一种骨髓间充质干细胞复苏液及复苏方法与流程

1.本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞复苏液及复苏方法。


背景技术：

2.间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。间充质干细胞存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等），具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞（如成骨、成软骨及成脂肪细胞等）或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能，细胞模型被应用于增殖、移植和分化研究，以及体外的免疫反应的鉴定。
3.骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨骼中的造血干细胞不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子来支持造血。
4.在实际应用过程中，常常需要对骨髓间充质干细胞进行冻存，并在需要时对冻存的细胞进行复苏。冻存时需要用到冷冻保护剂。细胞复苏是指将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，细胞恢复生长的过程。将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，细胞融化后要尽快(约1-5min)移出37℃水浴。37℃水浴时间延长会提高细胞死亡率，复苏过程中一般细胞死亡率在20%～25%之间。
5.细胞复苏过程中造成细胞死亡的主要因素有：细胞复苏过程中容易受热不均匀，发生二次结晶的现象，对细胞的损伤较大；冻存保护剂的某些组份对细胞有毒性，尤其是在复苏过程中，温度升高，对细胞的毒性也增强。例如，本领域通常所采用的冷冻保护剂是由10%dmso、10%胎牛血清以及80%基础培养基组成。但由于dmso对细胞有一定的毒性，尤其是在复苏过程中，dmso会对细胞造成损害，进而使得复苏后的细胞存活率低。


技术实现要素：

6.本发明提供一种骨髓间充质干细胞复苏液，该骨髓间充质干细胞复苏液可显著减少复苏过程中二次结晶的形成，减少冻存液中dmso对细胞的毒性，有助于提高复苏后的细胞存活率，以解决上述技术问题。
7.本发明还提供了一种骨髓间充质干细胞的复苏方法，该复苏方法可缩短冻存细胞融化所需时间，提高细胞复苏的存活率。
8.本发明的骨髓间充质干细胞复苏液采用如下技术方案：一种骨髓间充质干细胞复苏液，所述复苏液的组分包括甘油、pbs缓冲液、人血白蛋白、透明质酸、sod、迷迭香精油、绿萝花提取物、亚油酸、燕麦蒽酰胺和葡萄糖酸锌。
9.作为进一步优选的技术方案，所述甘油的体积浓度为60-80%，所述pbs缓冲液的体积浓度为10-30%，所述人血白蛋白的质量浓度为5-10%，所述透明质酸的质量浓度为0.05-0.1%，所述sod的浓度为0.05-0.2μg/ml，所述迷迭香精油的体积浓度为0.1-3%，所
述绿萝花提取物的用量为1-10μg/ml，所述亚油酸的体积浓度为5-10%，所述燕麦蒽酰胺的质量浓度为0.05-0.1%，所述葡萄糖酸锌的浓度为1-10μg/ml。
10.作为进一步优选的技术方案，所述甘油的体积浓度为70%，所述pbs缓冲液的体积浓度为20%，所述人血白蛋白的质量浓度为8%,所述透明质酸的质量浓度为0.08%，所述sod的浓度为0.1μg/ml，所述迷迭香精油的体积浓度为1.5%，所述绿萝花提取物的用量为5μg/ml，所述亚油酸的体积浓度为8.5%，所述燕麦蒽酰胺的质量浓度为0.08%，所述葡萄糖酸锌的浓度为6μg/ml。
11.作为进一步优选的技术方案，所述绿萝花提取物按照下述方法制备得到：采用乙醇溶液对绿萝花进行提取，得到提取液，除去所述提取液中的溶剂即得所述绿萝花提取物。
12.作为进一步优选的技术方案，所述乙醇溶液的体积分数为60%-80%，所述提取的为70-85℃；对所述提取液进行减压蒸馏至得到相对密度为1.25-1.35的膏状物，再经干燥处理即得所述绿萝花提取物。
13.本发明的骨髓间充质干细胞的复苏方法采用如下技术方案：一种骨髓间充质干细胞的复苏方法，采用如上所述中任意一项所述的骨髓间充质干细胞的复苏液进行复苏。
14.作为进一步优选的技术方案，包括下述步骤：（1）将所述骨髓间充质干细胞复苏液预热至37℃；（2）向从液氮中取出的冻存管中加入预热后的所述骨髓间充质干细胞复苏液；（3）将冻存管置于37℃水浴中超声处理45-55s。
15.作为进一步优选的技术方案，所述超声处理时超声波的频率为20-50khz。
16.本发明的有益效果是：本发明的骨髓间充质干细胞复苏液中的绿萝花提取物可起到很好的减少冻存液中dmso对细胞损伤的作用，提高细胞复苏后的存活率。燕麦蒽酰胺和葡萄糖酸锌有助于减少细胞复苏过程中二次结晶的形成，减少二次结晶对细胞的损伤并可缩短细胞复苏所需的时间，进一步减少复苏过程过长对细胞造成的损伤。
17.本发明的骨髓间充质干细胞的复苏方法——通过向冻存细胞中加入本发明的细胞复苏液后再进行细胞的复苏，有助于冻存细胞与复苏液的均匀接触，减少复苏过程中升温不均匀的情况发生。
18.采用本发明的骨髓间充质干细胞复苏方法进行细胞的复苏，45-55s即可实现冻存细胞的完全融化，细胞复苏的时间更短且复苏后细胞存活率高。
具体实施方式
19.下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
20.实施例1骨髓间充质干细胞复苏液包括：甘油、柠檬酸钠缓存液、人血白蛋白、透明质酸、sod、迷迭香精油、绿萝花提取物和亚油酸。其中，甘油的体积浓度为70%，所述pbs缓冲液的体积浓度为20%，所述人血白蛋白的质量浓度为8%,所述透明质酸的质量浓度为0.08%，所述sod的浓度为0.1μg/ml，所述迷迭香精油的体积浓度为1.5%，所述绿萝花提取物的用量为5μg/ml，
所述亚油酸的体积浓度为8.5%，燕麦蒽酰胺的质量浓度为0.08%，所述葡萄糖酸锌的浓度为6μg/ml。
21.将其用于从液氮中取出的冻存的骨髓间充质干细胞（冷冻保存剂为10%dmso、10%胎牛血清以及80%基础培养基）的复苏，具体复苏方法为：将上述骨髓间充质干细胞复苏液预热至37℃备用；向冻存管中加入上述骨髓间充质干细胞复苏液，以不超过冻存管总体积的80%为宜；将盛有上述骨髓间充质干细胞复苏液的冻存管置于超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的环境下进行复苏；细胞完全融化所需时间为45s；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
22.实施例2骨髓间充质干细胞复苏液包括：甘油、柠檬酸钠缓存液、人血白蛋白、透明质酸、sod、迷迭香精油、绿萝花提取物和亚油酸。其中，甘油的体积浓度为60%，所述pbs缓冲液的体积浓度为27%，所述人血白蛋白的质量浓度为5%,所述透明质酸的质量浓度为0.1%，所述sod的浓度为0.15μg/ml，所述迷迭香精油的体积浓度为3%，所述绿萝花提取物的用量为1μg/ml，所述亚油酸的体积浓度为10%，燕麦蒽酰胺的质量浓度为0.1%，所述葡萄糖酸锌的浓度为1μg/ml。
23.将其用于从液氮中取出的冻存的骨髓间充质干细胞（冷冻保存剂为10%dmso、10%胎牛血清以及80%基础培养基）的复苏，具体复苏方法为：将上述骨髓间充质干细胞复苏液预热至37℃备用；向冻存管中加入上述骨髓间充质干细胞复苏液，以不超过冻存管总体积的80%为宜；将盛有上述骨髓间充质干细胞复苏液的冻存管置于超声（超声波频率30khz）、 37℃水浴的环境下进行复苏；细胞完全融化所需时间为48s；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
24.实施例3骨髓间充质干细胞复苏液包括：甘油、柠檬酸钠缓存液、人血白蛋白、透明质酸、sod、迷迭香精油、绿萝花提取物和亚油酸。其中，甘油的体积浓度为80%，所述pbs缓冲液的体积浓度为10%，所述人血白蛋白的质量浓度为10%,所述透明质酸的质量浓度为0.05%，所述sod的浓度为0.05μg/ml，所述迷迭香精油的体积浓度为0.1%，所述绿萝花提取物的用量为10μg/ml，所述亚油酸的体积浓度为9.9%，燕麦蒽酰胺的质量浓度为0.08%，所述葡萄糖酸锌的浓度为10μg/ml。
25.将其用于从液氮中取出的冻存的骨髓间充质干细胞（冷冻保存剂为10%dmso、10%胎牛血清以及80%基础培养基）的复苏，具体复苏方法为：将上述骨髓间充质干细胞复苏液预热至37℃备用；向冻存管中加入上述骨髓间充质干细胞复苏液，以不超过冻存管总体积的80%为宜；将盛有上述骨髓间充质干细胞复苏液的冻存管置于超声（超声波频率40khz）、 37℃水浴的环境下进行复苏；细胞完全融化所需时间为45s；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
26.实施例4骨髓间充质干细胞复苏液包括：甘油、柠檬酸钠缓存液、人血白蛋白、透明质酸、sod、迷迭香精油、绿萝花提取物和亚油酸。其中，甘油的体积浓度为70%，所述pbs缓冲液的体积浓度为20%，所述人血白蛋白的质量浓度为6%,所述透明质酸的质量浓度为0.09%，所述sod的浓度为0.2μg/ml，所述迷迭香精油的体积浓度为3%，所述绿萝花提取物的用量为6μg/ml，所
述亚油酸的体积浓度为7%，燕麦蒽酰胺的质量浓度为0.05%，所述葡萄糖酸锌的浓度为8μg/ml。
27.将其用于从液氮中取出的冻存的骨髓间充质干细胞（冷冻保存剂为10%dmso、10%胎牛血清以及80%基础培养基）的复苏，具体复苏方法为：将上述骨髓间充质干细胞复苏液预热至37℃备用；向冻存管中加入上述骨髓间充质干细胞复苏液，以不超过冻存管总体积的80%为宜；将盛有上述骨髓间充质干细胞复苏液的冻存管置于超声（超声波频率50khz）、 37℃水浴的环境下进行复苏；细胞完全融化所需时间为50s；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
28.实施例5骨髓间充质干细胞复苏液包括：甘油、柠檬酸钠缓存液、人血白蛋白、透明质酸、sod、迷迭香精油、绿萝花提取物和亚油酸。其中，甘油的体积浓度为65%，所述pbs缓冲液的体积浓度为25%，所述人血白蛋白的质量浓度为7%,所述透明质酸的质量浓度为0.06%，所述sod的浓度为0.1μg/ml，所述迷迭香精油的体积浓度为2%，所述绿萝花提取物的用量为5μg/ml，所述亚油酸的体积浓度为8%，燕麦蒽酰胺的质量浓度为0.09%，所述葡萄糖酸锌的浓度为4μg/ml。
29.将其用于从液氮中取出的冻存的骨髓间充质干细胞（冷冻保存剂为10%dmso、10%胎牛血清以及80%基础培养基）的复苏，具体复苏方法为：将上述骨髓间充质干细胞复苏液预热至37℃备用；向冻存管中加入上述骨髓间充质干细胞复苏液，以不超过冻存管总体积的80%为宜；将盛有上述骨髓间充质干细胞复苏液的冻存管置于超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的环境下进行复苏；细胞完全融化所需时间为55s；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
30.对比例1将冻存细胞从液氮中取出后，直接置于37℃水浴锅中复苏1.5min冻存细胞完全融化，检测细胞存活率。
31.对比例2该对比例所采用的骨髓间充质干细胞复苏液与实施例1相同，但复苏方法不同，具体复苏方法为：将上述骨髓间充质干细胞复苏液预热至37℃备用；向冻存管中加入上述骨髓间充质干细胞复苏液，以不超过冻存管总体积的80%为宜；将盛有上述骨髓间充质干细胞复苏液的冻存管置于37℃水浴锅中复苏1.5min(在37℃水浴锅中复苏65s时细胞完全融化)，检测细胞存活率。
32.对比例3与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含透明质酸；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏48s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
33.对比例4与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含sod；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏46s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
34.对比例5
与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含迷迭香精油；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏49s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
35.对比例6与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含绿萝花提取物；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏47s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
36.对比例7与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含亚油酸；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏47s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
37.对比例8与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含迷迭香精油和绿萝花提取物；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏50s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
38.对比例9与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含透明质酸和绿萝花提取物；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏50s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
39.对比例10与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含透明质酸和迷迭香精油；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏52s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
40.对比例11与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含燕麦蒽酰胺；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏85s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
41.对比例12与实施例1的区别仅在于：所采用的骨髓间充质干细胞复苏液中不含葡萄糖酸锌；细胞复苏的方法与实施例1也相同；在超声（超声波频率20khz）、 37℃水浴的条件下复苏72s时细胞完全融化；迅速将冻存管取出，取样检测细胞存活率。
42.备注：上述实施例1-5以及对比例1-10的复苏过程中，各步骤的操作均应尽快完成，避免造成实验过程中各操作的延迟；实施例1-5及对比例1-10是对同一批次冻存的骨髓间充质干细胞进行复苏，以避免由于不同批次/冻存条件不一致造成的实验结果的差异；本发明的骨髓间充质干细胞复苏液在预热至37℃后应尽快使用（2h内使用为宜）；上述实施例1-5及对比例1-10用到的绿萝花提取物均按照下述方法制备得到：采用体积分数为70%的乙醇溶液（以能没过绿萝花为宜），在80℃下提取2h，过滤得到滤液；再向滤渣中加入体积分数为70%的乙醇溶液，在80℃下提取2h，过滤得到滤液；合并两次滤液，减压浓缩至得到相对密度为1.3的稠膏；冷冻干燥、粉碎，即得绿萝花提取物。
43.采用台盼蓝染色法，经计数后得到实施例1-5以及对比例1-10（实施例1-5及对比例1-10的冻存样品均为液氮冻存12h、同批次的骨髓间充质干细胞）复苏后的细胞存活率，检测结果如下表1所示：表1样品变化复苏后的细胞存活率实施例197.6%实施例290.3%实施例392.4%实施例491.5%实施例591.9%对比例176.3%对比例284.3%对比例380.1%对比例487.6%对比例585.8%对比例679.1%对比例783.4%对比例870.3%对比例972.7%对比例1069.9%对比例1182.4%对比例1277.9%由上表1可知，本发明的骨髓间充质干细胞复苏液对复苏过程中的冻存细胞有保护作用；且结合本发明的复苏方法，可起到更好的保护作用，进一步提高复苏后的细胞存活率。
44.实施例1的骨髓间充质干细胞复苏液对细胞的保护作用最佳，复苏后的细胞存活率可达95%以上。
45.本发明的骨髓间充质干细胞复苏液中的各组分均是必不可少的，缺少其中的任意组分均会减少其对复苏过程中的细胞的保护作用；且迷迭香精油与绿萝花提取物、透明质酸与绿萝花提取物以及透明质酸和迷迭香精油等均可起到协同的对细胞的保护作用。
46.本发明的骨髓间充质干细胞复苏液中的燕麦蒽酰胺和葡萄糖酸锌不仅可起到提高细胞存活率的作用，还对细胞复苏（冻存细胞完全融化）所需的时间有重要影响——有助于缩短冻存细胞融化所需时间。
47.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。