)”Perbal,B.，(1984)和“酶学方法(Methods in Enzymology)”第1-317卷，学术出版社；“PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications)”，学术出版社(Academic Press)，San Diego，CA(1990)；Marshak等人，“蛋白质纯化和表征策略-实验室课程手册(Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual)”CSHL出版社(1996)；所有这些内容均由参考，如同在本文中完整阐述。本文件中提供了其他一般参考。其中的程序被认为是本领域公知的，并且是为了读者的方便而提供的。其中包含的所有信息通过引用并入本文。

材料和方法

原奶(Raw milk)取样：

研究计划示意图如图1所示。根据NOA畜群记录数字记录中显示的历史，选择了来自以色列农业研究组织商业奶牛场(Rishon LeZion,Israel)的9头以色列荷斯坦牛(Holstein)-以色列奶牛群管理计划(Israeli Dairy Herd Management Program)(来自以色列牛饲养者协会(Israeli Cattle Breeders Association，ICBA))。额外的奶牛来自另外两家奶牛场。这些奶牛至少有两个干净的泌乳周期(最多6个)。干净的泌乳周期被视为在整个泌乳期的每月牛奶质量测试中体细胞计数(SCC)低于100。奶牛以无菌方式手工挤奶3次取样。挤奶过程如下：(1)将奶牛带到接近挤奶的时间，以使挤奶期间乳头池种群的微生物定植时间最长；(2)用消毒器清洁布清洁奶牛的乳头(每季度)(公司类型)在手动挤奶之前；(3)将3到6次第一次挤奶手冲程收集到15毫升无菌塑料管(体积为3到6毫升牛奶)中，作为微生物乳头池种群的代表；(4)在挤奶过程中采集了额外的牛奶样本，以评估是否有任何一个季度出现乳腺炎或微生物感染指标，如下所述。原奶样本在同一天进行进一步检测。

牛临床和细菌学测试：

对于细菌学检查，将10μl的每种牛奶样品接种到血琼脂(5％洗涤过的绵羊红细胞)和MacConkey琼脂平板(Bacto-Agar，Becton Dickinson)上。将平板在37℃下温育，并在18和42小时后检查细菌生长。为了评估乳腺对感染的免疫反应状态，使用流式细胞术(FACs Calibur流式细胞仪，Becton-Dickinson)和抗牛单克隆抗体(VMRD)进行体细胞分化(Leitner等人，2003)。使用的单克隆抗体是：抗CD18/11a-BAT 75A(免疫球蛋白(IgG-1))；抗CD4-GC 50A1 138A(IgM)；抗CD8-CACT 80C(IgG-1)；抗CD21-BAQ 15A(IgM)；抗CD14-CAM 36A(IgG-1)；和抗多形核(PMN)(G1)(IgM)。使用的所有单克隆抗体都与牛细胞具有物种反应性。使用的二抗多克隆抗体(Caltag Laboratories)是与三色(TC)缀合的山羊抗小鼠IgG-1和与FITC缀合的山羊抗小鼠IgM。

初步细菌分离：

来自第一个采样周期的初始乳头奶要么通过离心(10000rpm，20分钟)(离心机类型)浓缩，要么直接从样品中接种。在浓缩样品中，弃去上清液，将沉淀重新悬浮在250μl PBS中。然后将浓缩样品和非浓缩样品铺板在五种不同的琼脂平板类型上：LB(Difco，Le pont de claix，法国)、血琼脂、PCA(Oxoid，贝辛斯托克(Basingstoke)，英格兰)、BHI和MRS(Himedia，孟买,印度)10μL用于浓缩样品，100μL用于每个季度的非浓缩样品(每个周期共36个样品)。将板温育最多72小时。一旦检测到可见菌落，就从培养箱中取出分离物。然后，将分离物与散装牛奶样品的细菌学测试进行比较。根据菌落形态和与细菌学试验的比较，选择进一步检测的分离株。选择的菌落主要来自在细菌学测试中大量奶牛样品干净的菌落，但在初始牛奶样品中观察到大量菌落。从第一个、第二个和第三个采样周期(分别)中总共选择了140、92和48个分离株，并制备了甘油储备并储存在-80℃。

MALDI TOF分析：

为了进一步过滤相关生物技术相关物种的分离株，通过Bruker Daltonik MALDI Biotyper(Bruker Daltonik GmbH,Bremen,Germany)分类分析鉴定分离株。如下制备280个分离株用于分析：将选定的菌落悬浮在2ml无菌塑料管中的300μl纯PCR级水(Fisher，澳大利亚)中，加入900μl乙醇，并在13,000g下短暂涡旋离心后2分钟后，弃去上清液，将试管置于生物安全柜中晾干。然后，将20μl的70％甲酸加入管中，涡旋后，再向管中加入20μl纯乙腈并混合。将管以13,000g离心2分钟。将1μl上清液装入MALDI Biotyper读数板，干燥并覆盖1μl HCCA溶液(Sigma-Aldrich，Rehovot，以色列)。在Bruker Daltonik MALDI Biotyper中读取板，并使用以下MSP文库进行分析：BDAL、分枝杆菌文库(Mycobacteria Library)(珠法(bead method))、丝状真菌、李斯特菌(Listeria)。然后，将结果转移到克朗可视化程序²⁹。

病原体抑制试验：

对于抗菌特性测试，选择了来自MALDI Biotyper分类分析的分离株，这些分离株既不是人类病原体，也不是引起奶牛(cow)乳腺炎的病原体。根据来自第一分离阶段的原始来源平板，将分离株铺板在MRS或BHI板上。将平板上的菌落根据平板培养基的变化再次挑取到3ml新鲜液体培养基中，将使用的MRS调至pH 7，以防止标准MRS培养基的较低pH值产生假抑制，并在37℃下生长5小时。同时，几种常见的致病细菌物种，如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC10987、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA14以及特定的牛病原体：四种凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase Negative Staphylococcus,CNSs)171、179、188和189和三种一般牛病原体1989、8944/2和大肠杆菌的制备方法与分离株相同。在方形BHI琼脂平板(BarNaor)上进行微生物相互作用测试。200μl来自每个病原菌的起始培养物，分布在平板上。将带有50μl分离株起始物的5mm圆形Whatman 1滤纸盘放置在病原体接种表面上。平板在37℃下O/N温育，然后测量抑菌圈(inhibition zone，IZ)(圆盘周围没有细菌的区域)和分离株生长区(growth zone，GZ)(圆盘周围具有明显独特生长形态的区域)，抑制指数为对每种病原体计算，如下：

j是特定的分离株，n是测试其抗菌特性的分离株总数。

式IZj Zj (IZj×GZj)设置为赋予显示具有IZ的分离株更多的功效，因为许多分离株的IZ＝0。

抗生素耐药性测试：

所有细菌菌株在MRS或BHI硬琼脂平板上根据其自第一分离阶段的原始来源平板分别在37C下生长48小时或过夜。然后，将在BHI平板上生长的细菌转移到Mueller-Hinton培养基琼脂平板(Himedia，Mumbai，India)，并将在MRS平板上生长的细菌转移到相同的培养基平板上。使用10种乳制品相关抗生素对MALDI Biotyper鉴定的22种相关分离株进行了标准圆盘琼脂扩散Kirby-Bauer抗生素测试³⁰(standard disk agar diffusion Kirby–Bauer antibiotic testing)。它们的敏感性和微生物抑制浓度(microbial inhibition concentrations，MIC)与已知细菌物种的敏感性相比进行了测量。

生物膜形成试验：

所有细菌菌株在MRS或BHI硬琼脂平板上分别在37C下生长48小时或过夜。使用单个细菌菌落制备每个菌株的发酵剂。将首先在MRS上生长的细菌接种到5mL MRS培养基中过夜，并将首次在BHI培养基上生长的细菌接种到5mL中，在37C下培养5小时。

生物膜的形成是通过结晶紫染色与之前描述的类似(Assaf等人，2015)确定的。简而言之，在48孔聚苯乙烯板(Bar Naor)中接种20μl分离株培养物，如上所述，使用180μl液体BHI或MRS培养基，根据其第一分离阶段的原始来源平板，开始培养24小时或48小时。

然后弃去培养基，用无菌蒸馏水洗涤孔3次，随后风干45分钟。孔用200μl的1％(v/v)结晶紫(Hylabs，Rehovot，Israel)进行染色15分钟，然后用无菌蒸馏水洗涤两次。此时，可以看到生物膜，因为在每个孔的侧面或底部形成了紫色的迹象。

统计分析：

使用P＝0.05的显着性阈值，使用双向和单向方差分析(Two-and one-way ANOVA)和杜凯确实差异(Tukey’s Honest Significant Difference)事后检验来比较平均值。使用JMP-IN软件(Pro 12版，SAS，Cary，NC)进行统计分析。

结果：

本发明人专注于健康乳头腔(teat cistern)和乳头沟(streak canal)微生物群的分离和表征。假设是从未患过严重乳腺炎的健康奶牛的乳房中可能含有更具弹性的微生物群。目标是创建一个有效的管道(图1)，用于分离相关细菌，以防止乳腺炎的发生，并可进一步用于未来的食品和生物技术应用。

第一阶段是识别表现出“健康乳房”的奶牛。通过使用具有NOA程序计算机化畜群手册(computerized herd book)，选择了在至少两个挤奶周期中没有乳腺炎事件(平均SCC<100)的九头牛(cow)(图2A)。为了获得具有乳头沟特征的微生物群，从通常因担心污染而丢弃的前奶¹¹中取样。

细菌分离和文库构建：

前奶样品用于在典型的琼脂分离培养基上制作细菌分离库的初始分离过程^8,11,17。根据其形态特征和与同一季度的免疫学和细菌学结果的比较，总共选择了345株分离株。选择特定分离株的标准是：(1)来自散装牛奶中没有乳腺炎指标的四分之一；(2)来自散装牛奶中没有严重细菌污染的四分之一，(3)最好来自显示大量菌落的琼脂平板(agar plate)，但散装牛奶样本中的四分之一是干净的。

MALDI Biotyper TOF分离鉴定：

使用MALDI Biotyper TOF分析了所有345个分离株。从图2B中可以看出，MALDI Biotyper鉴定了253个分离株(来自Rishon乳制品)中的67％，在这67％中，53％被识别为芽孢杆菌纲(Bacilli)，36％被识别为放线菌(Actinobacteria)，11％被识别为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)。在芽孢杆菌纲分类中，75％来自嗜酸乳杆菌目(Lactobacillales)，25％来自芽孢杆菌目(Bacillales)。在放线菌纲中，81％来自棒状杆菌亚目(Corynebacterineae suborder)，19％来自微球菌目(Micrococcales)。在γ-变形菌纲分类中，65％来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，18％来自假单胞菌目(Pseudomonadales)，18％来自弧菌目(Vibrionales order)。在检测到的物种中，无枝菌酸棒状杆菌占总细菌的14％，乳酸乳球菌为7％，溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)为总细菌的6％。被选择用于进一步表征的分离株如下：(1)不知道会引起牛乳腺炎；(2)不知道是人类病原体；(3)可能具有益生菌特征。这个消除过程导致选择了57个，其中一些来自相同的分类群鉴定。分离株包括三种芽孢杆菌属：枯草杆菌、索诺拉沙漠芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、内生芽孢杆菌和液化淀粉芽孢杆菌，以及三种棒状杆菌属：微细棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌和干燥棒状杆菌。分离出的其他分类群包括乳酸乳球菌、假肠膜明串珠菌、乳酸片球菌、藤黄微球菌、植物乳杆菌、水原拉梅尔芽孢杆菌和罗伊氏乳杆菌，其中一些被认为是益生菌分类群。

分离株针对病原体套组(pathogen panel)的抗菌相关特性的表征：

从MALDI Biotyper鉴定中选出的57个分离株在资源丰富的环境中测试了它们与病原体竞争的能力，此环境可以模拟牛乳房的状况。分离株和病原体在没有氧气限制的富培养基上生长，温度为37℃，与牛的体温相似。为了区分不同的分离菌，制定了抗菌指数(见方法部分)。此指数赋予显示出具有生产抗菌材料能力的分离株更多的能力。在第一阶段，分离株针对一般动物和食源性细菌病原体进行了测试，例如蜡样芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌，它们代表了广谱(broad spectrum)和难以治疗的病原体^19,20(图3A)。抗菌指数表明，芽孢杆菌属的分类群对这些一般病原体最有效，因为枯草杆菌的指数值最高。分离库中的几种新枯草杆菌菌株显示出比其平行实验室菌株更高的抗菌活性，同时也显示出高指数值。最低指数值是藤黄微球菌、干燥棒状杆菌和无枝菌酸棒状杆菌分类群。

为了进一步了解分离株作为未来抗牛乳腺炎可持续药物的潜力，对这些分离株进行了针对引起细菌病原体的特定乳腺炎的测试(图3B及图3C)。图3B描述了从患有严重乳腺炎的个体奶牛中分离出的四种凝固酶阴性葡萄球菌的分离株的抗菌指数。同样，芽孢杆菌属显示出最高的抗菌活性，活性最高的菌株是液化淀粉芽孢杆菌和枯草杆菌。图3C显示了针对来自患有严重乳腺炎的个体奶牛的三种分离病原体的抗菌活性测试的分离株：1989、8944/2和大肠杆菌。同样，芽孢杆菌属是最有效的细菌。有趣的是，无枝菌酸棒状杆菌、水原拉梅尔芽孢杆菌和植物乳杆菌也对大肠杆菌具有相对较高的抗菌指数值。

分离抗生素耐药性和生物膜形成测试：

选定的分离株通过标准扩散方法(standard diffusion method)针对乳品业使用的一套组10种相关抗生素进行测试，以对它们的相对敏感性进行分类(表1)。从抗生素抗性测试中，来自乳酸乳球菌、水原拉梅尔芽孢杆菌和液化淀粉芽孢杆菌菌株的分离株对套组中的所有10种抗生素均表现出完全敏感性。除了一种抗生素(分别为曲美普林-美坐磺胺(Trimethoprim-sulfamethoxazole)和林可霉素(Lincomycin))外，无枝菌酸棒状杆菌和罗伊氏乳杆菌对所有抗生素都敏感。敏感类群在未来的生物技术用途中具有优势，因为它们具有潜在毒性的危险性较小。最具抗性的菌株是藤黄微球菌分离株，它对超过四种类型的抗生素具有抗性(表1)。芽孢杆菌属是主要的生物膜生产者。令人惊讶的是，无枝菌酸棒状杆菌是24小时后唯一的薄膜形成生物膜。菌株罗伊氏乳杆菌和乳酸乳球菌是唯一能形成水下生物膜的菌株。

16S rRNA测序：

如本文所述鉴定的相关细菌的16S rRNA序列总结于表2及表3中。

表2

表3

将植物乳杆菌接种在LB-MRS分板(divided plates)的MRS侧，并在有氧条件下在37℃下培养3天。然后在板的LB侧加入各种病原体：蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)及金黄色葡萄球菌。如图4A至图4B所示，植物乳杆菌对这些细菌病原体具有致死作用。表4总结了植物乳杆菌分泌的挥发性化合物。

表4

尽管已经结合其特定实施例描述了本发明，但很明显，对于本领域技术人员而言，许多替代、修改及变化会是显而易见的。因此，其旨在包括落入所附权利要求的精神及广泛范围内的所有此类替代、修改及变化。

参考文献：

1、Gomes,F.&Henriques,M.，牛乳腺炎的控制：旧的和最近的治疗方法(Control of bovine mastitis:old and recent therapeutic approaches)；当前微生物学(Current microbiology)；72,377-382(2016)；

2、Huijps,K.,Lam,T.J.&Hogeveen,H.，乳腺炎的成本：事实和看法(Costs of mastitis:facts and perception)；乳制品研究杂志(Journal of Dairy Research)；75,113-120(2008)；

3、Hogeveen,H.,Huijps,K.&Lam,T.，乳腺炎的经济方面：新发展(Economic aspects of mastitis:new developments)；新西兰兽医杂志(New Zealand Veterinary Journal)59,16-23(2011)；

4、Barlow,J.，乳腺炎治疗和抗菌药物敏感性：多物种综述，重点是奶牛乳腺炎的抗生素治疗(Mastitis therapy and antimicrobial susceptibility:a multispecies review with a focus on antibiotic treatment of mastitis in dairy cattle)；乳腺生物学和瘤形成杂志(Journal of mammary gland biology and neoplasia)；16,383-407(2011)；

5、Vanderhaeghen,W.等人，与反刍动物相关的凝固酶阴性葡萄球菌的鉴定、分型、生态学和流行病学(Identification,typing,ecology and epidemiology of coagulase negative staphylococci associated with ruminants)；兽医杂志(The Veterinary Journal)；203,44-51(2015)；

6、Jamali,H.,Paydar,M.,Radmehr,B.,Ismail,S.&Dadrasnia,A.，从原料奶和乳制品中分离出的金黄色葡萄球菌的患病率和抗菌素耐药性(Prevalence and antimicrobial resistance of Staphylococcus aureus isolated from raw milk and dairy products)，食品控制(Food Control)；54,383-388(2015)。

7、Oliver,S.P.,Boor,K.J.,Murphy,S.C.&Murinda,S.E，与食用生奶有关的食品安全危害(Food safety hazards associated with consumption of raw milk)；食源性病原体和疾病(Foodborne pathogens and disease)；6,793-806(2009)、

8、Verdier-Metz,I.等人，奶牛乳头皮，奶酪生产中多种微生物种群的潜在来源(Cow teat skin,a potential source of diverse microbial populations for cheese production)，应用和环境微生物学(Applied and environmental microbiology)；78,326-333(2012)；

9、Al-Qumber,M.&Tagg,J.，从健康奶牛乳房微生物群中分离出的抑制乳腺炎病原体的共生杆菌(Commensal bacilli inhibitory to mastitis pathogens isolated from the udder microbiota of healthy cows)；应用微生物学杂志(Journal of applied microbiology)；101,1152-1160(2006)；

10、Braem,G.等人，牛乳头顶端皮肤凝固酶阴性葡萄球菌的抗菌活性及其对乳腺炎相关病原体的抑制作用(Antibacterial activities of coagulase-negative staphylococci from bovine teat apex skin and their inhibitory effect on mastitis-related pathogens)；应用微生物学杂志(Journal of applied microbiology)；116,1084-1093(2014)；

11、Espeche,M.C.,Otero,M.C.,Sesma,F.&Nader-Macias,M.E.F.，从健康和肥大奶牛的乳腺中分离出的乳酸菌筛选表面特性和拮抗物质的产生(Screening of surface properties and antagonistic substances production by lactic acid bacteria isolated from the mammary gland of healthy and mastitic cows)；兽医微生物学(Veterinary microbiology)；135,346-357(2009)；

12、Cui,X.等人，从中国东北传统手工乳酪中分离的乳酸菌对肠道致病菌的抗菌和抗生物膜活性(Antibacterial and Antibiofilm Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Traditional Artisanal Milk Cheese from Northeast China Against Enteropathogenic Bacteria)；益生菌和抗菌蛋白(Probiotics and antimicrobial proteins)；1-10(2017)；

13、Franciosi,E.,Settanni,L.,Cavazza,A.&Poznanski,E.，生牛奶中野生乳酸菌的生物多样性和技术潜力(Biodiversity and technological potential of wild lactic acid bacteria from raw cows'milk)；国际乳制品杂志(International Dairy Journal)；19,3-11(2009)；

14、Innocente,N.等人，从牛乳中分离的土着鼠李糖乳杆菌对传统酸奶微生物特征和芳香特征的影响(Effect of indigenous Lactobacillus rhamnosus isolated from bovine milk on microbiological characteristics and aromatic profile of traditional yogurt)；LWT-食品科学与技术(LWT-Food Science and Technology)；66,158-164(2016)；

15、Pellegrino,M.,Berardo,N.,Giraudo,J.,Nader-Macías,M.&Bogni,C.，预防牛乳腺炎：奶牛在干奶期接种乳酸菌的体液和细胞反应(Bovine mastitis prevention:humoral and cellular response of dairy cows inoculated with lactic acid bacteria at the dry-off period)；有益微生物(Beneficial microbes)；8,589-596(2017)；

16、Cho,I.&Blaser,M.J.，人体微生物组：处于健康与疾病的交界处(The human microbiome:at the interface of health and disease)；自然评论遗传学(Nature Reviews Genetics)；13,260(2012)；

17、Normanno,G.等人，从肉类和乳制品中分离的产肠毒素金黄色葡萄球菌的发生、表征和抗菌素耐药性。国际食品微生物学杂志115,290-296(2007)；

18、Ranadheera,R.,Baines,S.&Adams,M.，食物对益生菌功效的重要性。国际食品研究43,1-7(2010)；

19、Alekshun,M.N.&Levy,S.B.，抗菌多药耐药的分子机制(Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance)；细胞(Cell)；128,1037-1050(2007)；

20、Stenfors Arnesen,L.P.,Fagerlund,A.&Granum,P.E.，从土壤到肠道：蜡样芽孢杆菌及其食物中毒毒素(From soil to gut:Bacillus cereus and its food poisoning toxins)；FEMS微生物学评论(FEMS microbiology reviews)；32,579-606(2008)；

21、Balcázar,J.L.和Rojas-Luna,T.，益生菌枯草芽孢杆菌UTM 126对弧菌物种的抑制活性赋予对幼虾(南美白对虾)弧菌病的保护作用(Inhibitory activity of probiotic Bacillus subtilis UTM 126against Vibrio species confers protection against vibriosis in juvenile shrimp(Litopenaeus vannamei))；当前微生物学(Current microbiology)；55,409-412(2007)；

22、Mora,I.,Cabrefiga,J.&Montesinos,E.，来自植物环境的芽孢杆菌菌株中的抗菌肽基因(Antimicrobial peptide genes in Bacillus strains from plant environments)；国际微生物学(Int Microbiol)；14,213-223(2011)；

23、Capita,R.和Alonso-Calleja,C.，抗生素抗性细菌：食品行业的挑战(Antibiotic-resistant bacteria:a challenge for the food industry)；食品科学与营养的批判性评论(Critical reviews in food science and nutrition)；53,11-48(2013)；

24、Botrel,M.-A.等人，法国罗纳-阿尔卑斯奶牛临床和亚临床乳腺炎病原体的分布和抗菌素耐药性(Distribution and antimicrobial resistance of clinical and subclinical mastitis pathogens in dairy cows in -Alpes,France)；食源性病原体和疾病(Foodborne pathogens and disease)；7,479-487(2010)；

25、Mathew,A.G.,Cissell,R.&Liamthong,S.，食用动物相关细菌的抗生素耐药性：美国对畜牧生产的看法(Antibiotic resistance in bacteria associated with food animals:a United States perspective of livestock production)；食源性病原体和疾病(Foodborne pathogens and disease)；4,115-133(2007)；

26、Shi,X.&Zhu,X.，食品工业中的生物膜形成和食品安全(Biofilm formation and food safety in food industries)；食品科学与技术趋势(Trends in Food Science&Technology)；20,407-413(2009)；

27、Shemesh,M.,Kolter,R.&Losick,R.，杀菌剂二氧化氯通过激活组氨酸激酶KinC刺激枯草芽孢杆菌中的生物膜形成(The biocide chlorine dioxide stimulates biofilm formation in Bacillus subtilis by activation of the histidine kinase KinC)；细菌学杂志(Journal of bacteriology)；192；

28、Pasvolsky,R.、Zakin,V.、Ostrova,I.和Shemesh,M.，牛奶脂解过程中释放的丁酸会触发芽孢杆菌属物种的生物膜形成(Butyric acid released during milk lipolysis triggers biofilm formation of Bacillus species)；国际食品微生物学杂志(International journal of food microbiology)；181,19-27(2014)；

29、Ondov,B.D.,Bergman,N.H.&Phillippy,A.M.Web，浏览器中的交互式宏基因组可视化(Interactive metagenomic visualization in a Web browser)；BMC生物信息学(BMC bioinformatics)12,385(2011)；以及

30、Bauer,A.,Kirby,W.,Sherris,J.C.&Turck,M.，通过标准化单盘法进行的抗生素敏感性测试(Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method)；美国临床病理学杂志(American journal of clinical pathology)；45,493(1966)。

本说明书中提及的所有出版物、专利及专利申请均在本文中通过引用整体并入本说明书中，达到如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体及单独地指出通过引用并入本文的相同程度。另外，本申请中任何参考文献的引用或识别不应被解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。在使用章节标题的范围内，不应将其解释为必然的限制。

序列表

<110> 以色列国家农业部、农村发展农业研究组织·沃尔卡尼中心

以色列国家农业和农村发展部·基姆伦兽医机构

摩西·谢米什

什洛莫·布鲁姆

<120> 治疗牛乳腺炎的方法

<130> 82071

<150> US 62/823,010

<151> 2019-03-25

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1258

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(4)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (128)..(128)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1010)..(1010)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1039)..(1039)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1043)..(1043)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1082)..(1082)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1087)..(1087)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1089)..(1089)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1104)..(1104)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1109)..(1109)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1112)..(1113)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1115)..(1115)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1119)..(1119)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1125)..(1125)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1136)..(1143)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1148)..(1149)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1151)..(1151)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1155)..(1159)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1161)..(1168)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1170)..(1172)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1176)..(1176)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1183)..(1184)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1198)..(1199)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1205)..(1207)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1211)..(1219)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1221)..(1221)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1223)..(1226)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1230)..(1235)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1237)..(1239)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1242)..(1246)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1248)..(1248)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1251)..(1254)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1256)..(1258)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 1

gnnnangctg gnggcgtgcc taatacatgc aagtcgaacg aactctggta ttgattggtg 60

cttgcatcat gatttacatt tgagtgagtg gcgaactggt gagtaacacg tgggaaacct 120

gcccaggngc gggggataac acctggaaac agatgctaat accgcataac aacttggacc 180

gcatggtccg agtttgaaag atggcttcgg ctatcacttt tggatggtcc cgcggcgtat 240

tagctagatg gtggggtaac ggctcaccat ggcaatgata cgtagccgac ctgagagggt 300

aatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggcag cagtagggaa 360

tcttccacaa tggacgaaag tctgatggag caacgccgcg tgagtgaaga agggtttcgg 420

ctcgtaaaac tctgttgtta aagaagaaca tatctgagag taactgttca ggtattgacg 480

gtatttaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 540

caagcgttgt ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag gcggtttttt aagtctgatg 600

tgaaagcctt cggctcaacc gaagaagtgc atcggaaact gggaaacttg agtgcagaag 660

aggacagtgg aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg 720

gcgaaggcgg ctgtctggtc tgtaactgac gctgaggctc gaaagtatgg gtagcaaaca 780

ggattagata ccctggtagt ccataccgta aacgatgaat gctaagtgtt ggagggtttc 840

cgcccttcag tgctgcagct aacgcattaa gcattccgcc tggggagtac ggccgcaagg 900

ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960

aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatactatg caaatctaan agattagacg 1020

ttcccttcgg ggacatggnt acnggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080

gntgggntna agtcccgcaa cgancgcanc cnnantatna gttgnccagc attaannnnn 1140

nnntctgnna nactnnnnna nnnnnnnngn nngggntgac gtnnaatcat catgcccnna 1200

tgacnnngct nnnnnnnnna nannnntggn nnnnnannng gnnnnntncc nnnnannn 1258

<210> 2

<211> 1220

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1026)..(1026)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1052)..(1052)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1061)..(1061)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1072)..(1075)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1082)..(1083)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1085)..(1089)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1091)..(1093)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1096)..(1096)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1112)..(1115)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1120)..(1121)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1130)..(1130)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1132)..(1132)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1137)..(1139)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1141)..(1141)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1145)..(1150)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1156)..(1156)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1158)..(1158)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1160)..(1164)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1166)..(1170)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1172)..(1173)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1176)..(1176)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1179)..(1181)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1184)..(1185)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1187)..(1188)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1191)..(1196)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1198)..(1210)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1212)..(1213)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1216)..(1219)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 2

nnnnnnntgt cnnnttaggc ggctggttcc taaaaggtta ccccaccgac tttgggtgtt 60

acaaactctc atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc 120

atgctgatcc gcgattacta gcgattccga cttcatgtag gcgagttgca gcctacaatc 180

cgaactgaga atggctttaa gagattagct tactctcgcg agttcgcaac tcgttgtacc 240

atccattgta gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc 300

caccttcctc cggtttgtca ccggcagtct caccagagtg cccaacttaa tgctggcaac 360

tgataataag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420

gacaaccatg caccacctgt atccatgtcc ccgaagggaa cgtctaatct cttagatttg 480

catagtatgt caagacctgg taaggttctt cgcgtagctt cgaattaaac cacatgctcc 540

accgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcag ccttgcggcc gtactcccca 600

ggcggaatgc ttaatgcgtt agctgcagca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacttagc 660

attcatcgtt tacggtatgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctac ccatactttc 720

gagcctcagc gtcagttaca gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata 780

tctacgcatt tcaccgctac acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc 840

agtttccgat gcacttcttc ggttgagccg aaagctttca catcagactt aaaaaaccgc 900

ctgcgctcgc tttacgccca ataaatcccg gacaacgctt gccacctacg tattaccgcg 960

gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaaata ccgtcaatac ctgaacagtt 1020

actctnagat atgttcttct ttaacaacag anttttacga nccgaaaccc cnnnnacttc 1080

anncnnnnnc nnntcngact tcgtccattt gnnnnatccn nactgctgcn tnccgtnnna 1140

ntttnnnnnn gttctnantn nnnngnnnnn tnnccntcnn nagnngnnac nnnnnnannn 1200

nnnnnnnnnn cnnttnnnnc 1220

<210> 3

<211> 1259

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(8)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (129)..(129)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1040)..(1040)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1044)..(1044)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1075)..(1075)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1085)..(1085)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1129)..(1129)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1135)..(1136)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1141)..(1142)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1144)..(1144)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1149)..(1149)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1152)..(1153)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1157)..(1157)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1159)..(1159)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1161)..(1163)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1167)..(1173)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1187)..(1188)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1204)..(1205)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1210)..(1210)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1212)..(1215)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1217)..(1223)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1226)..(1228)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1230)..(1235)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1237)..(1241)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1243)..(1246)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1248)..(1253)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1256)..(1256)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1258)..(1258)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gnnnnannct gnnggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac gaactctggt attgattggt 60

gcttgcatca tgatttacat ttgagtgagt ggcgaactgg tgagtaacac gtgggaaacc 120

tgcccaggng cgggggataa cacctggaaa cagatgctaa taccgcataa caacttggac 180

cgcatggtcc gagtttgaaa gatggcttcg gctatcactt ttggatggtc ccgcggcgta 240

ttagctagat ggtggggtaa cggctcacca tggcaatgat acgtagccga cctgagaggg 300

taatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360

atcttccaca atggacgaaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aagggtttcg 420

gctcgtaaaa ctctgttgtt aaagaagaac atatctgaga gtaactgttc aggtattgac 480

ggtatttaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540

gcaagcgttg tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600

gtgaaagcct tcggctcaac cgaagaagtg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660

gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720

ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac 780

aggattagat accctggtag tccataccgt aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt 840

ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cggccgcaag 900

gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960

gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt gacatactat gcaaatctaa gagattagac 1020

gttcccttcg gggacatggn tacnggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcntgaga 1080

tgttngggtt aagtcccgca cgagcgcacc ccttattatc agttgcccng cattnnttgg 1140

nncntctgng annctgncng nnncaannnn nnntggggga tgacgtnnaa tcatcatgcc 1200

cctnngaacn gnnnnannnn nnnctnnnan nnnnngnnnn nannnnannn nnngcnana 1259

<210> 4

<211> 1218

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(8)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1026)..(1026)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1030)..(1030)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1046)..(1046)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1048)..(1048)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1052)..(1052)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1068)..(1068)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1083)..(1083)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1086)..(1088)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1090)..(1090)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1094)..(1094)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1097)..(1098)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1100)..(1100)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1113)..(1118)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1120)..(1121)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1124)..(1125)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1133)..(1134)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1142)..(1142)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1145)..(1150)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1157)..(1157)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1161)..(1168)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1170)..(1172)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1176)..(1179)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1181)..(1181)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1189)..(1192)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1194)..(1206)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1208)..(1208)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1212)..(1214)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (1216)..(1218)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

nnnnnanntg nnnnttaggc ggctggttcc taaaaggtta ccccaccgac tttgggtgtt 60