具有抗衰老效果的多肽及其用途

1.本技术要求2019年7月22日提交的美国临时专利申请号62/877,164的权益，所述申请通过引用整体并入本文。


背景技术：

2.细胞衰老的积累不仅是生物体衰老的产物，它还可以在正反馈循环中积极地促成进一步的衰老诱导。在衰老的标志中，细胞衰老可能占据中心位置，整合了衰老的初级、拮抗和综合方面。首先，衰老可能损害受影响组织的组织修复和更新能力，因为它降低了祖细胞的增殖能力。第二，衰老细胞可以改变其特征在于衰老相关的分泌表型(sasp)的旁分泌信号环境，这可以诱导炎症和进一步的细胞衰老，可能加剧潜在的有害炎症反应，并可能促进组织损伤。第三，衰老细胞随年龄的积累已经在几种组织(包括但不限于皮肤)中得到证明。第四，细胞衰老可能是疾病(诸如黄斑变性、痴呆、动脉粥样硬化和癌症)的积极参与者。
3.衰老细胞可以通过以下来鉴定：衰老相关的β-半乳糖苷酶(sa-bgal)产生、p16表达以及细胞核中的α地中海贫血/精神发育迟滞x-连锁染色质重塑蛋白(atrx)聚集点积累。功能改变也区分衰老细胞，包括增殖能力和对促有丝分裂刺激的抗性降低。


技术实现要素：

4.本文描述了包含分离的、合成的和/或重组的多肽的组合物，所述多肽包含lkgi(seq id no:5)的氨基酸序列或其类似物、lkgil(seq id no:6)的氨基酸序列或其类似物，或wlkgi(seq id no:7)的氨基酸序列或其类似物。在一些实施方案中，这种多肽可以包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35或40个氨基酸。可替代地或另外地，这种多肽包含最多100、90、80、70、60、50、40、35、30、25或20个氨基酸。在一些情况下，所述多肽与seq id no:1-4中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
5.本文还描述了分离的、合成的和/或重组的多肽，其包含seq id no:8(其由x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
表示)的氨基酸序列或其类似物1.其中x1是e，x2是t，x4是k，x6是w，x7是l，x9是g并且x
10
是i；并且(i)x3不是s；或2.(ii)如果x5是任何氨基酸，则x8不是g；或3.(iii)如果x8是任何氨基酸，则x5不是n；4.或(iv)(i)、(ii)或(iii)中的任一种，任选地具有1、2、3或4个保守氨基酸取代；或5.(b)所述氨基酸序列与第二序列seq id no:2具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性，其中x1是a，x2是t，x3是a，x4是k，x5是a，x6是w，x7是l，x8是k，x9是g并且x
10
是i，任选地具有1、2、3或4个保守氨基酸取代；或(c)所述氨基酸序列与第三序列seq id no:3具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性，其中x1是k，x2是l，x5是i，x6是l，x8是g并且x
10
是a；并且(i)如果x9是任何氨基酸，则x3不是n；或(ii)如果x3是任何氨基酸，则x9不是s；
或(iii)如果x4是任何氨基酸，则x7不是l；或(iv)如果x7是任何氨基酸，则x4不是s，和；或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任一种，任选地具有1、2、3或4个保守氨基酸取代；或(d)所述氨基酸序列与第四序列seq id no:4具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性，其中x1是w，x2是l，x3是k，x4是g，x5是i，x6是l，x7是r，x8是e，x9是a并且x
10
是a，任选地具有1、2、3或4个保守氨基酸取代。
6.在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含lkgi(seq id no:5)。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含wlkgi(seq id no:7)。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含lkgil(seq id no:6)。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:1的序列具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列是seq id no:1。在一些实施方案中，所述氨基酸序列是seq id no:2。在一些实施方案中，所述氨基酸序列与seq id no:3的序列具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性。在一些实施方案中，所述氨基酸序列是seq id no:3。在一些实施方案中，所述氨基酸序列是seq id no:4。在一些实施方案中，重组的多肽包含至少10个氨基酸、15个氨基酸或20个氨基酸。
7.本文提供的组合物可以配制成用作治疗剂、营养剂或化妆品。
8.在一些实施方案中，所述制剂进一步包含治疗、营养或化妆品用的赋形剂。在一些实施方案中，所述赋形剂被配置用于局部应用。在一些实施方案中，所述赋形剂被配置为局部补充剂。在进一步的实施方案中，所述制剂被配置用于人类皮肤。在一些实施方案中，所述制剂是乳膏、透皮贴剂、局部贴剂、软膏、油、凝胶、液体、粉末、爽肤水、精华素、乳液、保湿剂、化妆水、泡沫、面膜、摩丝、气雾剂、喷雾剂、清洁剂、水凝胶贴剂、粉末或洗发剂。在一些实施方案中，所述制剂可以与声波治疗、超声波治疗、led治疗、光治疗、电治疗或射频治疗结合使用。在一些实施方案中，所述透皮贴剂将所述制剂递送至皮肤的表皮层。在一些实施方案中，所述透皮贴剂将所述制剂递送至皮肤的表皮层和真皮层。在一些实施方案中，所述制剂在对象中以最小或低的量全身性地递送，或者不旨在直接递送到对象的血流中。在一些实施方案中，所述制剂在递送部位及其附近局部地发挥作用。在一些实施方案中，所述制剂具有最小至没有全身性作用。
9.在一些实施方案中，所述制剂被配置为可食用补充剂。在一些情况下，所述制剂被配置为饮料。
10.本文描述了包含至少一种本文的重组或合成的多肽和治疗、营养或化妆品用的赋形剂的治疗、营养或化妆品制剂。
11.在一些实施方案中，所述赋形剂被配置用于局部应用。在一些实施方案中，所述赋形剂被配置为局部补充剂。在进一步的实施方案中，所述制剂被配制用于应用于人类皮肤。更具体地，所述制剂可以被配置成从表皮局部地渗透到真皮。在一些实施方案中，所述制剂可以被配置成局部地渗透通过表皮和真皮层。在一些实施方案中，所述制剂可以被配置成局部地渗透通过表皮层，并且对真皮层具有低渗透性。通常，可以使用各种渗透研究(包括但不限于使用franz扩散池的那些研究)来评估制剂中组分的渗透。在一些实施方案中，所述制剂包含载体、微球、脂质体或胶束，以便携带所述多肽，并控制所述多肽通过皮肤的释放时间和/或渗透深度。在一些情况下，本文的制剂是乳膏、软膏、凝胶、液体、油、粉末、爽肤水、精华素、乳液、保湿剂、泡沫、面膜、摩丝、气雾剂、喷雾剂、清洁剂、化妆水、局部贴剂、水凝胶贴剂或洗发剂。
12.在一些实施方案中，所述制剂被配置为可食用补充剂。在一些实施方案中，所述制剂被配置为饮料。在一些实施方案中，所述制剂被配置为片剂、胶囊、凝胶、橡皮糖或粉末。
13.本文描述了在有需要的对象中治疗病况的方法，所述方法包括向对象施用一种治疗、营养或化妆品制剂，其包含seq id no:5-7中至少一个的氨基酸序列。
14.在一些实施方案中，所述施用包括向对象局部地应用所述制剂。在进一步的实施方案中，所述对象是人或其他动物。在一些实施方案中，所述方法包括向对象施用有效量的制剂。
15.在一些实施方案中，所述病况是对象中与衰老细胞积累相关的病症。在一些实施方案中，与衰老细胞积累相关的病症包括老化皮肤。在一些实施方案中，所述病况是与早衰症相关的病症和/或早衰作用。在一些实施方案中，早衰症包括在皮肤的表皮层和真皮层中具有过早老化症状的病况。
16.本文描述了在有需要的对象中减少细胞衰老的方法，所述方法包括向对象施用一种包含多肽的治疗、营养或化妆品制剂，所述多肽包含任选地具有1个保守氨基酸取代的lkgi(seq id no:5)的氨基酸序列。
17.在一些实施方案中，所述多肽包含至少4个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸或20个氨基酸。在一些实施方案中，所述制剂包含任选地具有1个保守氨基酸取代的wlkgi(seq id no:7)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述制剂包含任选地具有1个保守氨基酸取代的lkgil(seq id no:6)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含至少5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸或20个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽包含不超过10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸或40个氨基酸。
18.在一些实施方案中，所述制剂进一步包含治疗、营养或化妆品用的赋形剂。
19.本文描述了在有需要的对象中减少细胞衰老的方法，所述方法包括向对象施用一种治疗、营养或化妆品制剂，所述制剂包含至少一种本文描述的多肽。
20.在一些实施方案中，所述制剂进一步包含治疗、营养或化妆品用的赋形剂。在一些实施方案中，所述施用包括将所述制剂应用至对象的一部分皮肤。在一些实施方案中，所述制剂延长对象的多个细胞的寿命、诱导对象的多个细胞中的sirt6表达、提高对象的多个细胞中的细胞更新速率、促进对象的多个细胞中的细胞凋亡、促进对象的多个细胞中的dna修复、提高对象的多个细胞中的胶原蛋白产生、提高对象的多个细胞中的透明质酸合酶产生、减少对象的多个细胞中的atrx核聚集点积累、减少对象的多个细胞中的p16表达、减少对象的多个细胞中的衰老相关的β-半乳糖苷酶产生、减少对象的多个细胞中的il8表达、减少对象的多个细胞中的mmp1表达、提高对象的多个细胞中的blm表达，和/或防止对象的多个细胞中的uv诱导的dna损伤。
21.本文描述了在有需要的对象中治疗病况的方法，所述方法包括向对象施用一种治疗、营养或化妆品制剂，其包含任选地具有1个保守氨基酸取代的seq id no:5的氨基酸序列。
22.在一些实施方案中，所述治疗、营养或化妆品制剂包含任选地具有1个保守氨基酸取代的seq id no:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述治疗、营养或化妆品制剂包含任选地具有1个保守氨基酸取代的seq id no:7的氨基酸序列。通过引用并入
23.本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同指示每个单独出版物、专利或专利申请明确且单独地通过引用并入一般。
附图说明
24.本发明的新的特征具体地在所附权利要求中阐述。将通过参考阐述了利用本发明原理的说明性实施方案的以下具体实施方式和附图获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述附图中：
25.图1示出了单个多肽对早衰症成纤维细胞数量和衰老水平的影响。
26.图2示出了四种多肽，肽14(图a)、肽13(图b)、肽15(图c)和肽16(图d)对衰老成纤维细胞的衰老治疗效果。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
27.图3示出了多肽的衰老治疗效果，其促进具有较少atrx聚集点/细胞核的较高数量的细胞(图a)、较低平均atrx聚集点/细胞核(图b)和具有少于10个atrx聚集点/细胞核的较高数量的细胞(图c)。*p《0.05；**p《0.01。
28.图4示出了一种衰老治疗多肽的效果，所述多肽可以在3周长暴露期间减少细胞群体中衰老成纤维细胞的数量，在治疗后保持衰老治疗效果至少一周(图a)，且在此期间不诱导细胞毒性或显著影响细胞增殖(图b)。***p《0.001；****p《0.0001。
29.图5示出了用多肽治疗可以促进细胞衰老中的剂量反应降低，如通过来源于多个供体的细胞中每个细胞的平均atrx聚集点积累所测量。
30.图6示出了暴露于依托泊苷可以在成纤维细胞中诱导细胞衰老(图a)，用多肽治疗依托泊苷诱导的衰老细胞可以导致衰老减少(图b))，uvb暴露可以诱导细胞衰老(图c)，并且用多肽治疗uvb处理的样品可以导致衰老减少(图d)。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
31.图7示出了根据总体结构分析得分，用多肽治疗的人类皮肤等效物可以显示较高的质量(图a)，用多肽治疗的人类皮肤等效物可以包含比未处理的人类皮肤等效物显著更少的衰老细胞(图a和b)以及改变的基因表达，其中与未处理的对照相比，p16在多肽治疗的表皮和真皮中可以具有显著更低的表达；并且与未处理的对应物相比，在多肽治疗的真皮中il-8和mmp-1的表达显著更少(图c)。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
32.图8示出了在用多肽治疗的表皮和真皮两种样品中pakt s473均可以显著减少(图a)，多肽治疗可以减少暴露于uvb的样品中的sa-bgal染色，表明保护免受uvb诱导的细胞衰老(图b)，并且多肽可以提高sirt6和blm的表达(图c)。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
33.图9以组织学图像(图a)和所获取数据的统计分析(图b)示出了人类皮肤等效物中的表皮层厚度的增加。**p《0.01。
34.图10示出了两种多肽，肽14(图a)和肽13(图b)的预测三维结构，以及这两种多肽的叠加(图c)。
35.图11a示出了不用肽14(对照)和用12.5μm肽14(12.5μm pep14)培养5天的3d皮肤等效物(顶行)和离体皮肤活检样品(底行)的苏木精和曙红(h&e)染色的组织学图像。
36.图11b示出了用12.5μm肽14(处理)处理的3d皮肤模型(顶图)和离体皮肤活检(底图)样品的预测年龄，也称为分子dna年龄，低于作为未处理对照(ctrl)的样品的预测年龄。**p《0.01。
37.图11c示出了用12.5μm肽14(12.5μm pep 14)处理的离体皮肤活检的预测年龄低
于作为未处理对照(ctrl)的样品的预测年龄。
38.图12a示出了在用ibmx进行14天预处理培养后，用阳性对照异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)、阴性对照、肽14与ibmx和视黄酸与ibmx处理7天的mewo细胞的细胞沉淀的相对黑色素含量。数据表示为归一化至阴性对照(100％)的黑色素含量的平均值和标准偏差。**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
39.图12b示出了在用异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)进行14天预处理培养后，用阳性对照ibmx、阴性对照、肽14和视黄酸处理7天的mewo细胞的细胞培养基上清液的相对黑色素含量。数据表示为归一化至阴性对照(100％)的黑色素含量的平均值和标准偏差。*p《0.05；**p《0.01。
40.图13a示出了在用异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)进行14天预处理培养后，用阳性对照ibmx、阴性对照、肽14与ibxm持续14天、使视黄酸与ibmx持续14天、肽14与ibxm持续7天、视黄酸与ibmx持续7天处理的mewo细胞的细胞沉淀的相对黑色素含量。数据表示为归一化至阴性对照(100％)的黑色素含量的平均值和标准偏差。*p《0.05；**p《0.01；****p《0.0001。
41.图13b示出了在用异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)进行14天预处理培养后，用阳性对照ibmx、阴性对照、肽14与ibxm持续14天、视黄酸与ibmx持续14天、肽14与ibxm持续7天、视黄酸与ibmx持续7天处理的mewo细胞的细胞培养基上清液的相对黑色素含量。数据表示为归一化至阴性对照(100％)的黑色素含量的平均值和标准偏差。*p《0.05；**p《0.01；****p《0.0001。
42.图14a示出了用阳性对照ibmx、阴性对照、肽14与ibxm持续14天、视黄酸与ibmx持续14天、肽14与ibxm持续7天、视黄酸与ibmx持续7天处理的mewo细胞的酪氨酸酶的相对mrna表达水平。数据表示为归一化至gapdh和阴性对照表达(100％)的2-ddct的平均值和标准偏差。*p《0.05；**p《0.01；****p《0.0001。
43.图14b示出了用阳性对照ibmx、阴性对照、肽14与ibxm持续14天、视黄酸与ibmx持续14天、肽14与ibxm持续7天、视黄酸与ibmx持续7天处理的mewo细胞的黑色素细胞诱导转录因子(mitf)的相对mrna表达水平。数据表示为归一化至gapdh和阴性对照表达(100％)的2-ddct的平均值和标准偏差。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001。
44.图14c示出了用阳性对照ibmx、阴性对照、肽14与ibxm持续14天、视黄酸与ibmx持续14天、肽14与ibxm持续7天、视黄酸与ibmx持续7天处理的mewo细胞的多巴色素互变异构酶(dct)的相对mrna表达水平。数据表示为归一化至gapdh和阴性对照表达(100％)的2-ddct的平均值和标准偏差。**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
45.图15a示出了仅用载体(对照)、肽13或肽14处理的体外人类皮肤模型的h&e染色的组织学图像。
46.图15b示出了仅用载体(对照)、肽14或肽13处理的人类皮肤模型的组织学得分的平均值，分别为21.00、23.83和23.44。**p《0.01。
47.图16示出了在治疗前的基线时(左，基线)和治疗12周后(右，12周)，用肽14处理的左侧面部的实例。
48.图17示出了用对照、肽14、肽13或视黄酸处理的3d皮肤等效物的表皮层和真皮层的p16、blimp1、zyg11b、il-8、ki-67、zic1、mmp1、has2的相对mrna表达水平。数据表示为归一化至gapdh和未处理对照的2-ddct。*p《0.05。
49.图18示出了秀丽隐杆线虫(c.elegans)的延长寿命和健康寿命，作为所获取数据表明用1μm或2μm多肽治疗改善了蠕虫抖动(图a)、泵送(图b)和中位寿命(图c)。*p《0.05；**p《0.01。
50.图19示出了多肽序列lkgil(seq id no:6)(a、b、c)和多肽序列wlkgi(seq id no:7)(d、e、f)减少细胞衰老且不促进细胞死亡的效果。在图a和d中，y轴表示归一化至未处理对照的相对衰老水平。在图b和d中，y轴表示归一化至未处理对照的相对细胞数量。在图c和f中，y轴表示每个细胞的平均atrx聚集点积累。*p《0.05；**p《0.01。
具体实施方式
51.衰老在很大程度上可能是由于维持组织稳态和完整性的能力的功能性下降，可能再加上在压力条件下对生理需求的反应减弱。
52.在皮肤老化的镶嵌模型中，衰老细胞可以由内在和外在刺激(诸如时间/年龄、uv暴露和吸烟等)诱导。根据此模型，衰老细胞在皮肤中积累，并通过由促炎细胞因子等组成的衰老相关分泌表型(sasp)改变局部微环境，从而积极地促进组织老化。在一些情况下，衰老细胞通过损害表皮干细胞更新和促进其他正常细胞的衰老而进一步促进皮肤老化。因此，衰老细胞不仅是皮肤老化的产物，也是老化过程中的积极参与者。
53.皮肤功能病症可能会影响机体老化和与年龄相关疾病和病症的发展。例如，与皮肤屏障受损的对应者相比，皮肤健康和常规的屏障功能可能与较低水平的炎症和年龄相关细胞因子il-1β和il-6相关。在患有几种年龄相关病症(包括心血管疾病(cvd)、阿尔茨海默病和ii型糖尿病)的患者血清中，观察到il-1β和il-6水平升高。在一些情况下，老年人血清il-6可能与全因死亡率、cvd、癌症和肝脏相关死亡率相关。在一些情况下，表皮功能的恢复可以有效地降低循环tnfα、il-1β和il-6细胞因子水平。
54.本文提供了多肽、包含多肽和其他组分的组合物及其使用方法。所述多肽和包含所述多肽的组合物可以提供抗衰老效果(例如，对对象的细胞)。多肽可以通过促进细胞凋亡、促进dna修复和/或抑制dna损伤诱导的衰老来促进细胞和组织中的衰老水平的降低。抗衰老效果可以包括但不限于提高细胞更新速率、提高胶原蛋白产生、提高透明质酸合酶产生、减少atrx细胞核聚集点积累、减少p16表达、减少sasp产生、减少衰老相关的β-半乳糖苷酶产生、减少不均匀色素沉着、维持或改善表皮屏障以及减少经表皮失水(tewl)。本文提供的多肽和包含所述多肽的组合物可以抑制、预防或减缓老化相关和/或衰老相关疾病或病况。此外，所述多肽和包含所述多肽的组合物可以增强或改善健康寿命和/或促进寿命。
55.应当理解，本文所述的方法和组合物不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因此可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，且不旨在限制本文描述的方法和组合物的范围，所述范围将仅由随附权利要求限定。
56.除非上下文明确地指示其他的情况，否则如本文和附属权利要求中使用的，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。
57.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文所述本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在本文描述的本发明的实施和测试中可以使用任何相似于或等效于本文中所述那些的方法、装置和材料，现在描述优选的方法、装置和材料。
58.在肽或多肽中，氨基酸的合适保守取代是本领域技术人员已知的，并且通常可以在不改变所得分子的生物活性的情况下进行。watson等人(1987,molecular biology of the gene,第4版,the benjamin cummings pub.co.,第224页)通过引用并入本文。所述氨基酸可以是l-或d-异构体形式。当氨基酸残基是多肽链的一部分时，氨基酸的d-异构体形式可以取代l-氨基酸残基，只要保留所期望的功能特性。本文中的氨基酸可以用它们的标准iupac 1字母代码或3字母代码来表示。由“x”或“xxx”表示的氨基酸残基是指本领域已知的天然存在或非天然存在的氨基酸残基中的任一种，或者是指附近残基的修饰。氨基酸取代通常是单个残基，此类取代优选地用表1中列出的那些来进行，但也可以是多个残基，成簇的或分散的。氨基酸可以被不同的天然存在的或非常规的氨基酸残基替代。此类取代可以被归类为“保守的”，在这种情况下，多肽中包含的氨基酸残基被另一种在极性、侧链功能或大小方面具有相似特征的天然存在的氨基酸替代。添加包括一个或多个天然存在的或非常规的氨基酸残基的添加。缺失包括一个或多个氨基酸残基的缺失。表1：保守和非保守氨基酸取代
59.本公开内容涵盖的取代也可以是“非保守的”，其中多肽中存在的氨基酸残基被具有不同特性的氨基酸(诸如来自不同组的天然存在的氨基酸)取代(例如，用丙氨酸取代带电或疏水氨基酸)，或者可替代地，其中天然存在的氨基酸被非常规的氨基酸取代。
60.如本文所用的术语“类似物”是指保留与多肽(诸如来自不同生物体的相同蛋白质)相同的结构或功能(例如，结合受体)的组合物。类似物的实例包括模拟物或肽模拟物、肽、小的和大的有机或无机化合物，以及本文多肽的衍生物和变体。此类衍生物和变体是指通过一个或多个氨基酸缺失、添加、取代或侧链修饰而不同于天然存在的多肽的多肽。在一些实施方案中，肽类似物是其中一个或多个氨基酸经历了侧链修饰的肽。本公开内容考虑的侧链修饰的实例包括氨基的修饰，诸如通过与醛反应，随后用nabh4还原的还原性烷基化；用甲基乙酰亚胺酯进行酰胺化；用乙酸酐进行酰化；用氰酸盐对氨基进行氨甲酰化；用2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)对氨基进行三硝基苄基化；用琥珀酐和四氢邻苯二甲酸酐对氨基进行酰化；以及用吡哆醛-5-磷酸酯对赖氨酸进行吡啶氧基化，随后用nabh4还原。在一些实施方案中，肽类似物是以下肽类似物：其中精氨酸残基的胍基通过与试剂诸如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合产物而被修饰；羧基通过经由o-酰基异脲形成的碳二亚胺活化，随后例如衍生成相应的酰胺而被修饰；巯基可以通过诸如用碘乙酸或碘乙酰胺进行羧甲基化的方法进行修饰；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其他硫醇化合物形成混合二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他取代的马来酰亚胺反应；使用4-氯汞苯甲酸酯、4-氯汞苯磺酸、氯化苯汞、2-氯汞-4-硝基苯酚和其他汞形成汞衍生物；在碱性ph下用氰酸
盐进行氨甲酰化。在本文的任何类似物中，半胱氨酸残基的任何修饰优选地不影响肽形成必需的二硫键的能力。在一些实施方案中，肽类似物包含例如通过用n-溴代琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤化物(sulphenyl halides)烷基化吲哚环而被修饰的色氨酸残基；通过用四硝基甲烷硝化以形成3-硝基酪氨酸衍生物而改变的酪氨酸残基；通过用碘乙酸衍生物进行烷基化或用二乙基焦碳酸酯进行n-乙酯基化而完成的组氨酸残基修饰的咪唑环；通过例如4-位置羟基化而修饰的脯氨酸残基；从完全非糖基化分子至经修饰的糖基化分子的糖基化变体；以及由于重组分子在不同宿主细胞中的表达而改变的糖基化模式。
61.术语“分离的”意指从其自然状态改变的；即，如果它在自然界中存在，则它已经被改变或从其原始环境中移除，或两者。例如，以其自然状态天然存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是从其自然状态的共存物质中分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”，如本文所用的术语。
62.如本文所用的术语“蛋白质”、“肽”和“寡肽”或“多肽”是指包含通过肽键连接在一起的两个或更多个氨基酸的任何组合物。应当理解，多肽通常含有除了通常称为20种天然存在的氨基酸的20种氨基酸之外的氨基酸，并且在给定的多肽中，许多氨基酸(包括末端氨基酸)可以通过天然过程(诸如糖基化)和其他翻译后修饰，或者通过本领域熟知的化学修饰技术进行修饰。可能存在于本公开内容的多肽中的已知修饰包括但不限于乙酰化、酰化、adp-核糖基化、酰胺化、类黄酮或血红素部分的共价连接、多核苷酸或多核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖化、糖基化、糖基磷脂酰肌醇(gpi)膜锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒醇化(selenoylation)、硫酸化、转移-rna介导的向多肽添加氨基酸，诸如精氨酸化和泛素化。术语“蛋白质”还包括“人工蛋白质”，其是指线性或非线性多肽，由多肽(例如，seq id no:1-7)和间隔区的交替重复组成。可以使用本领域已知的方法合成编码多肽和间隔区交替重复的dna构建体(参见rotzschke等人,1997,proc.natl.acad.sci.usa 94:14642-14647)。
63.如本文中用于描述多肽、多核苷酸或其他组合物的术语“纯化的”是指从一种或多种通常在自然界中与其相关的化合物中分离出来的这种多肽、多核苷酸或其他组合物。这种其他组合物可以是例如其他多肽或多核苷酸、碳水化合物、脂质等。术语“纯化的”也可以用于指定将本公开内容的单体多肽从寡聚体形式(诸如同源或异源二聚体、三聚体等)中分离出来。基本上纯的多肽通常包含至少约50％、60％、70％、80％或90％重量/重量的多肽样品，或更优选至少约95％、96％、97％、98％、99％或99.5％重量/重量的多肽样品。作为优选的实施方案，相对于异源多肽，本公开内容的多肽是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯的。
64.如本文所用，术语“对象”或“患者”包括动物。在一些实施方案中，所述对象可以是哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类的任何成员：人、非人灵长类动物，诸如黑猩猩和其他猿类和猴物种；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊和猪；家养动物，诸如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。所述哺乳动物可以是人。
65.如本文所用，术语“治疗(treat、treating或treatment)”包括延迟疾病或病况的
发作、减少其发生或改善其至少一种症状，预防另外的症状，抑制疾病或病况，例如阻止疾病或病况的发展、缓解疾病或病况、引起疾病或病况的消退、缓解由疾病或病况引起的病况，或预防性和/或治疗性地停止疾病或病况的症状。
66.如本文所用，术语“治疗上可接受的”是指不会消除化合物的生物活性或特性，并且是相对无毒的材料，即所述材料可以施用至对象且不会引起不良的生物效应或以有害的方式与包含它的组合物的任何组分相互作用，包括但不限于盐、载体或稀释剂。
67.如本文所用，术语“载体”是指有助于将化合物掺入细胞或组织的相对无毒的化合物或试剂。
68.如本文所用，术语“稀释剂”是指在递送前用于稀释感兴趣的化合物的化合物。稀释剂也可以用于稳定化合物，因为它们可以提供更稳定的环境。本领域中溶解在缓冲溶液中的盐(其也可以提供ph控制或维持)在用作稀释剂，包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液。
69.如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指施用的试剂或化合物的足够量，其将在一定程度上缓解所治疗的疾病或病况的一种或多种症状。结果可以是疾病的体征、症状或病因的减轻和/或缓解，或者生物系统的任何其他期望变化。例如，用于治疗用途的“有效量”为提供疾病况状的临床上显著减少所需要的包含如本文披露的化合物的组合物的量。在任何个体情况中的适当“有效”量可以使用诸如如剂量递增研究的技术来确定。
70.衰老细胞可以通过以下来鉴定：衰老相关的β-半乳糖苷酶(sa-bgal)产生、p16表达、sasp的呈现和/或细胞核中的α地中海贫血/精神发育迟滞x-连锁染色质重塑蛋白(atrx)聚集点积累。也可以区分衰老细胞的功能改变包括但不限于增殖能力和对促有丝分裂刺激的抗性减少。
71.衰老通常是由于维持组织稳态和完整性的能力的功能性下降，再加上在压力条件下对生理需求的反应减弱。
72.关于皮肤老化，提出了镶嵌模型，其中衰老细胞是由内在和外在刺激(诸如时间/年龄、uv暴露和吸烟等刺激)诱导的。根据镶嵌模型，衰老细胞在皮肤中积累，并通过由促炎细胞因子等组成的衰老相关分泌表型(sasp)改变局部微环境，从而积极地促进组织老化。已经表明，衰老细胞可以通过损害表皮干细胞更新和促进其他正常细胞的衰老来促进皮肤老化。因此，衰老细胞可能不仅是皮肤老化的产物，还可能是老化过程中的积极参与者。
73.多肽具有诸如多功能行为的特性，这使得它们可用于美容或治疗应用，包括衰老疗法。老化过程中观察到的皮肤功能病症可能影响与年龄相关的疾病和病症的发展。多肽
74.如本文提供的多肽和包含多肽的组合物可以提供衰老治疗效果，例如，所述多肽可以减少衰老，诸如通过中断衰老、预防衰老、抑制衰老、逆转衰老、破坏衰老细胞、杀死衰老细胞、去除衰老细胞，或通过减少衰老细胞积累的负担或效果的任何合适机制。在一些情况下此类多肽可以包含氨基酸序列lkgi(seq id no:5)。包含此类多肽的组合物可以用于提供衰老治疗效果。
75.所述多肽(例如，衰老治疗多肽)可以包含至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或更多个氨基酸。在一些情况下，所述多肽长度可以不超过4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个氨基酸。在一些情况下，所述多肽的长度可以是4至25、4至15或4至10个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽可以包含至少30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸。在某些实施方案中，所述多肽可以包含少于100、90、80、70、60、50、40、30或更少个氨基酸。
76.下表2提供了可以提供衰老治疗效果的多肽的实例。表2：示例多肽氨基酸序列
77.多肽可以是分离的或重组的多肽，其可以包含x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
的氨基酸序列。所述多肽中包含的氨基酸可以包含天然氨基酸，天然氨基酸可以包括丙氨酸(ala，a)、精氨酸(arg，r)、天冬酰胺(asn，n)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(glu，q)、谷氨酸(glu，e)、甘氨酸(gly，g)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、蛋氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)或缬氨酸(val，v)。
78.在一些情况下，包含x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
的氨基酸序列的分离的或重组的多肽可以包含与第一序列etakhwlkgi(seq id no:1)具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列，其中x1是e，x2是t，x4是k，x6是w，x7是l，x9是g，并且x
10
是i；并且其中至少(i)x3不是s；或(ii)如果x5是任何氨基酸，则x8不是g；或(iii)如果x8是任何氨基酸，则x5不是n；或(iv)(i)、(ii)或(iii)中的任一个，其中所述序列可以任选地包含1、2、3或4个保守氨基酸取代。在一些情况下，所述分离的或重组的多肽可以包含与etakhwlkgi(seq id no:1)的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的同一性的氨基酸序列。本公开内容还考虑了类似物，诸如上述的肽模拟物。
79.在一些情况下，包含x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
的氨基酸序列的分离的或重组的多肽可以包含与第二序列atakawlkgi(seq id no:2)具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列，其中x1是a，x2是t，x3是a，x4是k，x5是a，x6是w，x7是l，x8是k，x9是g并且x
10
是i。这样的重组的多肽可以任选地包含1、2、3或4个保守氨基酸取代。在一些情况下，所述分离的或重组的多肽可以包含与atakawlkgi(seq id no:2)的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的同一性的氨基酸序列。本公开内容还考虑了类似物，诸如上述的肽模拟物。
80.在一些情况下，包含x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
的氨基酸序列的分离的或重组的多肽可以包含与第三序列klkgilrgaa(seq id no:3)具有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列，其中至少(i)如果x9是任何氨基酸，则x3不是n；或(ii)如果x3是任
何氨基酸，则x9不是s；或(iii)如果x4是任何氨基酸，则x7不是l；或(iv)如果x7是任何氨基酸，则x4不是s；或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任一个，其中所述序列可以任选地包含1、2、3或4个保守氨基酸取代。在一些情况下，所述分离的或重组的多肽可以包含与klkgilrgaa(seq id no:3)的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的同一性的氨基酸序列。本公开内容还考虑了类似物，诸如上述的肽模拟物。
81.在一些情况下，包含x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
的氨基酸序列的分离的或重组的多肽可以包含与第四序列wlkgilreaa(seq id no:4)具有至少80％、85％、90％或95％的同一性的氨基酸序列，其中x1是w，x2是l，x3是k，x4是g，x5是i，x6是l，x7是r，x8是e，x9是a，并且x
10
是a。这样的重组的多肽可以任选地包含1、2、3或4个保守氨基酸取代。在一些情况下，所述分离的或重组的多肽可以包含与wlkgilreaa(seq id no:4)的序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的同一性的氨基酸序列。本公开内容还考虑了类似物，诸如上述的肽模拟物。
82.在一些情况下，多肽可以包含氨基酸序列lkgi(seq id no:5)、lkgil(seq id no:6)或wlkgi(seq id no:7)(参见下表3)。表3：示例性多肽氨基酸序列seq id no:氨基酸序列5lkgi6lkgil7wlkgi
83.包含seq id no:5-7之一的多肽可以包含至少4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个氨基酸。在一些实施方案中，包含seq id no:5-7之一的多肽可以包含不超过4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸。seq id no:5-7可以位于多肽的n-末端/多肽的c-末端或多肽的n-末端和c-末端之间。在一些情况下，多肽可以包含seq id no:5-7中的多于一个。
84.所述多肽可以是分离的、基本上纯的或纯化的。在一些情况下，分离的多肽可以(i)化学合成或(ii)在宿主细胞中表达并从相关和污染的蛋白质中纯化出来。在一些情况下，所述多肽可以作为表达载体的一部分的表达产物存在于宿主细胞中，并且可以连接到蛋白质部分或连接到化学部分。
85.所公开多肽的类似物，包括肽模拟物，可以提供衰老治疗效果。本文公开的肽和多肽可以包括肽模拟物等价物。
86.在一些情况下，如上所讨论，多肽可以与本文所述的多肽具有序列同一性。多肽的序列同一性可以指两个多肽序列的精确氨基酸-氨基酸对应。在一些情况下，用于确定序列同一性的技术可以包括确定氨基酸序列并将所述氨基酸序列与第二氨基酸序列进行比较。可以通过确定它们的同一性百分比，或者两个比对序列之间精确匹配的数目除以较长序列的长度并乘以100来比较两个或更多个序列。例如，也可以通过使用高级blast计算机程序比较序列信息来确定同一性百分比，所述程序包括例如可从国立卫生研究院获得的版本2.2.9。blast程序基于karlin和altschul,proc.natl.acad.sci.usa,87:2264-2268(1990)的比对方法，并且如altschul等人,j.mol.biol.,215:403-410(1990)；karlin和altschul,proc.natl.acad.sci.usa,90:5873-5877(1993)；以及altschul等人,nucleic acids res.25:3389-3402(1997)中所讨论。所述程序可以用于确定被比较多肽全长的同一性百分
比。例如，在blastp程序中，提供了缺省参数来优化带有短查询序列的搜索。所述程序还允许使用seg过滤器来屏蔽查询序列的片段，如由wootton和federhen,computers and chemistry 17:149-163(1993)的seg程序所确定。组合物
87.本文公开了包含一种或多种本文所述多肽的组合物。在一些实施方案中，所述组合物可以是衰老治疗的。在一些情况下，组合物可以用于治疗与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症，例如，以延迟与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症的发作、减少其发生或对其进行改善。在一些情况下，组合物可以用于治疗组织损伤，以延迟组织损伤(例如日晒后的uv损伤)的发作、减少其发生或对其进行改善。
88.在一些情况下，组合物可以包括例如，有效量的多肽(单独或组合)以及一种或多种载体(例如，治疗上可接受的组合物或治疗上可接受的载体)和其他治疗上有效的化合物。在一些实施方案中，多肽的有效量是指对用所述组合物治疗的对象(包括但不限于细胞、组织或生物体)具有期望的效果。在一些实施方案中，有效量的多肽对被治疗的对象具有最小或低的全身性作用。在一些实施方案中，有效量的多肽在经治疗区域或其附近局部地具有最大效果。在一些实施方案中，所述制剂可以被配置成从表皮局部地渗透到真皮。在一些实施方案中，所述制剂被配置成局部地渗透通过表皮层。在一些实施方案中，多肽的有效量是至少1nm、5nm、10nm、50nm、100nm、500nm、1μm、至少10μm、至少25μm、至少50μm、至少75μm、至少100μm、至少150μm、至少200μm、至少250μm、至少300μm、至少350μm、至少400μm、至少450μm或至少500μm。在一些情况下，多肽的有效量为约1nm至约1000nm、约5nm至约750nm、约25nm至约750nm或约50nm至约500nm。在一些情况下，多肽的有效量为约1μm至约500μm、约25μm至约250μm、约50μm至约200μm或约75μm至约125μm。在一些情况下，多肽的有效量是最终组合物的至少0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、至少0.005％、至少0.01％、至少0.05％、至少0.1％、至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％或至少5％(w/w)。在一些情况下，多肽的有效量在最终组合物的约0.00001％至约5％、0.00001％至约1％、0.00001％至约0.1％、约0.001％至约5％、约0.005％至约4％、约0.005％至约3％、约0.005％至约2％、约0.005％至约1％或约0.005％至约0.5％之间。在一些实施方案中，用于体内应用的多肽的有效量可以是用于体外应用的量的至少2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450或500倍。有效量的多肽导致所述多肽的一些真皮渗透，在一些情况下，约1％渗透、约2％渗透、约4％渗透、约5％渗透或约10％渗透。在一些情况下，应用至皮肤上的组合物中的不超过1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的多肽渗透到真皮中。在一些情况下，应用至皮肤上的组合物中的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的多肽渗透到真皮中。在一些情况下，体内应用中使用的量是体外渗透研究中真皮渗透量的倍数。在一些情况下，体内应用中使用的量的倍数是体外真皮渗透量的至少2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000倍。
89.在一些情况下，本文所述的组合物可以与一种或多种另外的营养、美容、治疗或药物治疗一起施用(例如，共同施用、顺序施用或共同配制)。
90.在一些实施方案中，所述制剂可以与一种或多种治疗结合使用。在一些实施方案
中，所述制剂可以与声波治疗、超声波治疗、led治疗、光治疗、电治疗、射频治疗或其他皮肤治疗一起使用。在一些实施方案中，在治疗之前、之后或期间将所述组合物应用至皮肤。
91.可以配制组合物用于局部应用。例如，所述组合物可以被配制用于应用至皮肤上。在一些实施方案中，所述组合物被配置为局部补充剂。诸如用于局部应用的那些制剂可以是乳膏、软膏、凝胶、液体、粉末、爽肤水、精华素、乳液、保湿剂、泡沫、面膜、摩丝、气雾剂、喷雾剂、清洁剂、化妆水、局部贴剂、水凝胶贴剂或洗发剂。局部应用的多肽可以应用至受影响的区域、将来可能变得受影响的区域、对象的一部分或基本上整个对象。在一些情况下，局部治疗可以与缓冲剂、另一种局部治疗剂、乳膏或保湿剂一起应用。
92.组合物(诸如用于局部应用的)可以被配制成化妆品用组合物。化妆品用组合物的实例可以包括化妆品、粉底、防晒霜、晒后乳液和护肤产品，包括抗老化护肤产品。在一些情况下，化妆组合物可以在脸上留下颜色，并且可以包括粉底、古铜色化妆品、睫毛膏、遮瑕膏、眼线笔、眉毛颜色、眼影、腮红、唇色、粉末、固体乳液粉饼或其他化妆用品。在一些情况下，护肤产品可以是用于治疗或护理，或以某种方式保湿、改善、加速更新、保护、防止损伤或清洁皮肤的那些产品。护肤产品可以作为以下应用：乳膏、局部贴剂、水凝胶贴剂、透皮贴剂、软膏、凝胶、液体、粉末、爽肤水、精华素、乳液、油、粘土、保湿剂、泡沫、面膜、摩丝、气雾剂、喷雾剂、清洁剂、化妆水或洗发剂。在一些情况下，护肤产品可以呈粘合剂、绷带、去角质剂、牙膏、保湿剂、爽肤水、底剂、唇膏、润唇膏、无水闭塞保湿剂、止汗剂、除臭剂、个人清洁产品、闭塞药物递送贴剂、指甲油、粉末、纸巾、抹布、护发素或剃须膏的形式。
93.如本文所考虑的组合物也可以是可食用的，即，配制成可食用补充剂或饮料，使得所述组合物被配制成供人类安全消费。在一些情况下，可食用组合物对于治疗与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症可以是治疗有效的。在一些情况下，可食用补充剂可以被配置为片剂、胶囊、咀嚼物、橡皮糖、粉末、食物棒、膳食替代棒或食品添加剂。在一些情况下，饮料可以被配制成包含水、苏打、茶、咖啡、牛奶、果汁、奶昔、饮品或其他可食用液体。
94.在一些情况下，组合物可以包含皮肤调理剂(例如湿润剂、去角质剂、润肤剂或保湿液)。湿润剂可以用于保湿、减少鳞屑或刺激从皮肤上去除积聚的鳞屑。去角质剂可以用于从表面去除旧的皮肤细胞，并且可以是物理去角质剂或化学去角质剂。润肤剂可以是能够软化干燥、粗糙或鳞屑状皮肤的配制品或成分。保湿液可以用于保湿、减少鳞屑或刺激从皮肤上去除积聚的鳞屑。在一些情况下，润肤剂是防止水分流失的试剂，并且对皮肤具有软化和舒缓作用。在一些实施方案中，润肤剂可以包含以下中的至少一种：植物油、矿物油、乳木果油、可可脂、凡士林、脂肪酸(动物油，包括鸸鹋油、水貂油和羊毛脂)、甘油三酯、苯甲酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、糖脂、磷脂、角鲨烯、甘油、玫瑰果油、酸渣树(andiroba)油、葡萄籽油、鳄梨油、李子籽油、巴卡斯果油、云杉光皮树(calycophyllum spruceanum)油、杏仁油、摩洛哥坚果油、辛酸/癸酸甘油三酯、霍霍巴脂、霍霍巴油、spectrastat g2、神经酰胺和藻类提取物。在一些情况下，所述组合物包含皮肤保湿剂，也称为皮肤保湿液。在一些情况下，皮肤保湿剂包括但不限于甘油、角鲨烯、山梨醇、透明质酸、透明质酸衍生物、透明质酸钠、透明质酸钠交联聚合物、烟酰胺、糖蛋白、吡咯烷酮羧酸(pca)、赖氨酸hcl、尿囊素和藻类提取物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的皮肤调理剂。在一些实施方案中，所述组合物包含约1％至约70％、约1％至约60％、约1％至约50％、约5％至约50％、约5％至45％或约
5％至40％的皮肤调理剂。
95.组合物可以包含光泽控制剂，其可以改善或调节皮肤的光泽外观。光泽控制剂本质上可以是多孔的。此类试剂可以提供储层来吸收过量的水分，以减少光泽外观。光泽控制剂可以是硅石、硅酸镁铝、滑石、绢云母和各种有机共聚物。特别有效的光泽控制剂可以包括通过碳酸盐或硅酸盐与碱(ia)金属、碱土(ia)金属或过渡金属和硅石(二氧化硅)反应形成的硅酸盐或碳酸盐。优选的光泽控制剂选自硅酸钙、无定形硅石、碳酸钙、碳酸镁、碳酸锌、膨润土及其组合。
96.组合物可以包含成膜剂，其可以有助于膜亲合性和对皮肤的粘附性。成膜剂可以改善组合物的耐久性和非转移性能。成膜剂可以是水溶性的、水不溶性的或水分散性的。成膜剂可以是1)有机硅氧烷树脂、氟化硅氧烷树脂、有机硅氧烷树脂的共聚物、三甲基硅烷氧基硅酸酯、ge的硅氧烷树脂共聚物、sf1318(硅氧烷树脂和异硬脂酸的有机酯共聚物)和cf1301(硅氧烷树脂和α甲基苯乙烯共聚物)、dow corning的硅氧烷树脂和各种pdms的压敏粘合剂共聚物(bio-psa系列)；和2)丙烯酸和甲基丙烯酸聚合物和树脂、硅氧烷-丙烯酸酯型共聚物和以下的氟化形式：包括来自3m的硅氧烷加聚合物、来自shin-etsu的kp545、烷基-丙烯酸酯共聚物，来自shin-etsu的kp 561和562；3)来自collaborative实验室的癸烯/丁烯共聚物；4)基于聚乙烯的材料、pvp、pvp/va，包括来自isp的antaron/ganex(pvp/triacontene共聚物)、来自basf的luviskol材料；聚氨酯，来自alzo的polyderm系列，包括但不限于来自basf的polyderm pe/pa、polyderm ppi-si-ws、polyderm ppi-gh、luviset p.u.r.；6)聚季铵盐材料，来自basf的luviquat系列；7)丙烯酸酯共聚物和丙烯酸酯/丙烯酰胺共聚物，luvimer和ultrahold系列，两者均购自basf；8)基于苯乙烯的材料；和9)壳聚糖和基于壳聚糖的材料，包括纤维素和基于纤维素的材料。
97.组合物可以包含增稠剂或乳化剂。增稠剂可以用于提高待在化妆品用组合物中使用的液体基质材料的粘度。特定增稠剂的选择可以取决于所期望组合物的类型(例如，凝胶、乳膏、爽肤水或蜡基)、所期望的流变性、所使用的液体基质材料和有待在组合物中使用的其他材料。增稠剂或乳化剂的实例可以包括蜡质物质，诸如小烛树蜡、巴西棕榈蜡、蜂蜡、鲸蜡、棕榈蜡、杨梅蜡、褐煤蜡、地蜡、纯地蜡、石蜡、合成蜡，诸如fisher-tropsch蜡、硅酮蜡(来自dow corning的dc 2503)、微晶蜡等；肥皂，诸如高级脂肪酸的钠盐和钾盐，具有12至22个碳原子的酸；高级脂肪酸的酰胺；烷醇胺的高级脂肪酸酰胺；二苯甲醛单山梨醇缩醛；乙酸盐、丙酸盐和乳酸盐的碱金属和碱土金属盐；及其混合物。也有用的是聚合材料，诸如刺槐豆胶、藻酸钠、酪蛋白酸钠、卵清蛋白、明胶琼脂、角叉菜胶藻酸钠、黄原胶、榅桲籽提取物、黄蓍胶、淀粉、化学改性淀粉等；半合成聚合材料，诸如纤维素、纤维素衍生物、纤维素醚羟乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、瓜尔胶、羟丙基瓜尔胶、可溶性淀粉、阳离子纤维素、阳离子瓜尔胶等；以及合成聚合材料，诸如羧乙烯基聚合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇聚丙烯酸聚合物、聚(丙烯酸)、卡波姆、聚甲基丙烯酸聚合物、聚乙酸乙烯酯聚合物、聚氯乙烯聚合物、聚偏二氯乙烯聚合物等。也可以使用无机增稠剂，诸如硅酸铝，例如膨润土，或聚乙二醇和聚乙二醇硬脂酸酯或二硬脂酸酯的混合物。乳化剂可以用于帮助防止乳液中的亲水和疏水成分分离。在一些情况下，乳化剂包括但不限于olivem、oliwax lc、聚山梨醇酯、月桂醇聚醚-4和十六烷基硫酸钾。
98.化妆品用组合物可以提供暂时的外观变化或可以提供长期的外观变化。在一些情况下，可以配制化妆品用组合物以提供外观的短期变化(例如，颜色沉积或皮肤丰满)以及外观的长期变化(例如，斑点减少、细纹出现、皱纹出现或可能影响外观的其他特征)。
99.组合物可以包含添加剂，当与如本文所公开的多肽一起应用时，所述添加剂具有相加或协同效应。例如，包含多肽和添加剂的组合物对衰老，以及与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症的作用(例如，延迟一种或多种症状的发作、减少其发生或对其进行改善)可以大于添加剂、多肽的单独作用，或添加剂和多肽的单独作用的总和。添加剂可以是另外的多肽、糖胺聚糖、碳水化合物、多酚、蛋白质、脂质、植物水或油提取物、核酸、抗体、小分子、维生素、湿润剂、润肤剂或另一种合适的添加剂。在一些实施方案中，所述组合物包含uv阻断剂。在一些实施方案中，所述uv阻断剂可以包括但不限于氨基苯甲酸、阿伏苯宗、西诺沙酯、二羟苯宗、胡莫柳酯、邻氨基苯甲酸甲酯(meradimate)、氰双苯丙烯酸辛酯、肉桂酸辛酯、辛水杨酯、氧苯酮、二甲基氨基苯甲酸(padimate o)、恩素利唑、磺异苯酮、二氧化钛、水杨酸三乙醇胺和氧化锌。
100.本文提供的方法、系统和组合物通常包含维生素。在一些情况下，维生素提供皮肤舒缓、皮肤修复、皮肤补充和/或水合作用。在一些情况下，维生素提供抗氧化作用。在一些情况下，维生素充当润肤剂。在一些情况下，维生素改善毛孔粗大、肤色不均、细纹、暗沉和/或皮肤表面变弱的外观。在一些情况下，所述维生素是维生素a、维生素d、维生素e、维生素f、维生素k、维生素b1(硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酸)、维生素b5(泛酸)、维生素b7(生物素)、维生素b6、维生素b12(氰钴胺素)、维生素b9、叶酸、烟酰胺及其混合物。在一些情况下，所述组合物包含维生素的衍生物。在一些情况下，维生素的衍生物用于改善维生素在所述组合物中的稳定性和/或维生素衍生物与所述组合物中其他成分的相容性。在一些情况下，所述组合物包含维生素b3或其衍生物和维生素e或其衍生物。在一些情况下，所述组合物包含烟酰胺和维生素e或其衍生物。在一些情况下，所述组合物包含维生素c或其衍生物、维生素b3或其衍生物和维生素e或其衍生物。在一些实施方案中，所述组合物包含至少0.01％、0.05％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的维生素。在一些实施方案中，所述组合物包含约0.1％至约10％、约0.1％至约5％、约0.5％至约10％、约0.5％至约5％、约1％至10％或约1％至5％的维生素。
101.用于局部施用的组合物可以进一步包含载体。所述载体可以是溶液、乳液、软膏、油或凝胶基质。例如，凝胶基质可包含以下中的一种或多种：凡士林、羊毛脂、peg、蜂蜡、矿物油、稀释剂诸如水和醇、乳化剂和/或稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的治疗组合物中。如果旨在用于透皮施用，则所述组合物可以包括透皮贴剂或离子电渗疗法装置。在一些情况下，可生物降解的微球(例如聚乳酸)也可以用作组合物的载体。在一些情况下，透皮贴剂被制备成将所述制剂递送至皮肤的表皮层。在一些情况下，透皮贴剂被制备成将所述制剂递送至皮肤的表皮层和真皮层。在一些情况下，所述制剂被制备成在对象中最低限度地全身性递送，或者不旨在直接递送到对象的血流中。
102.组合物还可以含有一种或多种稀释剂，诸如缓冲剂，或者一种或多种抗氧化剂，诸如抗坏血酸、低分子量多肽、多肽、氨基酸、碳水化合物(包括葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合剂(诸如edta)、谷胱甘肽和其他稳定剂。中性缓冲盐水或与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性的稀释剂。可以使用合适的赋形剂溶液(例如蔗糖)作为稀释剂将产品配制成冻干
物。
103.组合物还可以包含一种或多种赋形剂，诸如治疗、营养或化妆品用的赋形剂。赋形剂的实例可以包括抗粘附剂、粘合剂、包衣、着色剂、崩解剂、调味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂或载体。
104.合适的赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下可以对接受者无毒，并且可以包含缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；盐，诸如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸、维生素e和蛋氨酸；防腐剂(例如像，十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；葡萄糖酸内酯和苯甲酸钠；苯酚、丁醇或苯甲醇；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白或明胶；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta或edta替代物(例如biopure glda、spectrastat g2)；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属配合物(例如，zn-蛋白质配合物)；和/或表面活性剂。在一些情况下，表面活性剂包括但不限于聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、藻酸盐、泊洛沙姆、triton(叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；非离子洗涤剂；十二烷基硫酸钠(sds)；硫酸月桂酸钠；辛基糖苷钠；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油酸基-或硬脂基-磺基甜菜碱(sulfohetame)；月桂基-、肉豆蔻基-、亚油酸基-或硬脂基-肌氨酸；亚油酸基-、肉豆蔻基-或十六烷基-甜菜碱；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亚油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-甜菜碱(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕榈酰胺丙基-或异硬脂酰胺丙基-二甲胺甲基可可酰基牛磺酸钠-、或甲基油酰基-牛磺酸二钠；山梨糖醇酐单棕榈酸酯；以及monaquat系列(新泽西州帕特森的mona industries.inc.)；聚乙二醇(peg)、聚丙二醇(ppg)、聚氧乙烯和聚氧丙烯二醇的共聚物(例如，pluronies/poloxamer、f68等)；或另一种合适的表面活性剂。在一些情况下，所述组合物可以包含角鲨烯、天然油、植物提取物、透明质酸或粘土。在一些情况下，所述组合物包含皮肤渗透促进剂，以促进活性成分渗透到皮肤中。在一些情况下，皮肤渗透促进剂可以包括但不限于脂肪酸、精油、尿素、脂质体、微球、dmso、氮酮、pca钠和角鲨烯。
105.在一些实施方案中，所述制剂包含载体、微球、脂质体或胶束，以便携带所述多肽，并控制所述多肽在皮肤中的释放时间和/或渗透深度。
106.在一些实施方案中，所述多肽被功能化。在一些实施方案中，所述多肽被化学基团功能化。在一些实施方案中，所述多肽被包含不超过3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或超过20个碳的官能团功能化。在一些实施方案中，所述多肽被乙酰基或棕榈酰基功能化。
107.可以对应用至对象的多肽或组合物进行灭菌。这可以通过例如，通过无菌过滤膜进行过滤或本领域公认的任何其他灭菌方法来完成。
108.组合物可以包含治疗有效量的多肽或肽模拟物，其量可以延迟与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症的一种或多种症状(诸如皮肤症状)的发作、减少其发生或对其进行改善。在一些情况下，治疗有效量可以是能够在对象中引发治疗(例如，衰老治疗)或所期望反应的治疗剂(例如，多肽)的量。治疗有效量可以足够对对象产生治疗益处。治疗有效量可以根据多种因素而变化，这些因素包括选择使用的活性剂，以及待治疗的对象的年龄、
体重、身高和/或总体健康状况。
109.如在临床上下文中所理解的，活性剂的有效治疗量可以或不可以与另一种药物、化合物、治疗或药物组合物结合来实现。因此，可以在施用一种或多种活性剂的情况下考虑有效治疗量，并且如果与一种或多种其他活性剂结合可以或已实现期望的结果，则可以认为单一活性剂以有效量被给予。因此，在一些情况下，可以向对象施用一种或多种活性剂。在其他情况下，在本文所述的一种或多种其他治疗形式之前或之后用本文所述活性剂进行治疗。多肽合成
110.还公开了编码一种或多种目前公开的多肽的分离的多核苷酸。分离的多核苷酸可以存在于表达载体中，所述表达载体包含与启动子可操作连接的分离的多核苷酸。表达载体可以存在于分离的细胞(即，用表达载体转染或转化的重组细胞)中。
111.合适的表达载体可以包括细菌、植物、真菌、昆虫或动物宿主细胞复制，和/或表达所公开的肽、多肽及其变体的表达载体。表达载体可以用于转化适当的宿主细胞(例如大肠杆菌(e.coli))。可以培养或发酵转化的宿主细胞，使得所述肽或多肽组成性地表达，或者在添加诱导表达(例如，经由诱导型启动子)的试剂后表达。如本文所考虑的表达载体可以包括调节经编码多肽表达的控制序列。表达控制序列可以包括组成型或诱导型启动子(例如t3、t7、lac、trp或phoa)、核糖体结合位点或转录终止子。
112.表达载体可以用于转化宿主细胞。合适的宿主细胞包括细菌、植物、真菌、昆虫或动物宿主细胞。合适的细菌包括但不限于：革兰氏阴性菌，诸如埃希氏(escherichia)菌属(例如大肠杆菌)，其他革兰氏阴性菌(例如假单胞菌属(pseudomonas sp.)，诸如绿脓假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)或茎杆菌属(caulobacter sp.)，诸如新月柄杆菌(caulobacter crescentus))，或革兰氏阳性菌(例如芽孢杆菌属(bacillus sp.)，诸如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis))。合适的真菌细胞可以包括酵母(例如，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae))。
113.表达载体可以例如，提供多肽合成的机制。合成可以在细胞(例如动物细胞、植物细胞、细菌细胞或酵母细胞)中进行。表达载体可以包含核酸，例如来源于质粒、粘粒、噬菌粒或噬菌体或者通过化学或酶方法合成的dna，可以编码本文所述的一种或多种多肽的核酸的一个或多个片段可以插入或克隆到表达载体中。表达载体能够在限定的宿主或生物体中自主复制，从而复制经克隆的序列。表达载体可以具有线性、环状或超螺旋构型，并且可以为了某些目的与其他载体或其他材料复合。表达载体的组分可以包括但不限于掺入了以下的dna分子：(1)dna；(2)编码治疗或期望产物的序列；或(3)用于转录、翻译、rna稳定性和复制的调节元件。
114.可以使用表达载体产生多肽。在一些情况下，这种产生可以包括培养或发酵转化的宿主细胞(例如，如本文所考虑的细菌宿主细胞)，其包含表达载体(如本文所考虑的)，所述表达载体又包含编码所公开的肽、多肽或其变体(如本文所考虑的)的核酸分子，其中培养在导致所述肽、多肽或变体表达的条件下进行；以及分离、分隔或纯化所述肽、多肽或变体。可以使用本领域已知的方法培养或发酵转化的细菌，以便表达所述肽、多肽或变体。示例性分离、分隔或纯化方法可以包括一个或多个以下步骤：细胞破碎步骤、澄清步骤(例如，经由离心或过滤)、色谱分离步骤、透析步骤和沉淀步骤。
115.在一些其他实施方案中，所述多肽可以化学合成。多肽的合成可以使用溶液相技术、固相方法或其他合适的多肽合成方法来进行。方法
116.提供了使用本文公开的多肽和组合物的方法。此类方法可以包括将一种或多种本文所述多肽应用至对象。本文所述的方法可以延迟与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症的发作、减少其发生或对其进行改善。
117.本文所述的方法可以延迟与衰老细胞积累相关的疾病、病症或病况的发作、减少其发生、减少其出现或对其进行改善。与衰老细胞积累相关的疾病或病症可能是年龄有关的。在一些情况下，如果不治疗，则所述疾病或病症可能随着时间推移而恶化。
118.可以将多肽或组合物应用或施用至对象，以治疗直接或间接受皮肤健康影响的病况。这种方法可以包括向对象施用促进皮肤健康的化合物或向皮肤应用局部治疗。
119.年龄相关性病症可以包括在可能影响身体的疾病过程中发生的事件的生物学进展，其可以模拟或基本模拟正常对象中发生的全部或部分老化事件。在一些情况下，事件的这种生物学进展可以在加速的时间框架内发生。
120.与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症可能与身体的正常过程(诸如运动和进食能力)有关。
121.在一些情况下，与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症可以是影响皮肤的疾病、病况或病症，诸如皮肤病症或皮肤病(可以包括皱纹、细纹、干燥、瘙痒、斑点、老年斑、褥疮、溃疡、癌症、色素沉着异常、感染(例如真菌感染)或皮肤特性(诸如透明度、纹理、弹性、颜色、色调、柔韧性、紧致度、紧密度、光滑度、厚度、光泽、发光度、水合作用、保水性、皮肤屏障、均匀性、松弛度或含油性))或其他皮肤病的减少。在一些情况下，与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症是皮肤色素沉着过度。在一些情况下，色素沉着过度病症是黑斑病、老年斑、雀斑样痣和/或进行性色素性紫癜。在一些情况下，色素沉着过度是日光损伤、炎症、激素变化或皮肤损伤的结果。在一些情况下，色素沉着过度发生在美容手术，包括但不限于激光治疗、光治疗或化学剥离；施用抗生素、口服避孕药或光敏药物；或应用局部试剂之后。在一些情况下，色素沉着过度是黑色素过度产生的结果。
122.在一些情况下，用本文公开的方法、系统和组合物治疗与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症导致皮肤外观增亮、增强发光、变亮、均匀、光滑和/或紧致。在一些情况下，用本文公开的方法、系统和组合物进行治疗改善了表皮屏障、皮肤水合作用水平、皮肤保水性、皱纹外观、光滑度、紧致度、弹性、光泽和亮度外观，和/或改善或维持了皮肤中的神经酰胺水平。在一些情况下，通过测量皮肤含水量、经表皮水分损失(tewl)、真皮厚度和回声反射性、皮内分析、皮肤粘弹性或皮肤表面轮廓来评估用本文公开的方法、系统和组合物进行治疗的效果。在一些情况下，用本文公开的方法、系统和组合物进行治疗的效果评估细纹/皱纹外观、肤色外观(均匀性)、毛孔外观、纹理/光滑度外观、紧致度(视觉)、弹性(触觉)、表皮屏障、皮肤粗糙度、皮肤色素沉着过度或整体外观的减少。在一些情况下，使用仪器来测量用本文公开的方法、系统和组合物进行治疗的效果，所述仪器包括但不限于用于测量皮肤含水量/水合作用的皮肤水分测定仪(corneometer)、用于测量经表皮水分损失(tewl)的蒸汽压力计(vapometer)、测量真皮厚度(密度)和回声反射性的超声波、用于测量皮肤均匀性和发色团映射的非侵入性光学皮肤成像仪器、用于测量皮肤粘弹性(紧致度和
弹性)的使用吸力的皮肤弹性测定仪(cutometer)、皮肤轮廓测定法、多光谱分析，以及用于测量皮肤表面轮廓、细纹和皱纹的比色法
123.在一些情况下，对与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症进行治疗导致皱纹或皮肤色素沉着的外观减少例如10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％。在一些情况下，仪器测量显示，与使用所述组合物之前相比，在使用所述组合物之后，细纹/皱纹外观、肤色外观(均匀性)、毛孔外观、纹理/光滑度外观、紧致度(视觉)、弹性(触觉)、表皮屏障、皮肤粗糙度、皮肤光泽或整体外观中的至少一项改善了至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些情况下，与使用所述组合物之前的基线相比，改善表现为平均百分比改善(mpi)。在一些情况下，与使用所述组合物之前相比，在使用所述组合物之后，mpi为至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。在一些情况下，在使用所述组合物之后1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、5个月、6个月或一年时进行测量。在一些情况下，所述治疗的效果由皮肤病况、病症或疾病方面的专家进行评估，所述专家分析所述皮肤测量中的一个或多个。在一些情况下，所述治疗的效果由使用者自己进行评估。在一些情况下，在使用本文公开的方法、系统和组合物之后，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的使用者可以报告皮肤屏障、皮肤粗糙度、皮肤光泽、细纹/皱纹外观、肤色外观(均匀性)、毛孔外观、纹理/光滑度外观、紧致度(视觉)、弹性(触觉)或整体外观中的至少一项的改善。在一些情况下，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的使用者可以报告皮肤水合作用的改善。在一些情况下，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的使用者可以报告皮肤屏障功能的改善。
124.在一些情况下，本文提供的方法、系统和组合物可以减少皮肤色素沉着过度。在一些情况下，色素沉着过度与黑色素的过度产生相关。在一些情况下，本文提供的方法、系统和组合物减少黑色素的过度产生。在一些情况下，本文提供的方法、系统和组合物减少皮肤中黑色素的存在。在一些情况下，本文提供的方法、系统和组合物降低经处理的皮肤细胞中的参与黑色素生成的蛋白质的表达水平，所述蛋白质包括酪氨酸酶、黑色素细胞诱导转录因子(mitf)和多巴色素互变异构酶(dct)。在一些情况下，本文提供的方法、系统和组合物导致酪氨酸酶活性减少、酪氨酸酶的表达或活化减少、黑色素合成的中间产物的清除、黑素体向角质形成细胞的转移减少、现有黑色素含量减少或黑色素细胞活性或存活力减少。
125.在一些情况下，本文提供的方法、系统和组合物可以减轻皮肤炎症。在一些情况下，本文提供的方法、系统和组合物可以减少经处理皮肤细胞中的参与炎症的蛋白质、干扰素-γ(ifn-γ)和白细胞介素10(il-10)的表达水平。
126.在一些实施方案中，本文所述的组合物每天施用一次、每天施用两次、每天施用三次或更多次。在一些实施方案中，本文所述的组合物每日施用两次，例如在早上和晚上。在一些实施方案中，本文所述的组合物每日施用、每天施用、每隔一天施用、每周施用五天、每周施用一次、每隔一周施用、每月施用两周、每月施用三周、每月施用一次、每月施用两次、每月施用三次或更多次。在一些实施方案中，本文所述的组合物施用至少1周、2周、3周、1个
月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、18个月、2年、3年、4年、5年或更久。在一些实施方案中，所述组合物被指示在早上和晚上作为光滑层应用至面部和/或颈部的清洁干燥的皮肤上。在一些实施方案中，制剂是每日必需的局部补充剂，其被科学配制以改善皮肤弹性和加强表皮屏障，从而使皮肤持久健康。在一些实施方案中，使用者将本文所述的包含至少一种多肽的组合物应用至面部和/或颈部。在一些实施方案中，所述组合物被指示应用至身体上的皮肤。在一些实施方案中，将本文所述的组合物与其他局部组合物(诸如uv阻断剂)结合使用。在一些实施方案中，在应用另一种局部组合物之前、同时或之后应用本文所述的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含uv阻断剂。
127.多肽或组合物可以局部应用，即至皮肤，以延迟影响皮肤的疾病、病况或病症的发作、减少其发生或对其进行改善。
128.与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症可以由以下引起：uv损伤、dna损伤、细胞核中atrx聚集点积聚、提高的p16表达、提高的衰老相关的β-半乳糖苷酶活性、组织中衰老细胞积聚、提高的sasp产生、化学诱导的衰老、年龄老化、减少的透明质酸产生、减少的去乙酰化酶6表达、改变的胰岛素样生长因子-1(igf-i)途径信号传导、提高的基质金属肽酶1(mmp1)产生、薄皮肤表皮层或遗传变异。在一些情况下，与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症是由治疗方案(例如，治疗药物的副作用)引发或加剧的。与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症可以直接或间接地影响皮肤的健康或外观。在一些这样的情况下，局部应用本文的多肽或组合物可以改善皮肤的健康或外观。
129.与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症可以包括细胞增殖性病症。细胞增殖性病症可能会影响皮肤的健康或外观。在一些情况下，针对细胞增殖性病症施用的治疗，诸如化疗或放疗可能会影响皮肤的健康或外观。在一些这样的情况下，局部应用本文的多肽或组合物可以改善皮肤的健康或外观。
130.本文还提供了用于治疗对象皮肤的方法，其包括向对象施用可以促进组织或生物体中衰老细胞数量减少的组合物，在经处理的细胞中诱导促凋亡状态、诱导sirt6表达、预防dna诱导的衰老，和/或增强dna修复能力。在一些情况下，皮肤疾病(诸如皮肤病或病况)可以包括皮肤下垂或起皱、衰老细胞在组织中积聚、表皮厚度减少、胶原蛋白产生减少、mmp-1产生提高、dna修复能力减少、sirt6表达减少、皮肤组织破坏、薄皮肤表皮层、炎症、衰老相关的分泌表型或皮肤干细胞耗竭。
131.方法可以包括向对象施用包含多肽的组合物，所述多肽可以促进组织或生物体中衰老细胞数量的显著减少。衰老细胞数量的减少可以包括经处理细胞中的促凋亡状态、诱导sirt6表达、预防dna诱导的衰老，或增强dna修复能力。在一些情况下，样品、对象的一部分(例如，对象的面部皮肤)和/或对象中衰老细胞的数量可以减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。
132.可以将多肽或组合物应用或施用至细胞、组织或对象。在一些情况下，多肽的应用或施用可以在细胞、组织或对象中产生衰老治疗效果。在一些情况下，多肽可以被施用至对象，局部应用至对象，或与经培养的细胞一起孵育以提供衰老治疗效果。
133.细胞可以是经培养的细胞或者从对象或细胞系中分离的细胞。经培养细胞的一些实例可以包括角质形成细胞或成纤维细胞或黑色素细胞。细胞可以是野生型的，或者可以
是遗传修饰的。一些遗传修饰可以促进衰老，诸如p53/p21途径、p16/rb途径、mrna或mir基因以及其他rna类别中的遗传修饰。在一些情况下，将多肽或组合物应用至细胞可以减少细胞的衰老。在一些情况下，细胞可以包括生物体(包括但不限于动物、秀丽隐杆线虫和人)的体内或原位的细胞。
134.组织可以是对象的组织或已经从对象分离的组织，即离体组织。在一些情况下，组织可以人工生长。组织可以包括皮肤，并且组织的实例可以包括健康皮肤、患病皮肤、老化皮肤或头皮。在一些情况下，将多肽或组合物应用至组织可以减少组织的一个或多个细胞或整个组织的衰老。在一些情况下，组织可以包括生物体(包括但不限于动物、秀丽隐杆线虫和人)的体内或原位的组织。
135.在对象是人的情况下，对象可以是任何年龄的。在一些情况下，对象患有与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症，处于与年龄相关的疾病或病况或与年龄相关的病症的风险中，或者是健康的。对象可以是男性或女性。
136.方法可以包括多肽或组合物的局部应用。局部应用可以包括将多肽或组合物擦涂、喷雾、浸渍、轻拍或以其他方式应用至皮肤或粘膜。实施例实施例1
137.分离自早衰症患者的原代成纤维细胞可以构成人类早期老化和细胞衰老的遗传模型。来自早衰症患者的原代成纤维细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液(1,000u.ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)中培养。将细胞保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中。在扩增后，将这些细胞接种在96孔板中(每孔1,000个细胞)，并且在铺板后6小时，以50μm与来自专有文库的单个多肽一起孵育48小时。阴性对照包括未处理的细胞，其仅接受载体；阳性对照组包括用10μm abt-263(一种抗衰老化合物)孵育相同时间的细胞。在孵育后，如图1所示分析相对细胞衰老(通过归一化至未处理对照的衰老相关的b-半乳糖苷酶染色活性来评估)，其中y轴表示孔中的细胞总数(归一化至未处理对照)，并且x轴表示衰老相关的b-半乳糖苷酶染色强度/细胞核(即衰老水平)，也归一化至阴性对照。进行了包括三个技术重复的三个独立实验。促进细胞衰老显著减少至低于未处理对照样品的75％的多肽被认为是阳性命中。
138.总共测试了764种多肽，其中56种促进细胞衰老减少至低于未处理对照样品的75％。因此，它们被认为是阳性命中，并被认为是假定的衰老治疗化合物。在实验中被认为是阳性对照的abt-263也促进了细胞衰老以及细胞毒性的显著减少。这一观察证实了abt-263的抗衰老特征，以及一些经测试多肽的衰老治疗潜力(图1)。实施例2
139.使用从3名按年龄顺序排列的健康老年患者分离的原代成纤维细胞。细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液(1,000u.ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)中培养。细胞保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中。在扩增后，将这些细胞接种在96孔板中(每孔4,000个细胞)，并且在铺板后6小时，用4种衰老治疗多肽(肽14、肽13、肽15和肽16)之一处理细胞，并孵育48小时。除了肽16之外，测试6种不同浓度的每种多肽：50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.12μm和1.56μm，对5种不同浓度的肽16进行测试：25μm、12.5μm、6.25μm、3.12μm和1.56μm。阴性对照包括未处理的细胞，其仅接受载
体。在孵育后，分析相对细胞衰老(通过归一化至未处理对照的衰老相关的b-半乳糖苷酶染色活性来评估)(图2，图a-d)，其中y轴表示归一化至未处理对照的相对衰老水平。每一列对应于不同浓度的多肽。进行了三个独立的实验(生物重复)，包括三个技术重复。使用方差分析(anova)和bonferroni事后检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05。
140.所有多肽均在至少一个测试浓度下表现出通过与未处理对照相比细胞衰老的显著减少证明的衰老治疗潜力。与未处理对照(ctrl)相比，*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001(图2，图a-d)。实施例3
141.atrx是一种染色质重塑酶，其有助于衰老相关异色聚集点的形成。在衰老过程中，它越来越多地积聚在细胞核聚集点中。因此，它构成了细胞衰老的标志。为了研究肽14是否降低细胞衰老水平，在肽14处理的(1μm、500nm、100nm和10nm)和未处理的细胞中分析atrx聚集点。为此，使用从3名按年龄顺序排列的健康老年(年长的)供体分离的原代成纤维细胞。这些细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液(1,000u.ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)中培养。细胞保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中。在扩增后，将这些细胞接种在96孔板中(每孔4,000个细胞)，并且在铺板后6小时，与前述浓度的肽14多肽一起孵育48小时。阴性对照包括未处理的细胞，其仅接受载体。在孵育后，评估相对细胞衰老。简而言之，通过用抗atrx抗体固定、渗透和孵育细胞，随后第二抗体，进行免疫染色。计算细胞核和经染色atrx聚集点的数量。图3的图a示出了显示细胞数量(y轴)的代表性图表，呈现以列(x轴)表示的特定数量的atrx聚集点/细胞。上图描绘了未处理的细胞，而下图描绘了用500nm的肽14处理的细胞。图3的图b示出了用不同条件的肽14处理的成纤维细胞的atrx聚集点/细胞核的平均数量(列)。图3的图c示出了用不同条件的肽14处理的成纤维细胞中呈现少于10个atrx聚集点/细胞核的细胞百分比(列)。进行了三个独立的实验(生物重复)，包括三个技术重复。使用anova和bonferroni事后检验分析图3的图b和c中的数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05。
142.与未处理的细胞相比，当在500nm和50nm下使用时，肽14处理显著减少了atrx聚集点/细胞核。在相同浓度下，肽14也增加了呈现少于10个聚集点/细胞核的细胞数量。与未处理对照(ctrl)相比，*p《0.05；**p《0.01(图3)。实施例4
143.使用从3名按年龄顺序排列的健康老年(年长的)供体分离的人原代成纤维细胞。这些细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液(1,000u.ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)中培养。细胞保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中。在扩增后，将这些细胞接种在t-75瓶中(每瓶250,000个细胞)，并且在铺板后6小时，用3.12μm的肽14孵育3周(21天)。阴性对照包括未处理的细胞，其仅接受载体。第0天定义为开始用肽14处理细胞的那一天。在第21天和第28天之间没有进行肽14处理。每周，根据衰老相关的β-半乳糖苷酶染色水平评估细胞衰老。将数据归一化至未处理组并作图(图4，图a)。每周还测定细胞增殖。在第7、14、21和28天，用胰蛋白酶消化细胞并计数(图4，图b)。在计数后，将250,000个细胞铺板在新的t-75瓶中。进行了三个独立的实验(生物重复)，包括三个技术重复。使用t检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05。
144.从第二周开始，肽14促进细胞衰老的显著减少(***p《0.001；****p《0.0001)。在21
天的治疗后，在去除多肽后，肽14的衰老治疗效果维持至少7天(在实验第21天和第28天之间)。比较肽14处理组和未处理对照，没有观察到关于细胞增殖的显著差异(图4)。实施例5
145.使用从7名按年龄顺序排列的健康老年患者分离的原代成纤维细胞(患者被随机鉴定为患者2、3、4、5、6、7或8)。这些细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液(1,000u.ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)中培养。细胞保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中。在扩增后，将这些细胞接种在96孔板中(每孔4,000个细胞)，并且在铺板后6小时，用5种不同浓度的肽14孵育48小时：25μm(浓度5)、12.5μm(浓度4)、6.25μm(浓度3)、3.12μm(浓度2)和1.56μm(浓度1)。阴性对照包括未处理的细胞(浓度0)，其仅接受载体。在孵育后，根据atrx免疫染色后定量的atrx聚集点/细胞核的平均数量确定相对细胞衰老。进行了七个独立的实验(生物重复)，包括三个技术重复。使用协方差检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05(图5)。
146.协方差分析显示，在肽14处理后，atrx聚集点/细胞核的数量显著减少。肽14的功效遵循剂量反应模式，其中浓度和atrx聚集点/细胞核显著相关(p《0.0004)(图5)。实施例6
147.细胞衰老可能由几种不同的刺激引起。为了评估肽14是否有效对抗uvb诱导的和化学诱导的衰老，使用了从3名健康供体分离的人原代成纤维细胞。这些细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液(1,000u
·
ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)中培养。细胞保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中。在扩增后，将这些细胞接种在96孔板中(每孔4,000个细胞)，并且在铺板后6小时，进行依托泊苷(20μm)处理24小时，或暴露于0.05j/cm2的uvb辐射两次。每次uvb暴露对应于世界各地主要城市(例如，奥克兰，nz；洛杉矶，us；和巴西利亚，br)的4月份每日大约1至3小时的日晒。在不同的衰老诱导方案后，将依托泊苷处理的细胞与5μm、2.5μm或1μm的肽14一起孵育48小时。用5μm的肽14处理uvb暴露的细胞48小时。阴性对照包括未处理的细胞，其经受应激，但仅接受载体。在孵育后，分析相对细胞衰老(通过相对于未处理对照的衰老相关的β-半乳糖苷酶染色活性来评估)，并绘制成柱形图。在atrx免疫荧光染色后还评估atrx聚集点。使用每个细胞核检测到的平均atrx聚集点建立图表。进行了三个独立的实验(生物重复)，包括三个技术重复。使用t检验或anova，随后是bonferroni事后检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05(图6)。
148.依托泊苷处理促进了细胞衰老水平的显著升高(p《0.001)，以及atrx聚集点细胞核积累的显著升高(表示为atrx聚集点/细胞的平均数量；p《0.05)(图6，图a)。当用2.5μm或5μm的肽14处理依托泊苷应激的细胞时，衰老相关的β-半乳糖苷酶染色显著减少(*p《0.05)(图6，图b，左图)。当用2.5μm肽14处理依托泊苷暴露的细胞时，平均atrx聚集点/细胞也显著减少，如图6的图b的右图所示。uvb暴露还促进了细胞衰老的显著升高，如通过衰老相关的β-半乳糖苷酶染色所评估，5μm肽14处理能够显著防止细胞衰老(*p《0.05)，如图6的图c的左图所示。用肽14处理没有显著改变细胞数量，如图6的图c的右图所示。与未接受肽14的uvb处理的样品相比，uvb暴露促进了每个细胞核atrx聚集点的平均数量的显著升高，并且5μm肽14处理显著防止了细胞衰老，从而导致atrx聚集点/细胞核的显著减少(*p《0.01)(图6，图d)。
实施例7
149.将从健康老年供体分离的人原代成纤维细胞和角质形成细胞用于建立人类皮肤等效物。用0.01％w.v.肽14处理那些皮肤等效物5天，并使用衰老相关的β-半乳糖苷酶染色根据衰老水平对其进行表征，整体结构如表皮厚度所示。由盲法分析师进行基于几个参数的质量评估。观察到的参数包括细胞层的一般结构，以及角质层的厚度等其他方面，并且其显示出随着老化和衰老水平而减少。所述评估的最高分为28分，其中较高的得分与老化和衰老的减少相关。批量使用要求最低分为19。此得分在内部被验证，并显示出随着皮肤等效物或培养细胞的老化/衰老而减少。此外，通过逆转录-定量聚合酶链反应(rt-qpcr)根据特定基因的表达表征皮肤等效物。在处理后，对表皮和真皮分别进行rt-qpcr。对于表皮样品，分析了甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh；泛表达)；p16(与衰老相关)、il-8(与刺激有关)和ki-67(与细胞增殖相关)。对于真皮样品，分析了甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh；泛表达)；p16(与衰老相关)、il-8(与刺激有关)、ki-67(与细胞增殖相关)；透明质酸合酶2(has-2；与透明质酸产生相关)和基质金属蛋白酶1(mmp1；与细胞外基质蛋白降解相关)。使用2-δδct
方法分析ct值。将平均mrna表达归一化至gapdh(δct)并归一化至阴性对照组(δδct)。阴性对照仅接受制剂。用三个技术重复进行了三个独立的实验。使用t检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05(图7)
150.人类皮肤等效物的肽14处理促进了皮肤等效物得分的升高(肽14组24
±
1相比于19.0
±
2)，如图7的图a所示，表明了治疗安全性、耐受性和有益效果。这与可能具有安全性和耐受性问题的其他抗衰老剂形成对比。参见例如，tse等人,cancer res.68:3421(2008)；wilson等人,lancet oncol.11:1149(2010)。另外，治疗促进了衰老相关的β-半乳糖苷酶染色的显著减少(***p《0.001)，如图7的图a和图7的图b所示，证实了所述多肽的衰老治疗效果。此外，肽14处理导致表皮(****p《0.0001)和真皮(**p《0.01)中p16的显著减少；真皮中il-8的表达减少(*p《0.5)；和真皮中mmp-1的表达减少(**p《0.01)。所述数据证实了肽14的衰老治疗潜力、安全性和耐受性，以及所述多肽对皮肤基因表达的有益效果，如图7的图c所示。实施例8
151.为了阐明肽14和类似肽13的作用机制，研究了akt s473磷酸化(图8，图a)、衰老相关的β-半乳糖苷酶染色(图8，图b)以及mrna表达(图8，图c)。对于使用蛋白质印迹的akt s473磷酸化分析，使用人原代成纤维细胞和角质形成细胞。这些细胞用于建立人类皮肤等效物，将其保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境气液界面中。然后，用1μm的肽14或肽13处理皮肤等效物5天，并对皮肤等效物进行蛋白质分析。分离并定量蛋白质。将等量的蛋白质装载到聚丙烯酰胺凝胶中，并转移到硝酸纤维素膜中。gapdh(装载对照)和pakt s473抗体与膜一起孵育，并通过化学发光显示染色。比较经处理和未处理样品之间的相对pakt s473/gapdh信号。对于衰老相关的β-半乳糖苷酶染色实验，使用成纤维细胞。这些细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液(1,000u
·
ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)培养基中培养。细胞保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中。在扩增后，将这些细胞接种在96孔板中(每孔4,000个细胞)，并且与基础培养基一起孵育6小时以使细胞附着。之后，细胞暴露于0.05j/cm2米两次。随后立即进行第二次孵育，其中将肽14或肽13添加到培养基中并放置48小时，当更换培养基时，对细胞进行衰老相关
的b-半乳糖苷酶染色。未处理的细胞仅与载体一起孵育作为阴性对照(-)。在将未处理的对照衰老相关的b-半乳糖苷酶水平归一化至100％后获得相对染色。对于mrna分析，使用成纤维细胞。这些细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液(1,000u.ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)中培养。细胞保存在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中。在扩增后，将这些细胞接种在6孔板中(每孔50,000个细胞)，并且与基础培养基一起孵育6小时以使细胞附着。之后，细胞与肽14或肽13一起孵育48小时。阴性对照包括未处理的细胞，其仅接受载体。分离总rna，逆转录样品，并使用qpcr测定gapdh、去乙酰化酶6(sirt6)、blm和核酸外切酶1(exo1)基因的mrna表达。阴性对照仅接受载体。使用2-δδct
方法分析ct值。将平均mrna表达归一化至gapdh(δct)和阴性对照组(δδct)。对于所有分析，用三个技术重复进行了三个独立的实验。使用t检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05(图8)。
152.在用肽14处理的表皮和真皮样品两者中pakt s473均显著减少(分别为*p《0.05，和**p《0.01)。肽13仅在真皮样品中减少pakt s473(***p《0.001)(图8，图a)。对于uvb和衰老相关的b-半乳糖苷酶染色，观察到uvb暴露后染色一直增强。另外，在uvb暴露的样品中，肽14和肽13两者均减少了染色(***p《0.001)。肽14特异性地导致经处理的样品中的sirt6和blm表达升高(*p《0.05)(图8)。实施例9
153.将从健康老年供体分离的人原代成纤维细胞和角质形成细胞用于建立人类皮肤等效物。用0.01％w.v.的肽14处理这些皮肤等效物5天，并根据表皮厚度进行表征，其根据总表皮面积进行量化。阴性对照仅用制剂处理。示例性组织学图像显示在图9的图a中。用三个技术重复进行了三个独立的实验。使用t检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05(图9的图b)。
154.与未处理的对照相比，人类皮肤等效物的肽14处理促进了表皮厚度的增加(**p《0.01)，表明所述多肽对皮肤表皮的有益效果(图9)。实施例10
155.在水中测定了具有氨基酸序列etakhwlkgi(seq id no:1)和atakawlkgi(seq id no:2)的多肽的预测三维结构。结构预测显示在图10的图a(seq id no:1)和图10的图b(seq id no:2)中。这些结构被叠加(图10，图c)以说明所述结构的相似性。实施例11制备肽14的局部应用制剂，其包含烟酸、维生素e、至少一种防腐剂、至少一种乳化剂和50-150μm的肽14。将所述局部制剂应用至人类皮肤，导致皱纹外观的减少。实施例12
156.制备肽14的局部应用制剂，其包含烟酸、维生素e、至少一种防腐剂、至少一种乳化剂和75-100μm的肽14。将所述局部制剂应用至人类皮肤，导致皱纹外观的减少。实施例13
157.在下表4中示出示例性局部应用制剂。将所述局部制剂应用至人类皮肤，导致皱纹外观、肤色外观(不均匀性)、毛孔外观、纹理外观和光滑度、紧致度、弹性和整体外观中的至少一项减少。所述制剂中的多肽包含本文所公开多肽中的至少一种。
实施例14
158.在下表5中示出包含肽14的示例性局部应用制剂。将所述局部制剂应用至人类皮肤，导致皱纹外观、肤色外观(不均匀性)、毛孔外观、纹理和光滑度外观、紧致度、弹性和整体外观中的至少一项减少。所述制剂中的多肽包含肽14。肽14。实施例15.
159.在用肽14处理后，评估三维体外皮肤模型和离体人类皮肤样品的皮肤老化。
160.体外3d皮肤模型：使用基于pennacchi,p.c.等人glycated reconstructed human skin as a platform to study the pathogenesis of skin aging.tissue eng.a部分21,2417
–
2425,2015中所述制备方法的改进方法制备3d皮肤模型。简而言之，将包埋有成纤维细胞的i型胶原蛋白凝胶与正常人表皮角质形成细胞(nhek)一起接种在凝胶的顶部，并培养24小时，以使nhek达到单层。然后，将在顶部上具有nhek的凝胶升至气-液界面，并且再培养10天，以允许表皮角质化。通过向培养基中添加肽14，用12.5μm的肽14处理凝胶。
161.离体人类皮肤模型：从zenbio(research triangle，nc)获得来自健康人供体的皮肤样品，并将其维持在具有补充有10％(v/v)fbs的杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基(dmem)(invitrogen，carlsbad,ca)的气-液界面培养物中。在第一天和第三天，用对照载体或培养基中的12.5μm肽14处理皮肤样品。在五天后，收获样品并将其固定在福尔马林中用于组织学或用于dna分离。
162.dna甲基化分析：预测的生物学年龄，也称为分子dna年龄，由3d皮肤模型样品和离
体人类皮肤活检样品中的dna甲基化水平确定。按照制造商的说明，使用qiaamp dna mini试剂盒(qiagen)从样品中获得总dna样品。使用人illumina infinium epic 850k芯片进行dna甲基化评估，作为皮肤老化的标志。dna样品包括：i)四个皮肤活检样品(来自同一供体)，其被认为是未处理的对照，ii)用12μm肽14处理的四个皮肤活检样品(同一供体)，iii)三个3d皮肤样品(每个样品是来自1个供体的3个皮肤的池，总共3个供体)，其被认为是未处理的对照，iv)用12μm肽14处理的三个3d皮肤样品(每个样品是来自1个供体的3个皮肤的池，总共3个供体)。使用命令preprocessraw()，随后是preprocessswan()处理原始图像数据。然后，使用ratioconvert()将甲基化信号(m值)转换为比率，并且接着使用getbeta()转换为β值，所有功能均在“minfi”r包中实现。β值使用betaqn()方法进行归一化，该方法分位数归一化β，由“watermelon”包实现。并使用“minfi”r包中实现的“preprocessquantile”归一化方法进行归一化。归一化β值用于年龄估计。
163.统计分析：通过shapiro-wilk检验测试数据的正态分布。在比较超过2组的情况下，先进行单向anova，随后进行bonferroni多重比较检验。对于比较配对样品的情况，进行配对t检验。p≤0.05被认为具有统计学意义。使用graphpad prism(graphpad软件)或r软件进行统计分析。
164.结果：如图11a、11b和11c所示，在用肽14处理5天后，体外3d皮肤模型和离体人体皮肤样品显示皮肤老化减少。图11a示出了不用肽14(对照)和用12.5μm肽14培养5天的3d皮肤等效物(顶行)和离体皮肤活检样品(底行)的苏木精和曙红(h&e)染色的组织学图像。用肽14处理的3d皮肤等效物和离体皮肤样品通常显示出与未处理的对照样品相似或比对照样品更厚的表皮厚度。图11b示出了用12.5μm肽14(处理)处理的3d皮肤模型样品的预测年龄，也称为分子dna年龄，低于作为未处理对照(ctrl)的样品的预测年龄。未处理的3d皮肤模型的预测年龄的平均值为约80岁，而肽14处理的3d皮肤模型的预测年龄的平均值为约66岁(通过t检验，p＝0.25)。图11c示出了用12.5μm肽14处理的离体皮肤活检的预测年龄低于作为未处理对照(ctrl)的样品的预测年龄。离体皮肤活检样品的预测年龄的平均值为约71岁，而肽14处理的离体皮肤活检样品的预测年龄的平均值为约68岁(**p《0.01)。实施例16.
165.在脊椎动物中，称为黑色素细胞的特殊细胞通常产生黑色素。mewo细胞是一种人类永生化黑色素细胞系，其代表表达视黄酸受体的晚期分化黑色素细胞，并可以为黑色素生成的体外研究提供实验模型。关于使用mewo细胞作为体外黑色素生成模型的其他描述见于schadendorf等人,1994.retinoic acid receptor-gamma-selective retinoids exert antiproliferative effects on human-melanoma cell-growth in-vitro.international journal of oncology.doi:10.3892/ijo.5.6.1325和malaspina等人,depigmenting potential of lichen extracts evaluated by in vitro and in vivo tests.peerj 8:e9150 https://doi.org/10.7717/peerj.9150。
166.为了测试肽14是否促进黑色素细胞的色素减退，在5％co2、37℃和95％湿度下，在补充有10％v/v fbs和1％v/v青霉素/链霉素溶液(1,000u.ml-1
)的dmem中培养mewo细胞。在用实验条件之一处理前两周(预处理)，用异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)培养mewo细胞以刺激黑色素合成。在将mewo细胞以每孔1,000,000个细胞接种在6孔板中6小时后，在实验条件之一孵育细胞7天，并分析细胞内和上清液黑色素含量。
167.实验条件包括阳性对照组、阴性对照组、肽14(ibmx)7d组和视黄酸(ibmx)7d组。阴性对照组包括mewo细胞，其在铺板用于实验后，在预处理期间用25μm的ibmx刺激2周，然后持续7天未处理，仅接受载体。阳性对照组包括mewo细胞，其在整个实验过程中用25μm的ibmx孵育，在预处理期间持续2周以及在治疗期间持续7天。肽14(ibmx)7d组包括mewo细胞，其在预处理期间用25μm的ibmx孵育2周，然后用25μm的ibmx和3.12μm的肽14处理7天。视黄酸(ibmx)7d组包括mewo细胞，其在预处理期间用25μm的ibmx孵育2周，然后用25μm的ibmx和2μm的视黄酸处理7天。
168.在处理后，通过样品在492nm处的吸光度来评估细胞沉淀和细胞培养物上清液中的黑色素含量。通过胰蛋白酶消化制备细胞沉淀，计数并在200μl的1m naoh中孵育16小时(matsuda等人,2004；yoo等人,2007)。在1.2
×
g离心10分钟后获得细胞培养上清液。数据表示为相对黑色素含量，样品在特定波长(492nm)下的吸光度归一化至阴性对照样品也在相同波长下的吸光度。进行了包括三个技术重复的三个独立实验。当检测到统计学显著性时，使用anova和bonferroni事后检验分析数据。组之间的统计学上显著的p值对于p《0.05，用*注明；对于p《0.01，用**注明；对于p《0.001，用***注明；对于p《0.0001，用****注明。
169.与阳性对照、阴性对照和视黄酸处理组相比，肽14处理促进了细胞沉淀(如图12a所示)和细胞培养物上清液(如图12b所示)中相对黑色素含量的显著减少。在如图12a所示的细胞沉淀中，阳性对照的相对黑色素含量为阴性对照组的约170％倍(****p《0.0001)，并且视黄酸处理组的相对黑色素含量为阴性对照组的约125％(**p《0.01)，而肽14处理组的相对黑色素含量为阴性对照组的约90％(***p《0.001)或低于阴性对照组。在如图12b所示的细胞培养上清液中，阳性对照和视黄酸处理组具有与阴性对照组非常相似的相对黑色素含量，而肽14处理组具有为阴性对照组的约70％或低于阴性对照组的相对黑色素含量(*p《0.05)。
170.这表明肽14可以用于减少各种与黑色素生成相关的病况，包括但不限于黄褐斑、由皮肤炎症引起的皮肤色素沉着过度、激素变化、老化、日晒和慢性损伤。另外，肽14似乎比视黄酸表现更好，视黄酸目前被认为是抗老化护肤的黄金标准分子。实施例17.
171.皮肤可能经常会经历反弹性色素沉着过度，即在中断一次或多次美白治疗后，皮肤中重新形成色素沉着。为了测试在肽14治疗中断后肽14的色素减退作用是否仍然存在，在5％co2、37℃和95％湿度下，在补充有10％v/v fbs和1％v/v青霉素/链霉素溶液(1,000u.ml-1
)的dmem中培养mewo细胞。在用实验条件之一处理之前两周(预处理)，用异丁基甲基黄嘌呤(ibmx)培养mewo细胞以刺激黑色素合成。在将mewo细胞以每孔1,000,000个细胞接种在6孔板中6小时后，在实验条件之一下孵育将细胞14天，并分析细胞内和上清液黑色素含量。
172.实验条件包括阳性对照组、阴性对照组、肽14(ibmx)14天组、视黄酸(ibmx)14天组、第7天中断肽14(ibmx)组和第7天中断视黄酸(ibmx)组。阴性对照组包括mewo细胞，其在铺板用于实验后在预处理期间用25μm的ibmx刺激2周，然后持续14天未处理，仅接受载体。阳性对照组包括mewo细胞，其在整个实验过程中用25μm的ibmx孵育，在预处理期间持续2周并且在治疗期间持续14天。一些组用ibmx 25μm以及3.12μm的肽14两者处理7或14天，或用ibmx25μm以及视黄酸2μm两者处理(7或14天)。肽14(ibmx)14天组包括mewo细胞，其在预处
理期间用25μm的ibmx孵育2周，然后用25μm的ibmx和3.12μm的肽14处理14天。视黄酸(ibmx)14天组包括mewo细胞，其在预处理期间用25μm的ibmx孵育2周，然后用25μm的ibmx和2μm的视黄酸处理14天。肽14(ibmx)7天组包括mewo细胞，其在预处理期间用25μm的ibmx孵育2周，然后用25μm的ibmx和3.12μm的肽14处理仅7天，并且用仅25μm的ibmx再培养7天。视黄酸(ibmx)7天组包括mewo细胞，其在预处理期间用25μm的ibmx孵育2周，然后用25μm的ibmx和2μm的视黄酸处理仅7天，并且用仅25μm的ibmx培养额外的7天。
173.在处理后，通过样品在492nm处的吸光度来评估细胞沉淀和细胞培养物上清液中的黑色素含量。通过胰蛋白酶消化制备细胞沉淀，计数并在200μl的1m naoh中孵育16小时(matsuda等人,2004；yoo等人,2007)。在1.2
×
g离心10分钟后获得细胞培养上清液。数据表示为相对黑色素含量，样品在特定波长(492nm)下的吸光度归一化至样品中的细胞数量，阴性对照样品也在相同波长下的吸光度。由于细胞增殖在14天期间是显著的，因此仅在此实验中，黑色素含量数据被归一化至每组内样品中的细胞数量。进行了包括三个技术重复的三个独立实验。当检测到统计学显著性时，使用anova和bonferroni事后检验分析数据。组之间的统计学上显著的p值对于p《0.05，用*注明；对于p《0.01，用**注明；对于p《0.001，用***注明；对于p《0.0001，用****注明。
174.另外，分析了参与黑色素生成的关键基因(包括酪氨酸酶、黑色素细胞诱导转录因子(mitf)和多巴色素互变异构酶(dct))的mrna水平。
175.与阳性对照和视黄酸处理组相比，肽14处理促进了细胞沉淀(如图13a所示)和细胞培养物上清液(如图13b所示)中相对黑色素含量的显著减少。在如图13a所示的细胞沉淀中，阳性对照具有约130％的相对黑色素含量，并且视黄酸14天处理组具有约130％的相对黑色素含量，而肽14 14天处理组具有约90％或低于阴性对照组的相对黑色素含量。肽14 7天处理组具有约40％的相对黑色素含量，是实验组中最低的相对黑色素含量。视黄酸7天处理组具有约90％的相对黑色素含量。在如图13b所示的细胞培养上清液中，阳性对照具有约110％的相对黑色素含量，而视黄酸14天处理组和肽14 14天处理组具有约50％的相对黑色素含量。视黄酸7天处理组和肽14 7天处理组具有约100％的相对黑色素含量。
176.在图14a、14b和14c中示出黑色素生成相关基因的mrna水平。肽14处理似乎导致酪氨酸酶、mitf和dct基因的表达显著减少，其低于或至少类似于视黄酸处理组的mrna水平。如图14a所示，与其他实验组相比，肽14 14天处理组的酪氨酸酶的相对表达水平最低。如图14b所示，对于肽14 14天处理组和视黄酸14天处理组，mitf的相对表达水平最低。如图14c所示，与其他实验组相比，肽14 14天处理组和肽14 7天处理组的dct的相对表达水平最低。
177.这表明肽14可以减少黑色素生成，并在中断肽14治疗后继续导致黑色素生成减少。另外，肽14似乎比视黄酸表现更好，视黄酸目前被认为是抗老化护肤的黄金标准分子。实施例18.
178.为了测试肽13和肽14处理对人类皮肤模型和皮肤形态的影响，将从健康老年供体(71、84和90岁)分离的人原代成纤维细胞和角质形成细胞用于建立人类皮肤等效物。用0.01％w/v(或1μm)的肽13或肽14处理皮肤等效物5天。阴性对照仅用制剂处理。在培养5天后，分析皮肤等效物的表皮厚度，其根据总表皮面积进行定量。由盲法分析师进行基于几个参数的质量评估。观察到的参数包括细胞层的一般结构，以及角质层的厚度等其他方面，并且显示出随着老化和衰老水平而减少。所述评估的最高分为28分，其中较高的得分与老化
和衰老的减少相关。批量使用要求最低分为19。此得分在内部被验证，并显示出随着皮肤等效物或培养细胞的老化/衰老而减少。用三个技术重复进行了三个独立的实验。使用t检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05。组之间的统计学上显著的p值对于p《0.05，用*注明；对于p《0.01，用**注明；对于p《0.001，用***注明；对于p《0.0001，用****注明。
179.图15a示出了仅用载体(对照)、肽13或肽14处理的体外人类皮肤模型的h&e染色的组织学图像。用肽13或肽14处理的人类皮肤模型通常显示出与未处理的对照样品相似或增加的角质层厚度(如由图像顶部的暗灰色层或用h&e染成亮粉色所指示)和表皮层厚度(如图像中间的中灰色层或用h&e染成紫色所示)。图15b示出了仅用载体(对照)、肽14或肽13处理的人类皮肤模型的组织学得分的平均值，分别为21.00、23.83和23.44。用肽13或肽14处理的样品的组织学得分高于阴性对照的组织学得分。如通过表皮厚度和屏障所评估，用肽13或肽14处理皮肤样品似乎改善了皮肤形态。实施例19.
180.为了研究肽14通过皮肤深度的渗透水平，使用franz扩散池并在离体皮肤培养样品上进行扩散研究。将来自女性供体(79岁)腹部的新鲜人类皮肤切成约2.5cm x 2.5cm的小片。
181.在franz扩散池研究中，皮肤用10μl包含0.01％肽14的经配制乳膏处理，并置于接触面积为5mm直径(0.2cm2)的franz扩散池中。受体室具有2ml的ph 7.4的pbs。在搅拌下保持franz扩散池于32℃下24小时。
182.在离体皮肤培养研究中，用2μl包含0.01％肽14(总共200ng肽14)的经配制乳膏处理皮肤。然后将皮肤样品置于底部含有dmem培养基的气-液界面中，并在37℃保持24小时
183.在24小时后，用薄纸除去皮肤上的过量制剂，并在pbs中洗涤皮肤样品4次。还切除所有周围的皮肤。然后在60℃下孵育皮肤1-2分钟，以将表皮与真皮分离。收集受体室(2ml)、表皮层和真皮层中的pbs，并在-80℃下冷冻直至进一步分析。对真皮层进行肽14的质谱分析，以确定渗透进入真皮的肽14的量。
184.在franz扩散池研究中，在真皮层中发现了约1.37％至2.60％的应用的肽14。在离体皮肤培养研究中，在真皮层中发现了约1.94％至1.96％的应用的肽14。当将肽14局部应用至皮肤表面时，极少肽14至没有肽14渗透进入真皮。这表明在局部应用时，肽14实现了非常低至最低限度的真皮渗透。实施例20.
185.对人类对象进行了临床研究，以评估在面部上局部应用肽14的效果。这项研究得到了irb委员会的批准。22名人类对象参与了所述临床研究，并被要求使用两种产品，面部两侧各一种。在面部的右侧上，对象使用仅包含所述制剂的阴性对照。在面部的左侧上，对象使用包含0.01％肽14的治疗制剂。对象在开始使用产品之前(基线)以及在每日将所述制剂局部应用至面部各侧6周和12周之后接受评估。如下所详述，对皮肤含水量、经表皮水分损失(tewl)、真皮厚度和回声反射性、皮内分析、皮肤粘弹性和皮肤表面轮廓进行各种测量，以评估在面部皮肤上局部应用肽14对细纹/皱纹外观、肤色外观(均匀性)、毛孔外观、纹理/光滑度外观、紧致度(视觉)、弹性(触觉)和整体外观的影响。
186.临床专家分级。功效分级：在基线、第6周和第12周，使用10cm视觉模拟量表(vas)
在双侧面部上进行视觉和触觉评估。使用下面详述的仪器和方法评估以下参数：细纹/皱纹、肤色(颜色均匀性)、纹理/光滑度(视觉)、紧致度(视觉)、弹性(触觉)、皮肤毛孔、光泽/亮度和整体外观。
187.皮肤水分测定仪：将皮肤水分测定仪cm 825(courage khazaka，germany)用于通过测量皮肤电容来评估皮肤含水量/水合作用。在基线、第6周和第12周，在双侧面部上一式三份地进行测量并平均。将测试位点图用于确保每次访视时测量相同的位置。
188.蒸汽压力计：蒸汽压力计(delfin technologies ltd.，finland)用具有用于测量相对湿度和温度的传感器的封闭圆柱形腔室测量皮肤的经表皮水分损失(tewl)。tewl速率的变化提供了屏障破坏或完整性的量度，从而提供了肽14对皮肤完整性的影响的指示。在基线、第6周和第12周，所有对象在双侧面部上一式两份地进行蒸汽压力计测量并平均。评估位置被记录在每个对象的身体图上。
189.超声波-真皮扫描：dermascan c usb(cortex technology aps，hasund,denmark)是一款紧凑型高分辨率超声波扫描仪。在基线和第12周，所有对象在双侧面部上进行超声波评估。每次访视时评估的位置是相同的，并记录在面部图上。在获取超声扫描后，分析它们的真皮厚度(密度)和回声反射性。
190.siascope：cosmetrics
tm siascope(astron clinical,toft,uk)是一种使用分光光度皮内分析(sia)或发色团映射的非侵入性光学皮肤成像仪。在基线、第6周和第12周，在双侧面部上测量真皮胶原蛋白和血红蛋白。
191.蒸汽压力计：cutometer mpa 580(courage khazaka，germany)通过向皮肤表面施加吸力、将皮肤拉入探针的孔中并使用光学测量系统确定渗透深度来测量皮肤的粘弹性(紧致度和弹性)。在基线、第6周和第12周，在双侧面部上进行测量。在每个时间点测量相同的位置，并使用面部图记录。测量包括紧致度、弹性和净弹性。
192.visia-cr：使用visia-cr成像系统(canfield scientific,paramus,nj,usa)提供照片文档，所述系统在多种照明模式下拍摄高分辨率图像。在基线、第6周和第12周，在中心、右和左视图的标准1和平行偏振光下拍摄照片。
193.anteraantera(miravex，ireland)是一种结合了皮肤轮廓测定法、多光谱分析和比色法的仪器以提供皮肤表面的三维重建和随后的图像分析。在基线、第6周和第12周，对所有对象的左右鱼尾纹区域拍摄图像。在每个时间点测量相同的位置，并使用面部图记录。分析图像的纹理、宽度和深度细纹/皱纹。
194.专家临床分级
195.第6周和第12周与基线的比较
196.肽14制剂：在基线与随后时间点的用肽14处理的左侧面部的平均得分的比较揭示了对于细纹/皱纹外观、肤色(均匀性)、毛孔外观、纹理/光滑度、紧致度(视觉)、弹性(触觉)和整体外观，在第6周的临床分级中有统计学上显著的改善，其持续到第12周。另外，与用肽14处理的左侧面部的基线相比，在第12周，光泽/亮度的外观在统计学上显著改善。
197.对照制剂：在基线时与随后时间点的用阴性对照制剂处理的右侧面部的平均得分的比较揭示了对于细纹/皱纹外观、肤色(均匀性)、毛孔外观、纹理/光滑度、紧致度(视觉)、弹性(触觉)、光泽/亮度和整体外观，在第6周的临床分级中有统计学上显著的改善，其持续到第12周。
198.肽14处理与阴性对照的比较(面部的左侧相比于右侧)
199.肽14处理与阴性对照在处理时间上的比较
200.当与基线(治疗前)比较时，在一些测量中，用肽14处理的左侧面部似乎比用阴性对照处理的右侧面部更好。与用阴性对照处理的右侧面部相比，用肽14处理的左侧面部在第6周具有通过皮肤水分测定仪测量的较高水平的皮肤水合作用、通过siascope测量的较高水平的胶原蛋白水平，并且在第6周具有通过蒸汽压力计测量的更好的tewl(经上皮水分损失)改善。对于皮肤厚度(密度)和回声反射性的dermascan评估和整体皮肤外观的视觉评估，在用肽14处理的左侧面部和用阴性对照制剂处理的右侧面部之间没有观察到显著差异。在第12周，用肽14处理的左侧面部比用阴性对照制剂处理的右侧面部具有更好的纹理(粗糙度)的antera测量
201.分析了22名患者在使用含0.01％肽14的局部乳膏12周后的结果。图16示出了在基线时(左，基线)和治疗12周后(右，12周)，用肽14处理的左侧面部的实例。与基线时间点相比，用0.01％肽14处理12周似乎减少了细纹和皱纹外观，并改善了光滑度、肤色(均匀性)、纹理/光滑度和整体外观。
202.对盲法专家意见进行了分析，以确定显示改善的患者百分比和所有对象的平均百分比改善(mpi)，其中mpi表示与基线(治疗前)相比的平均百分比改善。分析发现，87％的患者被评估为具有减少的皮肤皱纹外观(mpi：3.3％)，90％被评估为具有改善的皮肤弹性(mpi：4.75％)，并且95.5％被评估为具有改善的皮肤均匀性(mpi：4.4％)、光泽(mpi：5.06％)、毛孔外观(mpi：4.58％)和紧致度(mpi：5.43％)。所有对象均被评估为呈现更好的皮肤纹理/光滑度(mpi：7.46％)和整体外观(mpi：6.17％)。
203.通过各种仪器评估对象的面部，以确定显示改善的患者百分比和所有对象的平均百分比改善(mpi)，其中mpi表示与基线(治疗前)相比的平均百分比改善。仪器评估发现，根据蒸汽压力计评估，81％的对象具有更好的皮肤屏障(mpi：14.19％)。根据antera评估，73％的对象呈现更好的皮肤粗糙度(mpi：5.05％)。根据visia评估，73％的对象呈现更好的皮肤光泽(mpi：16.63％)。
204.还评估了对象的感知。在对象感知的分析中，超过80％的对象认为包含肽14的制剂促进了更好的皮肤外观、更好的皮肤纹理、更好的皮肤紧致度和更好的水合作用。78％的对象注意到皮肤光泽的改善。实施例21.
205.将包含至少一种本文所公开多肽的局部制剂用于人类皮肤。所述制剂被指导在早上和晚上作为光滑层应用至面部和/或颈部的清洁干燥的皮肤上。所述制剂是被科学配制以改善皮肤弹性和加强表皮屏障从而使皮肤持久健康的每日必需的局部补充剂。实施例22.
206.使用者将本文所述的包含至少一种多肽的局部制剂应用至面部和/或颈部。使用者还在应用局部制剂后应用另一种包含uv阻断剂的局部制剂。实施例23.
207.使用者将本文所述的包含至少一种多肽的局部制剂和uv阻断剂应用至面部或颈部。所述局部制剂可以应用至所述使用者身体的皮肤。实施例24.
208.用1μm肽14或肽13或20μm视黄酸(ra)处理用来自年长供体(71、84或90岁)的细胞建立的样品的3d皮肤等效切片，并评估衰老、老化和健康的各种标志的各种处理的效果。
209.图17示出了用对照、肽14、肽13或视黄酸处理的3d皮肤等效物的表皮(epi)层和真皮(der)层的p16、blimp1、zyg11b、il-8、ki-67、zic1、mmp1、has2的相对mrna表达水平。数据表示为归一化至gapdh和未处理对照的2-ddct。*p《0.05。肽13和肽14处理的样品通常在表皮层中具有p16、blimp1、zyg11b、il-8和ki-67的相似相对mrna表达水平以及在真皮层中具有p16、mmp1、has2、il-8和ki-67的相似相对mrna表达水平。与ra处理的样品相比，肽13和肽14处理的样品通常在表皮层中具有p16、blimp1、zyg11b、il-8的较低相对mrna表达水平以及在真皮层中具有p16、mmp1、il-8和ki-67的较低相对mrna表达水平。与ra处理的样品相比，肽13和肽14处理的样品通常在表皮层中具有ki-67的较高相对mrna表达水平以及在真皮层具有has2的较高相对mrna表达水平。肽13和肽14处理的样品具有与ra处理的样品相似的真皮层的zic1和ki-67的相对mrna表达水平。实施例25.
210.衰老治疗策略可能与体内健康寿命和寿命延长相关联。为了评估肽14是否促进健康寿命和寿命的延长，使用了秀丽隐杆线虫蠕虫。将1μm或2μm的不同浓度的肽14添加到蠕虫培养基(m9缓冲液培养基)中。阴性对照蠕虫仅接受载体。评估了两个健康寿命参数：i)咽部泵动和ii)蠕虫运动。还确定了寿命。对于咽部泵动分析，每日观察15只蠕虫的咽部运动(泵动)，并计数20秒。在不同的日期采用不同的动物群体，由2个不同的盲法观察者重复此实验3次。通过由单向anova和dunnet事后检验分析每个单独时间点来检测统计差异。对所有组与h2o组进行比较。对于蠕虫运动分析，每日测量15只蠕虫的秀丽隐杆线虫的基本运动，也称为抖动。观察持续时间为30秒。在不同的日期采用不同的蠕虫群体，由2个不同的盲法观察者重复所述实验3次。通过由单向anova和dunnet事后检验分析每个单独时间点来检测统计差异，并对所有组与h2o组进行比较。对于寿命分析，每日观察15只蠕虫的寿命，直到最后一只蠕虫死亡。在不同的日期采用不同的蠕虫群体，由2个不同的盲法观察者重复此实验3次。测量了平均寿命。通过由单向anova和dunnet事后检验分析每个单独时间点来检测统计差异，并对所有组与h2o组进行比较(图18)。
211.用1μm或2μm的肽14处理改善了蠕虫的抖动(图18，图a)、泵动(图18，图b)和寿命(图18，图c)。虽然抖动在第1天显著改善(*p《0.05)，但在这一天泵动显著减少(*p《0.5)。综上所述，所述数据表明了所测试的肽在促进健康寿命和寿命方面的安全性和有效性。例如，在第8天，与对照相比，在用肽14处理的组中，抖动(*p《0.05)和泵动(*p《0.05)两者都增加了。随着年龄的增长，秀丽隐杆线虫的泵动减弱，这主要是肌肉完整性丧失的结果。即使没有直接测量，当与h2o对照组相比时，在1μm肽14组中，秀丽隐杆线虫咽部的宏观解剖学缺陷(弯曲或肿胀的咽部，这两者是这种线虫老化的共同特征)也减少了。在任何时间点或样品中都没有检测到蠕虫运动的减少，这表明测试的浓度的所述肽对秀丽隐杆线虫没有毒性。当以1μm和2μm使用时，肽14促进了蠕虫平均寿命的统计学上显著的增加(1μm肽14**p《0.01；2μm肽14*p《0.05)。实施例26.
212.由于高水平的细胞衰老，来自早衰症患者的皮肤细胞被用作老化模型。来自早衰症患者的原代成纤维细胞在补充有10％v.v.胎牛血清(fbs)和1％v.v.青霉素/链霉素溶液
(1,000u.ml-1)的dmem(杜尔贝科氏改良伊格尔氏培养基)中培养。细胞在5％co2、37℃和95％湿度的大气环境中培养。在扩增后，将细胞接种在96孔板中(每孔4,000个细胞)，并且在铺板后6小时，与500nm、5μm或50μm的多肽序列lkgil(seq id no:6)或wlkgi(seq id no:7)一起孵育。阴性对照包括未处理的细胞，其仅接受载体。在孵育后，分析相对细胞衰老，其通过相对于未处理对照的衰老相关的β-半乳糖苷酶染色活性和atrx聚集点/细胞核的定量来评估。进行了三个独立的实验(生物重复)，包括三个技术重复。使用anova和bonferroni事后检验分析数据。统计显著性被确定为p值等于或低于0.05，其中*p《0.05且**p《0.01。图19示出了多肽序列lkgil(seq id no:6)(a、b、c)和wlkgi(seq id no:7)(d、e、f)减少细胞衰老且不促进细胞死亡的效果。在图a和d中，y轴表示归一化至未处理对照的相对衰老水平。在图b和d中，y轴表示归一化至未处理对照的相对细胞数量。在图c和f中，y轴表示每个细胞的平均atrx聚集点积累。与未处理的细胞相比，当以5μm和50μm使用时，用lkgil(seq id no:6)处理细胞显著减少了衰老相关的β-半乳糖苷酶染色和atrx聚集点/细胞核的平均数量(对于β-半乳糖苷酶染色，p《0.01，对于atrx聚集点/细胞核，p《0.05)。与未处理的细胞相比，当以5μm和50μm使用时，用wlkgi(seq id no:7)处理细胞降低了衰老相关的β-半乳糖苷酶染色水平(对于5μm，p《0.05，对于50μm，p《0.01)。在测试浓度未观察到细胞毒性。实施例27.
213.测试了另外的多肽作为抗衰老剂的适用性。细胞与所述多肽之一一起孵育。阴性对照包括未处理的细胞，其仅接受载体。在孵育后，分析相对于阴性对照的相对细胞衰老(通过相对于阴性对照的衰老相关的β-半乳糖苷酶染色活性来评估)和相对细胞增殖。许多多肽显示出低于1的相对细胞衰老，与未处理的阴性对照相比具有减少的细胞衰老，并维持细胞增殖处于或高于未处理的阴性对照的细胞增殖。在表6中示出此类多肽的实例。
214.此外，研究了表6的多肽对细胞衰老的剂量依赖性影响。细胞与范围为1.26μm至50μm(1.26μm、3.12μm、6.25μm、12.5μm、25μm、50μm)的不同剂量的多肽一起孵育。甚至在较低剂量的多肽，细胞衰老也有明显的减少。
215.虽然本文中已示出并描述本发明的优选实施方案，但是对本领域技术人员而言显而易见的是，此类实施方案仅通过实例的方式被提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将会想到众多变化、改变和替代。应当理解的是，本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明。意图是以下权利要求限定本发明的范围，并且因此覆盖这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构。示例性实施方案
19中任一项所述的组合物，其中用所述组合物治疗皮肤减少了或治疗所述皮肤上的老化作用。实施方案21.如实施方案1-20中任一项所述的组合物，其中用所述组合物治疗皮肤减少了所述皮肤上的细胞衰老作用。实施方案22.如实施方案20-21中任一项所述的组合物，其中通过以下中的至少一种来评估老化作用：衰老相关的β-半乳糖苷酶活性水平、atrx聚集点/细胞的比率、p16表达、il-8表达、ki-67表达、透明质酸合酶2表达、基质金属蛋白酶1(mmp1)表达、去乙酰化酶6(sirt6)表达、blm表达或核酸外切酶1(exo1)表达。
218.实施方案23包括分离的、合成的或重组的多肽，其包含x1x2x3x4x5x6x7x8x9x
10
的氨基酸序列或其类似物，其中：(a)所述氨基酸序列与第一序列seq id no:1具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性，其中x1是e，x2是t，x4是k，x6是w，x7是l，x9是g，并且x
10
是i；和(i)x3不是s；或(ii)如果x5是任何氨基酸，则x8不是g；或(iii)如果x8是任何氨基酸，则x5不是n；或(iv)(i)、(ii)或(iii)中的任一种，任选地具有1、2、3或4个保守氨基酸取代；或(b)所述氨基酸序列与第二序列seq id no:2具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性，其中x1是a，x2是t，x3是a，x4是k，x5是a，x6是w，x7是l，x8是k，x9是g，并且x
10
是i，任选地具有1、2、3或4个保守氨基酸取代；或(c)所述氨基酸序列与第三序列seq id no:3具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性，其中x1是k，x2是l，x5是i，x6是l，x8是g并且x
10
是a；和(i)如果x9是任何氨基酸，则x3不是n；或(ii)如果x3是任何氨基酸，则x9不是s；或(iii)如果x4是任何氨基酸，则x7不是l；或(iv)如果x7是任何氨基酸，则x4不是s，和；或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的任一种，任选地具有1、2、3或4个保守氨基酸取代；或(d)所述氨基酸序列与第四序列seq id no:4具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性，其中x1是w，x2是l，x3是k，x4是g，x5是i，x6是l，x7是r，x8是e，x9是a并且x
10
是a，任选地具有1、2、3或4个保守氨基酸取代。实施方案24.如实施方案23所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含lkgi(seq id no:5)。实施方案25.如实施方案23或实施方案24所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含wlkgi(seq id no:7)。实施方案26.如实施方案23-25中任一项所述的多肽，其中所述氨基酸序列包含lkgil(seq id no:6)。实施方案27.如实施方案23所述的多肽，其中所述氨基酸序列与seq id no:1的序列具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性。实施方案28.如实施方案23所述的多肽，其中所述氨基酸序列是seq id no:1。实施方案29.如实施方案23所述的多肽，其中所述氨基酸序列是seq id no:2。实施方案30.如实施方案23所述的多肽，其中所述氨基酸序列与seq id no:3的序列具有至少70％、80％、85％、90％或95％的同一性。实施方案31.如实施方案23所述的多肽，其中所述氨基酸序列与seq id no:3的序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性。实施方案32.如实施方案23所述的多肽，其中所述氨基酸序列是seq id no:3。实施方案33.如实施方案23所述的多肽，其中所述氨基酸序列是seq id no:4。实施方案34.如实施方案23-33中任一项所述的多肽，其中所述重组的多肽包含至少10个氨基酸、15个氨基酸或20个氨基酸且不超过100个氨基酸。实施方案35包括用于治疗皮肤的组合物，其包含如实施方案23-34中任一项所述的至少一种分离的、合成的或重组的多肽以及治疗、营养或化妆品用的赋形剂。实施方案36.如实施方案35所述的组合物，其中所述赋形剂被配置用于局部应用。实施方案37.如实施方案35或实施方案36所述的组合物，其中所述组合物被配制用于人类皮肤。实施方案38.如实施方案35-37中任一项所述的组合物，其中所述组合物是乳膏、软膏、凝胶、液体、油、粉末、爽肤水、精华素、乳液、保湿剂、泡沫、面膜、摩丝、气雾剂、喷雾剂、清洁剂、化妆水、局部贴剂或洗发剂。实施方案39.
如实施方案35所述的组合物，其中所述组合物被配置为可食用补充剂。实施方案40.如实施方案39所述的组合物，其中所述组合物被配置为饮料。
219.实施方案41.如实施方案35-40中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种选自以下的皮肤保湿剂：甘油、角鲨烯、山梨醇、透明质酸、透明质酸衍生物、透明质酸钠、透明质酸钠交联聚合物、烟酰胺、糖蛋白、吡咯烷酮羧酸(pca)、赖氨酸hcl、尿囊素和藻类提取物。实施方案42.如实施方案35-40中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种选自以下的润肤剂：植物油、矿物油、乳木果油、可可脂、凡士林、脂肪酸、甘油三酯、苯甲酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、糖脂、磷脂、角鲨烯、甘油、神经酰胺和藻类提取物。实施方案43.如实施方案42所述的组合物，其中所述植物油选自玫瑰果油、酸渣树油、葡萄籽油、鳄梨油、李子籽油、巴卡斯果油、云杉光皮树油、杏仁油和摩洛哥坚果油。实施方案44.如实施方案35-43中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少一种选自以下的维生素：维生素a、维生素d、维生素e、维生素f、维生素k、维生素b1(硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酸)、维生素b5(泛酸)、维生素b7(生物素)、维生素b6、维生素b12(氰钴胺素)、维生素b9、叶酸、烟酰胺或其衍生物。实施方案45.如实施方案35-44中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约500nm至约500μm的有效量所述分离的、合成的或重组的多肽。实施方案46.如实施方案35-44中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约0.001％至约5％(w/w)的有效量所述分离的、合成的或重组的多肽。实施方案47.如实施方案35-44中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约0.001％至约1％的有效量所述分离的、合成的或重组的多肽。实施方案48.如实施方案35-47中任一项所述的组合物，其中与使用所述组合物之前相比，在皮肤上使用所述组合物之后，所述组合物改善了使用者皮肤的皮肤含水量、经表皮水分损失(tewl)、真皮厚度和回声反射性、皮内分析、皮肤粘弹性或皮肤表面轮廓中的至少一项。实施方案49.如实施方案35-47中任一项所述的组合物，其中与使用所述组合物之前相比，在皮肤上使用所述组合物之后，所述组合物减少了使用者皮肤的细纹/皱纹外观、肤色外观(均匀性)、毛孔外观、纹理/光滑度外观、紧致度(视觉)、弹性(触觉)、表皮屏障、皮肤粗糙度、皮肤色素沉着过度或整体外观。实施方案50.如实施方案35-49中任一项所述的组合物，其中用所述组合物治疗皮肤减少了或治疗所述皮肤上的老化作用。实施方案51.如实施方案35-50中任一项所述的组合物，其中用所述组合物治疗皮肤减少了所述皮肤上的细胞衰老作用。实施方案52.如实施方案50-51中任一项所述的组合物，其中通过以下中的至少一种来评估老化作用：衰老相关的b-半乳糖苷酶活性水平、atrx聚集点/细胞的比率、p16表达、il-8表达、ki-67表达、透明质酸合酶2表达、基质金属蛋白酶1(mmp1)表达、去乙酰化酶6(sirt6)表达、blm表达或核酸外切酶1(exo1)表达。
220.实施方案53包括在有需要的对象中治疗病况的方法，所述方法包括向所述对象施用包含seq id no:5的氨基酸序列的组合物。实施方案54.如实施方案53所述的方法，其中所述制剂包含seq id no:6的氨基酸序列。实施方案55.如实施方案53或实施方案54所述的方法，其中所述组合物包含seq id no:7的氨基酸序列。实施方案56.如实施方案53-55中任一项所述的方法，其中所述施用包括向所述对象局部应用所述组合物。实施方案57.如实施方案53-56中任一项所述的方法，其中所述对象是人或其他动物。实施方案58.如实施方案53-57中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述对象施用有效量的所述组合物。实施方案59.如实施方案53-58中任一项所述的方法，其中所述病况是所述对象中与衰老细胞积
累相关的病症。实施方案60.如实施方案53所述的方法，其中与衰老细胞积累相关的所述病症包括老化皮肤。实施方案61.如实施方案53-60中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少一种选自以下的皮肤保湿剂：甘油、角鲨烯、山梨醇、透明质酸、透明质酸衍生物、透明质酸钠、透明质酸钠交联聚合物、烟酰胺、糖蛋白、吡咯烷酮羧酸(pca)、赖氨酸hcl、尿囊素和藻类提取物。实施方案62.如实施方案53-61中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少一种选自以下的润肤剂：植物油、矿物油、乳木果油、可可脂、凡士林、脂肪酸、甘油三酯、苯甲酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、糖脂、磷脂、角鲨烯、甘油、神经酰胺和藻类提取物。实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述植物油选自玫瑰果油、酸渣树油、葡萄籽油、鳄梨油、李子籽油、巴卡斯果油、云杉光皮树油、杏仁油和摩洛哥坚果油。实施方案64.如实施方案53-63中任一项所述的方法，其中所述组合物包含至少一种选自以下的维生素：维生素a、维生素d、维生素e、维生素f、维生素k、维生素b1(硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酸)、维生素b5(泛酸)、维生素b7(生物素)、维生素b6、维生素b12(氰钴胺素)、维生素b9、叶酸、烟酰胺或其衍生物。实施方案65.如实施方案53-64中任一项所述的方法，其中所述组合物包含约500nm至约500μm的有效量所述分离的、合成的或重组的多肽。实施方案66.如实施方案53-64中任一项所述的方法，其中所述组合物包含约0.001％至约5％(w/w)的有效量的所述分离的、合成的或重组的多肽。实施方案67.如实施方案53-66中任一项所述的方法，其中所述组合物被配制成实现不超过10％的所述分离的、合成的或重组的多肽进入真皮的低真皮渗透。实施方案68.如实施方案53-67中任一项所述的方法，其中与使用所述组合物之前相比，在皮肤上使用所述组合物之后，所述组合物改善了使用者皮肤的皮肤含水量、经表皮水分损失(tewl)、真皮厚度和回声反射性、皮内分析、皮肤粘弹性或皮肤表面轮廓中的至少一项。实施方案69.如实施方案53-68中任一项所述的方法，其中与使用所述组合物之前相比，在皮肤上使用所述组合物之后，所述组合物减少了使用者皮肤的细纹/皱纹外观、肤色外观(均匀性)、毛孔外观、纹理/光滑度外观、紧致度(视觉)、弹性(触觉)、表皮屏障、皮肤粗糙度、皮肤色素沉着过度或整体外观。实施方案70.如实施方案53-69中任一项所述的方法，其中用所述组合物治疗皮肤减少了或治疗所述皮肤上的老化作用。实施方案71.如实施方案53-70中任一项所述的方法，其中用所述组合物治疗皮肤减少了所述皮肤上的细胞衰老作用。实施方案72.如实施方案70-71中任一项所述的方法，其中通过以下中的至少一种来评估老化作用：衰老相关的b-半乳糖苷酶活性水平、atrx聚集点/细胞的比率、p16表达、il-8表达、ki-67表达、透明质酸合酶2表达、基质金属蛋白酶1(mmp1)表达、去乙酰化酶6(sirt6)表达、blm表达或核酸外切酶1(exo1)表达。
221.实施方案73.一种在有需要的对象中减少细胞衰老的方法，所述方法包括向所述对象施用包含多肽的组合物，所述多肽包含任选地具有1个保守氨基酸取代的lkgi(seq id no:5)的氨基酸序列，其中所述多肽包含不超过100个氨基酸。实施方案74.如实施方案73所述的方法，其中所述多肽包含至少4个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸或20个氨基酸。实施方案75.如实施方案73所述的方法，其中所述组合物包含任选地具有1个保守氨基酸取代的wlkgi(seq id no:7)的氨基酸序列。实施方案76.如实施方案73所述的方法，其中所述组合物包含任选地具有1个保守氨基酸取代的lkgil(seq id no:6)的氨基酸序列。实施方案77.如实施方案75或实施方案76所述的方法，其中所述多肽包含至少5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸或20个氨基酸，并且包含不超过100个氨基酸。实施方案78.如实施方案73-77中
任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包含治疗、营养或化妆品用的赋形剂。实施方案79.一种在有需要的对象中减少细胞衰老的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗、营养或化妆品用组合物，所述组合物包含至少一种如实施方案23-34中任一项所述的多肽。实施方案80.如实施方案79所述的方法，其中所述组合物进一步包含治疗、营养或化妆品用的赋形剂。实施方案81.如实施方案79或实施方案80所述的方法，其中所述施用包括将所述组合物应用至所述对象的一部分皮肤。实施方案82.如实施方案79-81中任一项所述的方法，其中所述组合物延长对象多个细胞的寿命、诱导对象的多个细胞中的sirt6表达、提高对象的多个细胞中的细胞更新速率、促进对象的多个细胞中的细胞凋亡、促进对象的多个细胞中的dna修复、提高对象的多个细胞中的胶原蛋白产生、提高对象的多个细胞中的透明质酸合酶产生、减少对象的多个细胞中的atrx核聚集点积累、减少对象的多个细胞中的p16表达、减少对象的多个细胞中的衰老相关的β-半乳糖苷酶产生、减少对象的多个细胞中的il8表达、减少对象的多个细胞中的mmp1表达、提高对象的多个细胞中的blm表达，和/或防止对象的多个细胞中的uv诱导的dna损伤。
222.实施方案83包括在有需要的对象中治疗病况的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗、营养或化妆品用组合物，所述组合物包含任选地具有1个保守氨基酸取代的seq id no:5的氨基酸序列。实施方案84.如实施方案83所述的方法，其中所述治疗、营养或化妆品用组合物包含任选地具有1个保守氨基酸取代的seq id no:6的氨基酸序列。实施方案85.如实施方案83或实施方案84所述的方法，其中所述治疗、营养或化妆品用组合物包含任选地具有1个保守氨基酸取代的seq id no:7的氨基酸序列。