用于捕获靶核酸的组合物和方法与流程

用于捕获靶核酸的组合物和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求于2019年11月14日提交的美国临时申请号62/935,376的权益，该美国临时申请的公开内容通过援引以其整体并入本文。
技术领域
3.本公开涉及分子生物学领域，更特别地，涉及用于通过使用捕获混合物从混合物(诸如样品)中分离核酸的方法和组合物，该捕获混合物包括与一种或多种靶核酸以及与固定于固体载体上的特异性结合配偶体杂化的探针群体、包括特异性结合配偶体的固体载体、月桂基硫酸锂、氢氧化锂以及两性离子磺酸缓冲剂，以允许与混合物的其他组分分离。
4.序列表
5.本技术与电子格式的序列表一同提交。序列表以创建于2020年10月27日的标题为“2020-10-27_01159-0041-00pct_seq_list_st25.txt”的文件的形式提供，大小为12,288字节。序列表的电子格式的信息通过援引以其整体并入本文。


技术实现要素：

6.许多分子生物学程序，诸如核酸的体外扩增和体外杂交，包括从其他样品组分中分离(例如，捕获)核酸以促进后续步骤。核酸分离的方法可以分离样品中存在的所有核酸，基于物理特征分离不同类型的核酸或从样品中分离特定核酸。许多方法涉及复杂的程序、使用苛刻的化学品或条件，或者需要很长时间才能完成该核酸分离。一些方法涉及使用专门的寡核苷酸，每个寡核苷酸对预期的靶核酸都具有特异性，这增加了方法的设计、优化和性能的复杂性，特别是如果期望分离多于一种靶核酸或期望的靶核酸的序列未知时。一些方法不需要特定的靶序列就可以分离靶核酸，但是不能高效地分离所有序列。因此，对于将感兴趣的核酸与其他样品组分分离，仍然需要具有改进的简单性、捕获效率和速度的捕获混合物。本公开旨在满足这些需求，和/或提供其他益处，或至少向公众提供有用的选择。
7.因此，以下实施方式在本公开提供的实施方式中。
8.实施方式1是一种用于从样品中分离靶核酸的捕获混合物，所述捕获混合物包括：
9.(a)月桂基硫酸锂；
10.(b)氢氧化锂；以及
11.(c)两性离子磺酸缓冲剂；
12.其中：
13.(i)所述月桂基硫酸锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约5％-35％的浓度或约35-120g/l的浓度存在；和/或
14.(ii)所述氢氧化锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约6％-15％的浓度或约14-50g/l的浓度存在；和/或
15.(iii)所述捕获混合物包括c
2-6
二羧酸；和/或
16.(iv)所述捕获混合物包括蛋白酶k；和/或
17.(v)所述捕获混合物包括(1)第一捕获探针群体，所述第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列，或非随机重复(g和u/t)序列，或其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)；和(2)第二捕获探针群体，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列、非随机重复(a和g)序列，或其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合所述sbp2；和/或
18.(vi)(1)所述第一捕获探针群体；
19.(vii)(2)任选地，所述第二捕获探针群体；以及
20.(viii)(3)包括固定于其上的所述sbp2的固体载体；
21.其中所述捕获探针的总浓度为约1-10mg/l，和/或固体载体是珠粒，并且所述珠粒以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约0.15％-1％或约300-2200mg/l的浓度存在；和/或
22.(ix)所述捕获混合物不包括磷酸盐缓冲液诸如nah2po4/na2hpo4缓冲液，螯合剂诸如edta或egta，或licl中的一种或多种。
23.实施方式2是根据实施方式1所述的捕获混合物，其中，所述捕获混合物包括水。
24.实施方式3是根据实施方式1或实施方式2所述的捕获混合物，其中所述月桂基硫酸锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约5％-35％的浓度或约20-120g/l的浓度存在。
25.实施方式4是根据实施方式1或实施方式2所述的捕获混合物，其中所述月桂基硫酸锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约8％-15％，或约9％-12％，或约11％的浓度或约20-45g/l，或约25-40g/l，或约25-35g/l，或约30g/l，或约39g/l的浓度存在。
26.实施方式5是根据实施方式3所述的捕获混合物，其中所述月桂基硫酸锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约5％-35％的浓度或约35-120g/l的浓度存在。
27.实施方式6是根据实施方式5所述的捕获混合物，其中所述月桂基硫酸锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计9％-30％，或约9％-14％，或约10％-13％，或约25％-30％，或约11％的浓度或约35-40g/l，或约100g/l的浓度存在。
28.实施方式7是根据实施方式1至4中的任一项所述的捕获混合物，其中所述氢氧化锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约6％-15％的浓度或约14-40g/l的浓度存在。
29.实施方式8是根据实施方式7所述的捕获混合物，其中所述氢氧化锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约8％-13％，或约10％-12.5％，或约10％-11％，或约10.4％的浓度或约17-40g/l，或约18-20g/l，或约27-30g/l，或约37g/l，或约19g/l，或约28.5g/l的浓度存在。
30.实施方式9是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括c
2-6
二羧酸。
31.实施方式10是根据实施方式9所述的捕获混合物，其中c
2-6
二羧酸是琥珀酸。
32.实施方式11是根据实施方式9或实施方式10所述的捕获混合物，其中所述二羧酸
以相对于混合物中的总固体的按重量计约7％-12％，或约7.5％-11％，或约10％，或约9.9％的浓度或约25-40g/l，或约25-30g/l，或约33-38g/l，或约35g/l，或约27g/l，或约27.2g/l的浓度存在。
33.实施方式12是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括蛋白酶k。
34.实施方式13是根据实施方式12所述的捕获混合物，其中所述捕获混合物中的所述蛋白酶k具有的比活性在约2.5-12u/ml，或约3-10u/ml，或约5u/ml的范围内(任选地，在例如用染色酶测定法，罗氏(roche)测量比活性的情况下)。
35.实施方式14是根据实施方式12或实施方式13所述的捕获混合物，其中所述蛋白酶k以约1-20mg/ml，或约1-10mg/ml，或约1-5mg或约1-4mg/ml，或约1.5-3mg/ml，或约2mg/ml，或约3mg/ml，或约4mg/ml的浓度存在于所述捕获混合物中。
36.实施方式15是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括：
37.(1)第一捕获探针群体，所述第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列，或非随机重复(g和u/t)序列，或其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)；和
38.(2)任选地，第二捕获探针群体，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列、非随机重复(a和g)序列，或其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合所述sbp2；和
39.(3)包括固定于其上的所述sbp2的固体载体；
40.其中所述捕获探针的总浓度为约1-10mg/l，和/或固体载体是珠粒，并且所述珠粒以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约0.15％-1％或约300-2800mg/l的浓度存在。
41.实施方式16是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括：
42.(1)第一捕获探针群体，所述第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列，或非随机重复(g和u/t)序列，或其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)；和
43.(2)第二捕获探针群体，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列、非随机重复(a和g)序列，或其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合所述sbp2。
44.实施方式17是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括固定至所述固体载体的所述sbp2。
45.实施方式18是根据实施方式17所述的捕获混合物，其中，所述固体载体是珠粒，诸如磁性珠粒或二氧化硅珠粒。
46.实施方式19是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中其上固定有
sbp2的所述固体载体是珠粒，并且所述珠粒以相对于混合物中的总固体的按重量计0.03％-1.0％的浓度或约150-2800mg/l的浓度存在。
47.实施方式20是根据实施方式19所述的捕获混合物，其中所述珠粒以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约0.04％-0.8％，或约0.03％-0.1％，或约0.2％-0.3％，或约0.7％-0.8％，或约0.2％的浓度，或150-1200mg/l，或约150-250mg/l，或约500-700mg/l，或约1800-2800mg/l，或约200mg/l，或约260mg/l，或约600mg/l，或约780mg/l，或约2000mg/l，或约2600mg/l的浓度存在。
48.实施方式21是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述捕获探针以约0.5-15mg/l，或约0.5-1mg/l，或约2-10mg/l，或约4-9mg/l，或约7-8mg/l，或约9.5mg/l，或约7.4mg/l的总浓度存在。
49.实施方式22是根据实施方式21所述的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括所述第一群体和所述第二群体。
50.实施方式23是根据实施方式22所述的捕获混合物，其中所述第一群体和所述第二群体各自以大约相同的浓度存在。
51.实施方式24是根据实施方式23所述的捕获混合物，其中所述第一群体和所述第二群体各自以约3-4mg/l或约3.7mg/l的浓度存在。
52.实施方式25是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述两性离子磺酸缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)。
53.实施方式26是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述两性离子磺酸缓冲剂以相对于所述混合物中的总固体的约50％-85％，或约52.5％-57.5％，或约64％-70％，或约72％-82％的浓度，或约150-275g/l，或约175-260g/l，或约170-200g/l，或约244g/l，或约188g/l的浓度存在。
54.实施方式27是根据实施方式2至26中任一项所述的捕获混合物，进一步包括消泡剂，任选地其中所述消泡剂为3维硅氧烷脱泡剂，并且所述3维硅氧烷脱泡剂在水中乳化。
55.实施方式28是根据实施方式27所述的捕获混合物，其中所述消泡剂以约0.02％w/v至约0.1％w/v，或约0.03％w/v至约0.08％w/v，或约0.03％w/v至约0.05％w/v，或约0.05％w/v，或约0.04％w/v的浓度存在。
56.实施方式29是根据实施方式2至28中任一项所述的捕获混合物，其中以下中的两种、三种、四种、五种、六种或七种为真：(i)所述第一群体和所述第二群体各自以约3.7mg/l的浓度存在；(ii)所述sbp2以约0.6mg/l的浓度存在，(iii)所述月桂基硫酸锂以约30g/l的浓度存在；(iv)所述氢氧化锂的浓度以约28.5g/l的浓度存在；(v)所述琥珀酸以约27.2g/l的浓度存在；(vi)所述两性离子磺酸缓冲剂是hepes并且以约188g/l的浓度存在；以及(vii)所述消泡剂以约0.04％w/v的浓度存在。
57.实施方式30是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列。
58.实施方式31是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第一群体的所述第一区域包括至少约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的随机聚(k)序列。
59.实施方式32是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述聚(k)序
列包括至少约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的非随机重复(g和u/t)序列。
60.实施方式33是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第一群体的所述第一区域的长度为至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
61.实施方式34为根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第一群体的所述第一区域由随机g和u/t核苷酸、非随机重复g和u/t核苷酸或其组合组成。
62.实施方式35是根据实施方式1至33中任一项所述的捕获混合物，其中所述第一群体的所述第一区域进一步包括在所述聚(k)序列和第二聚(k)序列之间的接头序列，并且所述第二聚(k)序列包括(i)包含g和u/t核苷酸的随机序列，或(ii)非随机重复(g和u/t)序列。
63.实施方式36是根据实施方式35所述的捕获混合物，其中所述聚(k)序列的长度为至少约6个残基，并且所述第二聚(k)序列的长度为至少约6个残基。
64.实施方式37是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第一群体的所述第一区域包括2
’‑
o-甲基修饰的rna残基。
65.实施方式38是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第一群体的所述第一区域包括聚(k)
18
、聚(k)
24
或聚(k)
25
序列。
66.实施方式39是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述sbp包括均聚序列。
67.实施方式40是根据实施方式39所述的捕获混合物，其中所述sbp包括dt3da
30
(seq id no:23)或da
30
(seq id no:24)序列。
68.实施方式41是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述sbp位于所述第一群体的所述第一区域的3’。
69.实施方式42是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列。
70.实施方式43是根据实施方式42所述的捕获混合物，其中所述第二群体的所述第一区域包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的随机聚(r)序列。
71.实施方式44是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述聚(r)序列包括至少约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的非随机重复(a和g)序列。
72.实施方式45是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第二群体的所述第一区域的长度为至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。
73.实施方式46是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第二群体的所述第一区域由所述随机g和a核苷酸、所述非随机重复(a和g)序列或其组合组成。
74.实施方式47是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第二群体的所述第一区域进一步包括在所述聚(r)序列和第二聚(r)序列之间的接头序列，并且所述第二聚(r)序列包括(i)包括g和a核苷酸的随机序列，或(ii)非随机重复(a和g)序列。
75.实施方式48是根据实施方式47所述的捕获混合物，其中所述聚(r)序列的长度为至少约6个残基并且所述第二聚(r)序列的长度为至少约6个残基。
76.实施方式49是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第二群体的所述第一区域包括2
’‑
o-甲基修饰的rna残基。
77.实施方式50是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述第二群体的所述第一区域包括聚(r)
18
、聚(r)
24
或聚(r)
25
序列。
78.实施方式51是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述sbp3包括均聚序列。
79.实施方式52是根据实施方式51所述的捕获混合物，其中所述sbp3包括dt3da
30
(seq id no:23)或da
30
(seq id no:24)序列。
80.实施方式53是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述sbp3位于所述第二群体的所述第一区域的3’。
81.实施方式54是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述sbp和所述sbp3之一或两者是与所述sbp2基本上互补的核酸序列。
82.实施方式55是根据前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，其中所述sbp2包括聚dt序列。
83.实施方式56是根据实施方式55所述的捕获混合物，其中所述sbp2包括dt
14
序列。
84.实施方式57是根据实施方式1所述的捕获混合物，包括：
85.(a)月桂基硫酸锂；
86.(b)氢氧化锂；
87.(c)所述两性离子磺酸缓冲剂；
88.(d)所述c
2-6
二羧酸；以及
89.(e)蛋白酶k。
90.实施方式58是根据实施方式57所述的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括：
91.(f)第一捕获探针群体，所述第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列，或非随机重复(g和u/t)序列，或其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)；
92.(g)第二捕获探针群体，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列、非随机重复(a和g)序列，或其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合所述sbp2；以及
93.(h)包括固定于其上的所述sbp2的固体载体；
94.实施方式59是包括前述实施方式中任一项所述的捕获混合物的预混制剂，其中，所述预混制剂不包括蛋白酶k，并且当所述制剂包括水时，组分以1.3倍的所列溶液浓度存在。
95.实施方式60是根据权利要求59所述的预混制剂，包括约244g/l hepes、约39g/l月桂基硫酸锂、约37g/l氢氧化锂、约35g/l琥珀酸、约0.04％w/v消泡剂、约3.7mg/ml所述第一群体和所述第二群体中的每一种以及约780mg/l的固定于珠粒上的sbp2。
96.实施方式61是包括实施方式1至58中任一项所述的活化的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括蛋白酶k。
97.实施方式62是通过将实施方式59或实施方式60所述的预混制剂与蛋白酶k组合而制备的活化的捕获混合物。
98.实施方式63是根据实施方式61或实施方式62所述的捕获混合物，其中所述蛋白酶k以约1-20mg/ml，或约1-5mg，或约1-4mg/ml，或约1.5-3mg/ml，或约2mg/ml，或约3mg/ml，或约4mg/ml的浓度存在于所述活化的捕获混合物中。
99.实施方式64是根据实施方式62所述的活化的捕获混合物，其中所述活化的捕获混合物通过以下来制备：将预混制剂与蛋白酶k溶液以约3:1至6:1，或约3:1至4:1，或约3.475:1(诸如139ml:40ml)的体积比组合，其中所述溶液中蛋白酶k的浓度为约5-20mg/ml，或约4.5-18mg/ml，或约5-15mg/ml，或约8-10mg/ml，或约9mg/ml，并且所述蛋白酶k具有约12.5-50u/ml，或约20-30u/ml，或约25u/ml的比活性。
100.实施方式65是包括实施方式1至58中任一项所述的捕获混合物或实施方式61-64中任一项所述的活化的捕获混合物和靶核酸的反应混合物，其中当蛋白酶k存在时，其任选地以约0.4-2mg/ml，或约1mg/ml的浓度，和/或任选地以约1-6u/ml或约2.5u/ml的比活性存在。
101.实施方式66是根据实施方式65所述的反应混合物，进一步包括内部对照和包含氢氧化锂的增强剂。
102.实施方式67是通过组合实施方式59或实施方式60所述的预混制剂、蛋白酶k和靶核酸制备的反应混合物，其中所述蛋白酶k任选地以约0.4-2mg/ml，或约1mg/ml的浓度，和/或任选地以约1-6u/ml或约2.5u/ml的比活性存在。
103.实施方式68是根据实施方式67所述的反应混合物，通过将实施方式59或实施方式60所述的预混制剂、蛋白酶k、内部对照、靶核酸和包含氢氧化锂的增强剂混合而制备。
104.实施方式69是根据实施方式66或实施方式68所述的反应混合物，其中所述增强剂中氢氧化锂的浓度为约0.8m-3.5m，或约1.0m-2.75m，或约1.25m-2.5m，或约1.5m-2.0m，或约1.6m-1.8m，或约1.68m。
105.实施方式70是根据实施方式65至69中任一项所述的反应混合物，其中所述靶核酸处于溶液相中和/或与捕获探针缔合。
106.实施方式71是根据实施方式70所述的反应混合物，其中所述溶液相包括来自动物、环境、食物或工业来源的样品。
107.实施方式72是根据实施方式70或实施方式71所述的反应混合物，其中所述溶液相包括样品，所述样品包括外周血、血清、血浆、脑脊髓液、痰、尿液或拭子标本。
108.实施方式73是根据实施方式65至72中任一项所述的反应混合物，其中所述靶核酸来源于外周血、血清或血浆。
109.实施方式74是根据实施方式70至72中任一项所述的反应混合物，其中所述靶核酸源自经过处理以将细胞内组分释放到所述溶液相中的细胞。
110.实施方式75是一种用于从样品中分离靶核酸的方法，所述方法包括：
111.a.使权利要求1-58中任一项所述的捕获混合物或权利要求61至64中任一项所述的活化的捕获混合物(其包括所述第一捕获探针群体)与包括靶核酸的溶液接触以形成反
应混合物；
112.b.在允许所述第一群体的所述第一区域与所述靶核酸杂交的条件下温育所述反应混合物；
113.c.在步骤(b)的同时或之后，在允许所述sbp(和所述sbp3，如果存在的话)与固定于所述载体上的所述sbp2缔合的条件下，将所述反应混合物与包括固定于其上的所述sbp2的固体载体一起温育，从而形成与溶液相接触的杂交复合物；以及
114.d.从所述溶液相中分离出所述载体，从而将所述靶核酸与所述样品中的其他组分分离。
115.实施方式76是根据实施方式75所述的方法，其中步骤(a)包括将实施方式61至64中任一项所述的活化的捕获混合物与内部对照、包括靶核酸的溶液和包含氢氧化锂的增强剂组合。
116.实施方式77是根据实施方式76所述的方法，其中所述增强剂中氢氧化锂的浓度为0.8m-3.5m，或约1.0m-2.75m，或约1.25m-2.5m，或约1.5m-2.0m，或约1.6m-1.8m，或约1.68m。
117.实施方式78是根据实施方式75至77中任一项所述的方法，其中所述捕获混合物或活化的捕获混合物不包括所述固体载体，并且步骤(a)包括将所述捕获混合物或活化的捕获混合物与所述固体载体组合。
118.实施方式79是根据实施方式75至78中任一项所述的方法，其中所述靶核酸来源于包含细胞的样品，并且所述方法包括在所述接触步骤之前处理所述细胞以将细胞内组分释放到所述溶液中。
119.实施方式80是根据实施方式79所述的方法，其中处理包括用洗涤剂处理所述样品。
120.实施方式81是根据实施方式79或实施方式80所述的方法，其中所述样品来自动物、环境、食物或工业来源。
121.实施方式82是根据实施方式79到81中任一项所述的方法，其中所述样品包括外周血、血清、血浆、脑脊髓液、痰、尿液或拭子标本。
122.实施方式83是根据实施方式79至82中任一项所述的方法，其中所述样品包括细胞裂解物。
123.实施方式84是根据实施方式65至74中任一项所述的反应混合物，或根据实施方式75至83中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包括dna和/或rna。
124.实施方式85是根据实施方式65至74中任一项所述的反应混合物，或根据实施方式75至83中任一项所述的方法，其中所述靶核酸包括病毒核酸、原核核酸、真核核酸、合成核酸或其组合。
125.实施方式86是一种试剂盒，包括：
126.(a)包括前述实施方式中任一项所述的捕获混合物的第一组分；和
127.(b)包括氢氧化锂的第二组分。
128.实施方式87是一种试剂盒，包括：
129.(a)包括预混制剂的第一组分，其中所述预混制剂包括前述实施方式中任一项所述的捕获混合物，所述预混制剂不包括蛋白酶k，并且当所述制剂包括水时，组分以1.3倍的
所列溶液浓度存在；
130.(b)包括氢氧化锂的第二组分；以及
131.(c)包括蛋白酶k的第三组分。
132.实施方式88是根据实施方式85或实施方式87所述的试剂盒，其中所述第二组分包括浓度为约0.8m-3.5m，或约1.0m-2.75m，或约1.25m-2.5m，或约1.5m-2.0m，或约1.6m-1.8m，或约1.68m的氢氧化锂。
133.实施方式89是根据实施方式87或实施方式88所述的试剂盒，其中所述第三组分包括浓度为约4.5-20mg/ml，或约4.5-18mg/ml，或约5-15mg/ml，或约8-10mg/ml，或约9mg/ml的蛋白酶k，并且所述蛋白酶k具有约12.5-50u/ml，或约20-30u/ml，或约25u/ml的比活性。
具体实施方式
134.在详细描述本教导之前，应理解本发明不限于具体的组合物或工艺步骤，因为此类组合物或工艺步骤可以变化。应注意的是，除非上下文另外明确指示，否则如在本说明书和所附加的权利要求中所使用的，单数形式“一(a/an)”以及“所述(the)”均包括复数指代。因此，例如，提及“寡聚物”包括多个寡聚物等。将以包含性的意义来解释连词“或”，即等同于“和/或”，除非包含性的意义在上下文中是不合理的。
135.应当理解，在本公开中讨论的温度、浓度、时间或其他数值条目之前存在隐含的“约”，使得轻微的和非实质性的偏差都处于本发明教导的范围内。通常，术语“约”指示组合物的组分的量的非实质性变化，其对组合物的活性或稳定性没有任何显著影响。而且，“包括(comprise或comprises或comprising)”、“包含(contain或contains或containing)”和“包括(include或includes或including)”的使用不旨在是限制性的。应理解，前面的一般性描述和详细描述都仅是示例性和解释性的，且并不是对本教导的限制。就通过援引并入的任何材料与本发明的表述内容不一致而言，以表述内容为准。
136.除非特别指出，否则说明书中叙述“包括”各个组分的实施方式也被认为是“由所述组分组成”或“基本上由所述组分组成”；说明书中叙述“由各个组分组成”的实施方式也被认为是“包括”所述组分或“基本上由所述组分组成”；并且说明书中叙述“基本上由各个组分组成”的实施方式也被认为是“由所述组分组成”或“包括”所述组分(这种可互换性不适用于这些术语在权利要求中的使用)。
137.a.定义
[0138]“样品”包括可以包含靶核酸的任何标本。样品包括“生物样品”，所述生物样品包括源自活体或死亡生物的任何组织或材料，其中所述材料或组织可以包含源自所述活体或死亡生物的靶核酸，包括例如外周血、血浆、血清、淋巴结、胃肠组织、脑脊髓液、痰、尿液、拭子标本或其他体液或材料。可以处理生物样品以物理或机械地破坏组织或细胞结构，从而将细胞内组分释放到溶液中，所述溶液可以进一步包含酶、缓冲液、盐、洗涤剂等，其用于使用标准方法制备生物样品进行分析。同样，样品可以包括处理后的样品，如通过使样品通过或穿过过滤装置，或然后进行离心，或通过粘附于介质、基质或载体而获得的样品。
[0139]“核酸”是指包括两个或多个共价键合的核苷或具有含氮杂环碱基的核苷类似物或碱基类似物的多聚体化合物，其中核苷通过磷酸二酯键或其他键连接在一起形成多核苷酸。核酸包括rna、dna或嵌合dna-rna聚合物或寡核苷酸及其类似物。核酸“主链”可以由多
种键构成，包括以下中的一个或多个：糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(在“肽核酸”或pna中，参见例如，国际专利申请公开号wo 95/32305)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代(诸如例如2
’‑
甲氧基取代和2
’‑
卤化物取代(例如2
’‑
f))的类似化合物。含氮碱基可以是常规碱基(a、g、c、t、u)、其类似物(例如，肌苷、5-甲基异胞嘧啶、异鸟嘌呤；参见例如核酸的生物化学(the biochemistry of the nucleic acids)5-36,adams等人编辑,第11版,1992；abraham等人,2007,生物技术(biotechniques)43:617-24)，其包括嘌呤碱基或嘧啶碱基的衍生物(例如，n
4-甲基脱氧甘氨酸、脱氮-或氮杂-嘌呤、脱氮-或氮杂嘧啶、在5或6位具有取代基团的嘧啶碱基、在2、6和/或8位具有改变或替代取代基的嘌呤碱基(诸如，2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、o
6-甲基鸟嘌呤、4-硫代-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和o
4-烷基-嘧啶)以及吡唑化合物(诸如，未取代或3-取代的吡唑并[3,4-d]嘧啶)；美国专利号5,378,825、6,949,367和国际专利申请公开号wo 93/13121，这些专利各自通过援引并入本文)。核酸可以包括“无碱基”残基，在该残基中，主链不包括一个或多个残基的含氮碱基(参见例如，美国专利号5,585,481，其通过援引并入本文)。核酸可以仅包括如在rna和dna中所发现的常规的糖、碱基和键，或者也可以包括常规的组分和取代(例如，通过2
′‑
甲氧基主链连接的常规碱基，或包括常规碱基与一个或多个碱基类似物的混合物的核酸)。核酸可以包括“锁定核酸”(lna)，其中一个或多个核苷酸单体具有锁定在模仿糖构象的rna中的双环呋喃糖单元，从而增强了对单链rna(ssrna)、单链dna(ssdna)或双链dna(dsdna)中互补序列的杂交亲和力(vester等人，生物化学(biochemistry)43:13233-41,2004，其通过援引并入本文)。核酸可以包括经修饰的碱基以改变核酸的功能或行为，例如，添加3
’‑
末端双脱氧核苷酸以阻断另外的核苷酸被添加到核酸中。尽管可以使用常规技术从天然来源纯化核酸，但是本领域众所周知用于体外制备核酸的合成方法。
[0140]
如本文所用，术语“多核苷酸”表示核酸链。在整个本技术中，核酸由5
’‑
末端至3
’‑
末端指定。合成核酸，例如dna、rna和dna/rna嵌合体(包括当在本文中包括非天然核苷酸或类似物时)，通常是“3
’‑
到-5
’”
合成的，即通过向生长中的核酸的5
’‑
末端添加核苷酸。
[0141]
如本文所用，“核苷酸”是由磷酸基团、5-碳糖和含氮碱基(在本文中也被称为“核碱基”)组成的核酸的亚基。rna中发现的5-碳糖是核糖。在dna中，5-碳糖是2
’‑
脱氧核糖。该术语还包括此类亚基的类似物，诸如核糖的2’位置处的甲氧基基团(在本文中也被称为“2
’‑
o-me”或“2
’‑
甲氧基”)。如本文所用，除非另外说明，否则2
’‑
甲氧基寡核苷酸中的“t”残基可与“u”互换。
[0142]
如本文所用，“非核苷酸单元”是不明显参与聚合物杂交的单元。例如，这样的单元不参与任何显著的与核苷酸的氢键结合，并且将排除具有五个核苷酸碱基之一或其类似物作为组分的单元。
[0143]
如本文所用，“靶核酸”是包括待扩增的靶序列的核酸。靶核酸可以是本文所述的dna或rna，并且可以是单链的或双链的。除了靶序列之外，靶核酸可以包括其他序列，这些其他序列可以不被扩增。
[0144]
本文使用的“靶杂交序列”是指被配置成与靶核酸进行杂交的寡聚物的部分。靶杂交序列可以但不一定包括在与靶标进行杂交的段之间的接头(例如，接头序列或非核苷酸链)。
[0145]
如本文所用，术语“区域”是指核酸的部分，其中所述部分比整个核酸小。例如，当提及的核酸是捕获探针时，术语“区域”可用于指代整个寡核苷酸的较小的靶杂交部分或充当特异性结合配偶体的较小部分。
[0146]
可互换的术语“寡聚物”、“寡”和“寡核苷酸”是指具有通常少于1,000个核苷酸(nt)残基的核酸，包含处于下限为约5nt残基且上限为约500至900nt残基的范围内的聚合物。在一些实施方式中，寡核苷酸处于下限为约12至15nt且上限为约50至600nt的大小范围内，而其他实施方式处于下限为约15至20nt且上限为约22至100nt的范围内。寡核苷酸可以从天然存在的来源中纯化或可以使用多种众所周知的酶或化学方法中的任何一种来进行合成。术语寡核苷酸不表示试剂的任何特定功能；相反，其通常用于涵盖本文所述的所有此类试剂。寡核苷酸可以发挥各种不同的功能。例如，如果寡核苷酸对互补链具有特异性并能够与互补链进行杂交，并且可以在存在核酸聚合酶的情况下进一步延伸，则该寡核苷酸可以用作引物；如果寡核苷酸包含被rna聚合酶识别的序列并允许转录，则该寡核苷酸可以用作引物并提供启动子(例如t7引物)；以及如果寡核苷酸能够与靶核酸或其扩增子进行杂交，则该寡核苷酸可以起到检测靶核酸的作用，并进一步提供可检测的部分(例如荧光团)。
[0147]“扩增”是指用于获得靶核酸序列或其互补序列或其片段的多个拷贝的任何已知步骤。多个拷贝可以被称为扩增子或扩增产物，其可以是双链或单链的并且可以包括dna、rna或两者。“片段”的扩增是指产生包含少于完整靶核酸或其互补序列的扩增的核酸，例如，通过使用与靶核酸的内部位置进行杂交并从该内部位置开始聚合的扩增寡核苷酸来产生。已知的扩增方法包括例如复制酶介导的扩增、聚合酶链反应(pcr)、连接酶链反应(lcr)、链置换扩增(sda)以及转录介导或转录相关的扩增。复制酶介导的扩增使用自我复制的rna分子和复制酶，诸如qb-复制酶(参见例如，美国专利号4,786,600，其通过援引并入本文)。pcr扩增使用dna聚合酶、引物对和热循环来合成dsdna或cdna的两条互补链的多个拷贝(参见例如，美国专利号4,683,195；4,683,202；和4,800,159；各自通过援引并入本文)。lcr扩增通过使用杂交、连接和变性的多个循环来使用四个或更多个不同的寡核苷酸来扩增靶标及其互补链(参见例如，美国专利号5,427,930和5,516,663，各自通过援引并入本文)。sda使用的引物包含限制性内切核酸酶和可切割含有靶序列的半修饰dna双链体的一条链的内切核酸酶的识别位点，从而在一系列引物延伸和链置换步骤中进行扩增(参见例如，美国专利号5,422,252、5,547,861；和5,648,211；各自通过援引并入本文)。扩增可以是线性的或指数的。
[0148]
在促进杂交以允许检测靶序列或扩增的核酸的条件下，“检测探针”、“检测寡核苷酸”、“探针寡聚物”和“检测探针寡聚物”可互换使用以指代与核酸或扩增的核酸中的靶序列进行特异性杂交的核酸寡聚物。检测可以是直接的(例如，直接与其靶序列杂交的探针)或间接的(例如，通过中间分子结构与其靶标连接的探针)。检测探针可以是dna、rna，其类似物或其组合(例如，dna/rna嵌合体)，并且它们可以是标记的或未标记的。检测探针可进一步包括替代性主链键，诸如例如2
’‑
o-甲基键。检测探针寡聚物的“靶序列”通常指通过标准碱基配对与探针寡聚物的至少一部分特异性杂交的较大核酸序列中的较小核酸序列区域。检测探针可以包括靶特异性序列和有助于探针的三维构象的其他序列(参见例如，美国专利号5,118,801；5,312,728；6,849,412；第6,835,542；6,534,274；和6,361,945；以及美国专利申请公开号20060068417；各自通过援引并入本文)。
[0149]“稳定的”或“检测稳定的”是指反应混合物的温度比核酸双链体的解链温度低至少2℃。
[0150]
如本文所用，“标记”是指与被检测或导致可检测信号的探针直接或间接地连接的部分或化合物。直接标记可以通过将标记与探针连接的键或相互作用，包括共价键或非共价相互作用，例如氢键、疏水相互作用和离子相互作用，或通过形成螯合物或配位复合物来发生。间接标记可以通过使用诸如结合对构件、抗体或附加寡聚物等桥接部分或“接头”发生，所述桥接部分或“接头”可以被直接地或间接地标记并且可以扩增可检测信号。标记包括任何可检测的部分，诸如放射性核素、配体(例如生物素、抗生物素蛋白)、酶或酶底物、反应基团或发色团(例如，赋予可检测颜色的染料、颗粒或珠粒)、发光化合物(例如，生物发光、磷光或化学发光标记)或荧光团。可以在均相测定中检测到标记，在该均相测定中，混合物中结合标记的探针具有与未结合标记的探针不同的可检测的变化，例如，不稳定性或差异降解特性。
[0151]“捕获探针”、“捕获寡核苷酸”、“捕获寡聚物”、“靶捕获寡聚物”和“捕获探针寡聚物”可互换使用以指代通过标准碱基配对与靶核酸中的靶序列进行特异性杂交并与固定化探针上的结合配偶体结合以将靶核酸捕获到载体上的核酸寡聚物。捕获寡聚物的一个实例包括两个结合区：序列结合区域(例如靶特异性部分)和固定化探针结合区域，通常在同一寡聚物上，尽管这两个区域可能存在于通过一个或多个接头连接在一起的两个不同的寡聚物上。捕获寡聚物的另一种实施方式使用靶序列结合区域，该靶序列结合区域包括随机或非随机的聚gu、聚gt或聚u序列以与靶核酸进行非特异性结合并将其连接到载体上的固定化探针上。
[0152]
如本文所用，“固定化寡核苷酸”、“固定化探针”、“固定化结合配偶体”、“固定化寡聚物”或“固定化核酸”是指将捕获寡聚物直接或间接地连接到载体的核酸结合配偶体。与载体连接的固定化探针有助于将捕获探针结合的靶标与样品中未结合的物质分离。固定化探针的一种实施方式是与载体连接的寡聚物，其有助于将结合的靶序列与样品中未结合的物质分离。载体可以包括已知的材料(诸如不溶于溶液的基质和颗粒)，其可以由硝化纤维素、尼龙、玻璃、聚丙烯酸酯、混合聚合物、聚苯乙烯、硅烷、聚丙烯、金属或其它组合物构成，其中的一种实施方式为可磁性吸引的颗粒。载体可以是单分散磁球(例如，均匀大小 5％)，固定化探针与该单分散磁球直接连接(通过共价键、螯合或离子相互作用)或间接连接(通过一个或多个接头)，其中在杂交条件期间，探针与载体之间的键或相互作用是稳定的。载体可以是珠粒，诸如磁性或二氧化硅(磁性或非磁性)珠粒，或平面载体，诸如芯片、微流体装置或柱。
[0153]“互补的”是指两个单链核酸的类似区域或同一单链核酸的两个不同区域的核苷酸序列具有核苷酸碱基组合物，所述核苷酸碱基组合物允许单链区域在严格的杂交或扩增条件下在稳定的双链氢键区域中杂交在一起。通过标准核酸碱基配对(例如，g:c、a:t或a:u配对)，彼此杂交的序列可以与预期靶序列完全互补或部分互补。“充分互补”是指能够通过一系列互补碱基之间的氢键键合与另一序列进行杂交的连续序列，所述互补碱基可以通过标准碱基配对在序列的每个位置上互补或可以包含一或多个残基，包括不互补的无碱基残基。充分互补的连续序列通常与将与寡聚物进行特异性杂交的序列至少80％或至少90％互补。“充分互补”的序列允许核酸寡聚物在合适的杂交条件下与其靶序列进行稳定杂交，即
使所述序列并非完全互补的。当一个单链区域的核苷酸的连续序列能够与另一个单链区域的核苷酸的类似序列形成一系列“规范”或“watson-crick”氢键结合的碱基对使得a与u或t配对并且c与g配对时，核苷酸序列是“完全”互补的(参见例如，sambrook等人，分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)，第2版，(冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press)，冷泉港(cold spring harbor)，纽约，1989)，所述文献根据
§§
1.90-1.91、7.37-7.57、9.47-9.51和11.47-11.57，特别地
§§
9.50-9.51、11.12-11.13、11.45-11.47和11.55-11.57，通过援引并入本文)。适当的杂交条件是本领域众所周知的，其可以基于序列组成来预测，或者可以通过使用常规测试方法来确定(参见例如，sambrook等人，同上(通过援引并入本文)。
[0154]
应理解，同一性百分比的范围包括所有整数和部分数字(例如，至少90％包括90、91、93.5、97.687等)。除非上下文另外指出，否则对特定序列的“互补体”的提及通常表示完全互补的序列。
[0155]“摇摆(wobble)”碱基对是指g与u或t的配对。
[0156]“核酸杂交体”、“杂交体”或“双链体”是指含有双链区域、氢键合区域的核酸结构，其中所述区域足够稳定以允许在适当条件下分离或纯化双链体。此类杂交体可以包括rna:rna、rna:dna或dna:dna双链体分子等等。
[0157]“分离”或“纯化”意为样品的一个或多个组分被除去或与其他样品组分分离。样品组分包括通常在一般为水性溶液相中的靶核酸，其也可以包括细胞碎片、蛋白质、碳水化合物、脂质和其他核酸。“分离”或“纯化”并不意味着任何程度的纯化。典型地，分离或纯化从其他样品组分中去除至少70％或至少80％或至少95％的靶核酸。
[0158]“相对于混合物中总固体的按重量计”浓度是指在包含多种固体组分的混合物中特定固体组分的w/w比。例如，在两种固体a和b的混合物中，a相对于混合物中总固体的按重量计浓度是a的质量除以a b的质量。本文所述的固体组分包括两性离子磺酸缓冲剂、月桂基硫酸锂、氢氧化锂、c
2-6
二羧酸，以及，当存在时，珠粒作为固体载体，以及更一般地，熔点高于22℃或在室温下为固体的任何物质。
[0159]
除非另外说明，否则提及“seq id no:x的序列”，特别是在权利要求中，是指相应序列表条目的碱基序列，并且不需要主链的身份(包含但不限于rna、2
’‑
o-me rna、dna或lna)。此外，除非另外说明，否则出于序列表条目的目的，t和u残基应被认为是可互换的，例如，不论主题序列第六位的残基是t还是u，都认为所述主题序列与以t为第六核苷酸的seq id no相同。
[0160]
b.捕获混合物、活化的捕获混合物、方法、用途和试剂盒
[0161]
本文公开的一方面是用于从样品中分离靶核酸的捕获混合物，所述捕获混合物包含：
[0162]
(a)月桂基硫酸锂；
[0163]
(b)氢氧化锂；以及
[0164]
(c)两性离子磺酸缓冲剂；
[0165]
其中：
[0166]
(i)所述月桂基硫酸锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约5％-35％的浓度或约35-120g/l的浓度存在；和/或
[0167]
(ii)所述氢氧化锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约6％-15％的浓度或约14-40g/l的浓度存在；和/或
[0168]
(iii)所述捕获混合物包括c
2-6
二羧酸；和/或
[0169]
(iv)所述捕获混合物包括蛋白酶k；和/或
[0170]
(v)所述捕获混合物包括(1)第一捕获探针群体，所述第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列，或非随机重复(g和u/t)序列，或其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)；和(2)第二捕获探针群体，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列、非随机重复(a和g)序列，或其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合所述sbp2；和/或
[0171]
(vi)(1)所述第一捕获探针群体；
[0172]
(2)任选地，所述第二捕获探针群体；以及
[0173]
(3)包括固定于其上的所述sbp2的固体载体；
[0174]
其中所述捕获探针的总浓度为约1-10mg/l，和/或固体载体是珠粒，并且所述珠粒以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约0.15％-1％或约300-2200mg/l的浓度存在；和/或
[0175]
(vii)所述捕获混合物不包括磷酸盐缓冲液诸如nah2po4/na2hpo4缓冲液，螯合剂诸如edta或egta，或licl中的一种或多种。
[0176]
在一些实施方式中，捕获混合物是固体组分的干燥混合物。在一些实施方式中，捕获混合物处于溶液相。在一些实施方式中，捕获混合物包括水。
[0177]
在一些实施方式中，月桂基硫酸锂以相对于混合物中的总固体的按重量计约5％-35％的浓度或约20-120g/l的浓度存在于捕获混合物中。在一些实施方式中，月桂基硫酸锂以相对于混合物中的总固体的按重量计约8％-15％，或约9％-12％，或约11％的浓度或约20-40g/l，或约25-35g/l，或约30g/l的浓度存在。在一些实施方式中，月桂基硫酸锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约5％-35％的浓度或约35-120g/l的浓度存在。在一些实施方式中，月桂基硫酸锂以相对于所述混合物中的总固体的按重量计9％-30％，或约9％-14％，或约10％-13％，或约25％-30％，或约11％的浓度或约35-40g/l，或约100g/l的浓度存在。
[0178]
在一些实施方式中，氢氧化锂以相对于混合物中的总固体的按重量计约6％-15％的浓度或约14-40g/l的浓度存在于捕获混合物中。在一些实施方式中，氢氧化锂以相对于混合物中的总固体的按重量计约8％-13％，或约10％-12.5％，或约10％-11％，或约10.4％的浓度或约17-35g/l，或约18-20g/l，或约27-30g/l，或约19g/l，或约28.5g/l的浓度存在。包括氢氧化锂一水合物的任何固体制剂或由氢氧化锂一水合物制备的任何液体制剂有资格包括氢氧化锂，并且固体和液体制剂中氢氧化锂的浓度/量根据氢氧化锂一水合物的分子量计算。
[0179]
在一些实施方式中，捕获混合物包括c
2-6
二羧酸。在一些实施方式中，c
2-6
二羧酸是琥珀酸。在一些实施方式中，二羧酸以相对于混合物中的总固体的按重量计约7％-12％，或
约7.5％-11％，或约10％，或约9.9％的浓度或约25-35g/l，或约25-30g/l，或约27g/l，或约27.2g/l的浓度存在。
[0180]
在一些实施方式中，捕获混合物包括蛋白酶k。在一些实施方式中，捕获混合物中的所述蛋白酶k具有的比活性在约2.5-12u/ml，或约3-10u/ml，或约5u/ml的范围内(任选地，在例如用染色酶测定法，罗氏(roche)测量比活性的情况下)。在一些实施方式中，蛋白酶k以约1-20mg/ml，或约1-5mg/ml或约1-4mg/ml，或约1.5-3mg/ml，或约2mg/ml，或约3mg/ml，或约4mg/ml的浓度存在于捕获混合物中。
[0181]
在一些实施方式中，捕获混合物包括：
[0182]
(1)第一捕获探针群体，所述第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列，或非随机重复(g和u/t)序列，或其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)；和
[0183]
(2)任选地，第二捕获探针群体，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列、非随机重复(a和g)序列，或其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合所述sbp2；和
[0184]
(3)包括固定于其上的所述sbp2的固体载体；
[0185]
其中所述捕获探针的总浓度为约1-10mg/l，和/或固体载体是珠粒，并且所述珠粒以相对于混合物中的总固体的按重量计约0.15％-1％或约300-2200mg/l的浓度存在。
[0186]
在一些实施方式中，捕获混合物包括：
[0187]
(1)第一捕获探针群体，所述第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列，或非随机重复(g和u/t)序列，或其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)；和
[0188]
(2)第二捕获探针群体，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列、非随机重复(a和g)序列，或其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合所述sbp2。
[0189]
在一些实施方式中，捕获混合物包括固定于固体载体上的sbp2。在一些实施方式中，固体载体是珠粒，例如磁性珠粒或二氧化硅珠粒。在一些实施方式中，其上固定有sbp2的固体载体是珠粒，并且所述珠粒以相对于混合物中的总固体的按重量计0.03％-1.0％的浓度或约150-2500mg/l的浓度存在。在一些实施方式中，珠粒以相对于所述混合物中的总固体的按重量计约0.04％-0.8％，或约0.03％-0.1％，或约0.2％-0.3％，或约0.7％-0.8％，或约0.2％的浓度，或150-1200mg/l，或约150-250mg/l，或约500-700mg/l，或约1800-2200mg/l，或约200mg/l，或约600mg/l，或约2000mg/l的浓度存在。
[0190]
在一些实施方式中，捕获探针以约0.5-10mg/l，或约0.5-1mg/l，或约2-10mg/l，或约4-9mg/l，或约7-8mg/l，或约7.4mg/l的总浓度存在。在一些实施方式中，捕获混合物包括第一群体和第二群体。在一些实施方式中，第一群体和第二群体各自以大约相同的浓度存在。在一些实施方式中，第一群体和第二群体各自以约3-4mg/l或约3.7mg/l的浓度存在。
[0191]
在一些实施方式中，两性离子磺酸缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)。在一些实施方式中，两性离子磺酸缓冲剂以相对于混合物中总固体的约50％-85％，或约52.5％-57.5％，或约64％-70％，或约72％-82％的浓度，或约150-275g/l，或约175-260g/l，或约170-200g/l，或约188g/l的浓度存在。
[0192]
在一些实施方式中，捕获混合物是溶液，例如包括水，并且进一步包括消泡剂，任选地其中消泡剂为3维硅氧烷脱泡剂，并且3维硅氧烷脱泡剂在水中乳化。在一些实施方式中，消泡剂以约0.02％w/v至约0.06％w/v，或约0.03％w/v至约0.05％w/v，或约0.03％w/v至约0.05％w/v，或约0.04％w/v的浓度存在。
[0193]
在一些实施方式中，捕获组合物被配置成使得其中以下两种、三种、四种、五种、六种或七种为真：(i)所述第一群体和所述第二群体各自以约3.7mg/l的浓度存在；(ii)所述sbp2以约0.6mg/l的浓度存在，(iii)所述月桂基硫酸锂以约30g/l的浓度存在；(iv)所述氢氧化锂的浓度以约28.5g/l的浓度存在；(v)所述琥珀酸以约27.2g/l的浓度存在；(vi)所述两性离子磺酸缓冲剂是hepes并且以约188g/l的浓度存在；以及(vii)所述消泡剂以约0.04％w/v的浓度存在。
[0194]
如本文所述，包括捕获探针的捕获混合物或活化的捕获混合物包括以下情形：其中两种特异性结合配偶体是基本互补或互补序列且两种特异性结合配偶体被退火，所述捕获探针包括一种特异性结合配偶体，其能够特异性结合另一种特异性结合配偶体。
[0195]
本文描述的示例性试剂和靶标捕获程序如本文所述，尽管如此，分子生物学领域的技术人员将理解，许多不同的试剂可用于执行所述反应和测试的基本步骤。
[0196]
在一些实施方式中，捕获混合物包括第一群体并且用于从样品中纯化或分离靶核酸。捕获探针群体可以在不需要靶标中的特定序列的情况下结合靶核酸，并因此可以用于捕获各种已知或未知的靶核酸。在一些实施方式中，捕获探针例如通过与固体载体上的固定探针进行特异性结合而附着于所述固体载体。以这种方式，捕获探针连同靶核酸可以与其他样品组分分离。
[0197]
第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括(i)包含g和u/t核苷酸的随机序列，或(ii)非随机重复(g和u/t)序列，或(iii)其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)。becker等人在us2013/0209992(2013年8月15日)中描述了示例性第一群体，所述专利通过援引并入本文。“g和u/t核苷酸”包括(i)g和u核苷酸、(ii)g和t核苷酸或(iii)g、u和t核苷酸。类似地，非随机重复(g和u/t)序列中的重复可以包括(i)g和u核苷酸、(ii)g和t核苷酸或(iii)g、u和t核苷酸，并且(gu)和(gt)等序列被认为是彼此重复，尽管前者中存在u，而后者中存在t。第二捕获探针群体可以包括rna、dna、lna和/或2
’‑
o-甲基修饰的rna残基。
[0198]
第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括(i)包含g和a核苷酸的随机序列，或(ii)非随机重复(a和g)序列，或(iii)其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合sbp2。“聚(r)”用作聚嘌呤(a和/或g)的缩写。在一些实施方式中，聚(r)序列包括(i)包含g和a核苷酸的随机序列和(ii)非随机重复(a和g)序列。第二捕获探针群体可以包括rna、dna、lna和/或2
’‑
o-甲基修饰的rna残基。
[0199]
本文所述的非特异性捕获探针可以存在于许多不同的实施方式中。在一些实施方式中，它们可以由结构rp-sbp或sbp-rp(或rp-sbp3或sbp3-rp)表示，其中“rp”代表随机或重复序列(第一区域)，而“sbp”代表“特异性结合配偶体”(第二区域)。在这些代表性图中，sbp相对于rp以线性方式表示，但是本领域技术人员将理解，sbp可以在任何点连接到捕获探针的rp。因此，除非另外说明，否则第一区域和第二区域不一定彼此具有任何特定的空间关系。在rp由g和u/t碱基构成的实施方式中，非特异性捕获探针可以由图示的结构(k)
x-sbp或sbp-(k)
x
表示，其中“k”代表rp部分的g和u/t碱基，“x”代表k序列的长度(以nt为单位)，并且“sbp”代表“特异性结合配偶体”。尽管以线性方式示出了sbp和(k)
x
序列，但是应该理解，sbp可以在任何点连接到捕获探针。相同的架构适用于聚(r)群体。
[0200]
一些实施方式包括一或多个碱基类似物(例如，肌苷、5-硝基吲哚)或随机聚合物序列中的无碱基位置。第一群体的一些实施方式包括包含一个或多个聚(k)碱基序列的无规聚合物序列，即g和u/t碱基的随机混合物，并且第二群体的一些实施方式包括包含一个或多个聚(r)碱基序列的无规聚合物序列，即g和a碱基的随机混合物(例如，参见wipo工业产权信息和文献手册，标准st.25(1998)，表1)。选择g碱基是因为其“摇摆”特性，即g结合c或u/t。应理解，利用随机聚合物序列合成捕获探针提供了包含不同随机聚合物序列的寡核苷酸群体，所述随机聚合物序列由随机部分合成期间所包括的碱基构成。例如，包括由g和a或u/t构成的15nt随机聚合物序列的非特异性捕获探针群体由最多2
15
个独特成员组成。
[0201]
尽管包含在非特异性捕获探针中的一或多个连续随机序列的长度可以变化，但是约12nt或更长的聚(k)或聚(r)序列足以高效地靶捕获许多靶标。非特异性捕获探针中的随机聚(k)或聚(r)序列之间存在非随机寡核苷酸或非核苷酸间隔物可能影响靶捕获效率。包括lna构型中的随机聚(k)或聚(r)序列的至少一部分的非特异性捕获探针可以比具有dna构型中类似长度的非特异性捕获探针更有效地靶捕获ssdna，并且包含lna和dna残基混合物的那些可以比包含lna构型中的所有聚(k)或聚(r)序列的那些更有效。与双链dna(dsdna)的靶捕获相比，包括lna构型中的随机聚(k)或聚(r)序列的至少一部分的非特异性捕获探针可以更有效地靶捕获rna和ssdna。与通过使用2
’‑
甲氧基rna碱基合成相同长度的随机聚(k)或聚(r)序列的捕获探针相比，包括lna构型中的随机聚(k)或聚(r)序列的至少一部分的非特异性捕获探针可以更有效地靶捕获rna。这些通用参数可用于选择用于捕获预期的靶核酸或靶核酸类型的捕获探针群体的合适实施方式，可以通过使用如以下实例中所述的程序测试所述靶核酸，以选择非特异性捕获探针群体和提供期望的靶捕获结果的条件。
[0202]
本文所述的非特异性捕获探针的实施方式使用以下命名法以5’到3’定向缩写寡核苷酸组分的结构。包含一或多个随机g或u/t碱基的寡核苷酸使用术语“(k)
x”，其中“k”代表g和u/t的随机分类，并且“x”表示g和u/t碱基的随机分类中的位置数。如果寡聚物使用带有2
’‑
甲氧基键主链的rna碱基，则术语也可以包括“2
’‑
ome”，以表示g和u/t碱基的随机分类的修饰键，例如2
’‑
ome-(k)
x
。如果寡核苷酸使用标准dna键，则术语可以包括“d”以表示g和u/t碱基的随机分类的dna，例如d(k)
x
，而如果寡聚物使用具有锁定核酸(lna)构型的dna碱基，则术语包括“l”以表示g和u/t碱基的随机分类的lna构型，例如l(k)
x
。由不同部分的组合构成的寡核苷酸可以包括这些术语中的一或多个以限定整个结构。例如，以5’到3’定向的由六个具有标准dna键的随机g和u/t碱基(k碱基)、三个具有标准dna键的a碱基和五个
具有标准dna键的随机g和u/t碱基(k碱基)构成的寡核苷酸将被缩写为d(k)
6-dt
3-d(k)5(seq id no:1)。又例如，以5’到3’定向的由五个具有lna键的随机g和u/t碱基、三个具有dna键的a碱基和四个具有dna键的随机g和u/t碱基构成的寡核苷酸将被缩写为l(k)
5-da
3-d(k)4(seq id no:2)。又例如，以5’到3’定向的由十个具有2
’‑
甲氧基键的随机g和u/t碱基和三十个具有标准dna键的a碱基的3’尾部构成的寡核苷酸将被缩写为2
’‑
ome-(k)
10-da
30
(seq id no:3)。类似地，以5’到3’定向的由六个具有标准dna键的随机g和a碱基(r碱基)、三个具有标准dna键的t碱基和五个具有标准dna键的随机g和a碱基(r碱基)构成的寡核苷酸将被缩写为d(r)
6-dt
3-d(r)5(seq id no:4)。又例如，以5’到3’定向的由五个具有lna键的随机g和a碱基、三个具有dna键的a碱基和四个具有dna键的随机g和a碱基构成的寡核苷酸将被缩写为l(r)
5-da
3-d(r)4(seq id no:5)。又例如，以5’到3’定向的由十个具有2
’‑
甲氧基键的随机g和a碱基和三十个具有标准dna键的a碱基的3’尾部构成的寡核苷酸将被缩写为2
’‑
ome-(r)
10-da
30
(seq id no:6)。
[0203]
在一些实施方式中，第一群体的第一区域的长度为至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方式中，第一群体的第一区域包括(k)
x
序列，其中x是13到30范围内的值，例如约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些实施方式中，聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列。在一些实施方式中，第一群体的第一区域包括至少约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的随机聚(k)序列。在一些实施方式中，聚(k)序列包括非随机重复(g和u/t)序列。在一些实施方式中，第一群体的第一区域包括至少约13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的非随机重复(g和u/t)序列。在一些实施方式中，第一群体的第一区域包括聚(k)
18
、聚(k)
24
或聚(k)
25
序列。在一些实施方式中，包括但不限于当x小于约12时，第一群体的第一区域包括(k)y序列，其中x y之和大于或等于约12。在一些实施方式中，第一群体的第一区域由随机g和u/t核苷酸、非随机重复g和u/t核苷酸或其组合组成。在一些实施方式中，第一群体的第一区域包括由鸟嘌呤(g)和尿嘧啶/胸腺嘧啶(u/t)核苷酸组成的随机聚合物序列，其可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或2
’‑
o-甲基修饰的rna残基(也称为2
’‑
o-me核苷酸)。
[0204]
在一些实施方式中，第二群体的第一区域由随机g和a核苷酸、非随机重复(a和g)序列或其组合组成。在一些实施方式中，聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列。在一些实施方式中，第二群体的第一区域包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸的随机聚(r)序列。在一些实施方式中，第二群体的第一区域的长度为至少13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施方式中，聚(r)序列包括至少约4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个非随机重复(a和g)序列核苷酸。在一些实施方式中，第二群体包括第一区域，所述第一区域包括(r)
x
序列，其中x是2到30范围内的值，例如约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在一些实施方式中，第二群体的第一区域包括聚(r)
18
、聚(r)
24
或聚(r)
25
序列。在一些实施方式中，包括但不限于当x小于约12时，第一区域包括(r)y序列，其中x y之和大于或等于约12。
[0205]
在一些实施方式中，第一群体包括包含非随机重复(a和u/t)序列的第一区域。具体地，非随机重复序列可以包括直接重复或反向重复，或两者。因此，包括g和u/t核苷酸重复的这样的重复序列的实例包括(tg)(gt)(tg)(gt)(tg)(gt)(seq id no:7)、(ug)(gu)(ug)(gu)(ug)(gu)(seq id no:8)、(tg)(tg)(tg)(gt)(tg)(tg)(seq id no:9)、(ug)(ug)(ug)(gu)(ug)(ug)(seq id no:10)、(ttg)(gtt)(gtt)(ttg)(seq id no:11)、(uug)(guu)(guu)(uug)(seq id no:12)、(ttg)(ttg)(ttg)(ttg)(seq id no:13)、(uug)(uug)(uug)(uug)(seq id no:14)等，其中括号表示组成重复，但没有任何结构意义。在一些实施方式中，非随机重复序列包括一个或多个部分重复，例如(ttg)(ttg)(ttg)(ttg)(t)(seq id no:15)或(uug)(uug)(uug)(uug)(u)(seq id no:16)。
[0206]
在一些实施方式中，第二区域包括非随机重复(a和g)序列。具体地，非随机重复序列可以包括直接重复或反向重复，或两者。因此，包括a和g核苷酸重复的这样的重复序列的实例包括(ag)(ga)(ag)(ga)(ag)(ga)(seq id no:17)、(ag)(ag)(ag)(ga)(ag)(ag)(seq id no:18)、(aag)(gaa)(gaa)(aag)(seq id no:19)、(aag)(aag)(aag)(aag)(seq id no:20)等，其中括号表示组成重复，但不具有任何结构含义。在一些实施方式中，非随机重复序列包括一个或多个部分重复，例如，(aag)(aag)(aag)(aag)(a)(seq id no:21)。
[0207]
第一群体的第一区域可以由如本文所述的聚(k)序列、如本文所述的第二聚(k)序列和聚(k)序列与第二聚(k)序列之间的接头组成，其中第二聚(k)序列包括(i)包含g和u/t核苷酸的随机序列，或(ii)非随机重复(g和u/t)序列。在一些实施方式中，第一区域可以由如本文所述的随机(g和u/t)聚(k)序列、如本文所述的第二聚(k)序列和聚(k)序列与第二聚(k)序列之间的接头组成。替代地，第一区域可由如本文所述的非随机重复(g和u/t)聚(k)序列、如本文所述的第二聚(k)序列和聚(k)序列与第二聚(k)序列之间的接头组成。在一些实施方式中，接头是例如非核苷酸接头诸如c-9接头或核苷酸接头如任意序列，例如长度约1-10个核苷酸。在一些实施方式中，聚(k)序列的长度为至少约6个残基，并且第二聚(k)序列的长度为至少约6个残基。
[0208]
第二群体的第一区域可以由如本文所述的聚(r)序列、如本文所述的第二聚(r)序列和聚(r)序列与第二聚(r)序列之间的接头组成，其中第二聚(r)序列包括(i)包含g和a核苷酸的随机序列，或(ii)非随机重复(g和a)序列。在一些实施方式中，第一区域可以由如本文所述的随机(g和a)聚(r)序列、如本文所述的第二聚(r)序列和聚(r)序列与第二聚(r)序列之间的接头组成。替代地，第一区域可由如本文所述的非随机重复(g和a)聚(r)序列、如本文所述的第二聚(r)序列和聚(r)序列与第二聚(r)序列之间的接头组成。在一些实施方式中，接头是例如非核苷酸接头诸如c-9接头或核苷酸接头如任意序列，例如长度约1-10个核苷酸。在一些实施方式中，聚(r)序列的长度为至少约6个残基，并且第二聚(r)序列的长度为至少约6个残基。
[0209]
可以合成非特异性捕获探针的实施方式以包括多种核酸构型中的任何一种，诸如标准dna或rna寡核苷酸，或包括一个或多个修饰键的寡核苷酸，其中糖部分具有取代(例如2’甲氧基或2’卤化物)或替代性构型(例如，锁定核酸(lna)或蛋白质核酸(pna)构型)中的一或多个位置。捕获探针的实施方式可以包括非核苷酸化合物作为接头(例如，c-9)，其连接捕获探针的随机聚合物和/或非随机重复片段。非特异性捕获探针的一些实施方式包括使用2
’‑
o-甲基修饰的rna残基合成随机聚合物部分的那些或含有lna构型中的一或多个残
基的那些。可以根据预期的靶核酸或要分离的靶核酸的类型来选择包括在非特异性捕获探针的寡核苷酸部分中的一种或多种构型。例如，具有包括2
’‑
o-甲基修饰的rna残基的随机聚合物区域的非特异性捕获探针可用于捕获rna靶标，而在随机聚合物区域中具有某些lna构型的非特异性捕获探针可用于捕获单链dna(ssdna)靶标。捕获探针的一些实施方式包括构型的组合(例如，lna和dna)，其可以是相邻的或通过接头连接。在一些实施方式中，第一区域由2
’‑
o-甲基修饰的rna残基组成。
[0210]
可以使用体外方法来合成非特异性靶捕获探针(例如，caruthers等人,酶学方法(methods in enzymology),第154卷，第287页(1987)；美国专利号5,252,723,bhatt；wo 92/07864,klem等人)。可以使用lna构型或包含此类结构组合的寡核苷酸中的标准rna碱基和键、dna碱基和键、具有2’甲氧基键的rna碱基、dna碱基来制备合成的寡核苷酸。可以合成寡核苷酸以包括非核苷酸间隔物(例如，c-9)或核酸类似物(例如，肌苷或5-硝基吲哚)。在一些实施方式中，捕获探针的一个或多个非特异性部分通常包含作为随机“k”残基(即，g或u/t碱基)或随机“r”残基(即，g或a碱基)的一个位置或一系列位置。在一些实施方式中，通过分别使用包含等量的g和u/t碱基或g和a碱基的混合物合成随机k和随机r残基。非特异性捕获探针的一些实施方式包括包含与靶核酸进行非特异性杂交的第一区域的5’部分以及包括包含sbp(例如，sbp或sbp3)第二区域的3’部分，其中sbp是dna“捕获尾部”序列，例如由dt
0-3
da
18-30
(seq id no:22)，诸如dt3da
30
(seq id no:23)或da
30
(seq id no:24)序列构成。捕获尾部分(有时也简称为尾部)允许捕获探针(带有或不带有结合的靶核酸)与附着在聚dt寡聚物(sbp2)上的固体载体缔合，并与靶捕获混合物的溶液相分离。将理解的是，任何“尾部”序列或非核酸特异性结合配偶体(sbp和/或sbp3)可以附接到非特异性捕获探针，并且载体(sbp2)上所选择的特异性结合配偶体是具有sbp和/或sbp3的特异性结合对的成员。
[0211]
非特异性捕获探针的sbp组分可以是与可作为固定探针的一部分的sbp2特异性结合的特异性结合对的任何成员。适合用作sbp和sbp2成员(或sbp3/sbp2成员)的特异性结合对的一些实施方式包括受体和配体对、酶和底物或辅因子对、酶和辅酶对、抗体(或抗体片段)和抗原对、糖和凝集素对、生物素和抗生物素蛋白或链霉亲和素、配体和螯合剂对、镍和组氨酸，以及完全或基本上互补的核酸序列。在一些实施方式中，sbp和sbp2(或sbp3/sbp2)成员是基本上互补的核酸序列，诸如互补均聚序列，例如捕获探针包括与连接到载体的互补固定的sbp2序列杂交的3’基本均聚sbp(和/或sbp3)序列。在一些实施方式中，sbp包括均聚序列。在一些实施方式中，sbp3包括均聚序列。其他实施方式使用非核酸结合对，诸如与作为sbp和sbp2成员(或sbp3/sbp2成员)的抗生物素蛋白或链霉亲和素特异性结合的生物素。
[0212]
在一些实施方式中，sbp和sbp3能够结合相同的sbp2，并且sbp和sbp3可以相同或不同。例如，sbp2可以是聚t序列，并且sbp和sbp3可以独立地是da
30
(seq id no:24)或dt3da
30
(seq id no:23)序列。在一些实施方式中，sbp和sbp3彼此相同。在一些实施方式中，sbp位于第一群体的第一区域的3’。在一些实施方式中，sbp3位于第二群体的第一区域的3’。在一些实施方式中，sbp和sbp3之一或两者与sbp2基本上互补。在一些实施方式中，sbp2包括聚dt序列。在一些实施方式中，sbp2包括dt
14
序列。
[0213]
固定的探针可以通过在靶捕获方法中使用的杂交条件下稳定的任何键与固体载体连接。在一些实施方式中，固体载体包括单分散颗粒，可以通过使用已知的方法(例如，离
心、过滤、磁吸引或其他物理或电化学分离)从混合物中取回所述单分散颗粒。在一些实施方式中，单分散颗粒是磁性微珠或磁性微颗粒。在一些实施方式中，使用磁吸引从混合物中取回颗粒。在一些实施方式中，将被捕获的靶核酸分离并浓缩在载体上，即，与初始样品中靶核酸的浓度相比，靶核酸被浓缩在载体上，这可以提高使用被捕获的核酸进行的后续测定步骤的灵敏度，诸如扩增测定步骤。
[0214]
非特异性靶捕获方法相对快速且易于实施，在一些实施方式中需要少于一个小时即可完成，而在一些实施方式中靶捕获反应仅需要温育5分钟。任选的步骤，诸如洗涤被捕获的核酸以进一步纯化核酸(例如，约另外20分钟)。
[0215]
在一些实施方式中，如本文所述的捕获混合物包括：
[0216]
(a)月桂基硫酸锂；
[0217]
(b)氢氧化锂；
[0218]
(c)所述两性离子磺酸缓冲剂；
[0219]
(d)所述c
2-6
二羧酸；和
[0220]
(e)蛋白酶k。
[0221]
在一些实施方式中，捕获混合物包括：
[0222]
(f)第一捕获探针群体，所述第一捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并且包括至少一个聚(k)序列，所述聚(k)序列包括包含g和u/t核苷酸的随机序列，或非随机重复(g和u/t)序列，或其组合；所述第二区域包括第一特异性结合配偶体(sbp)，其中所述sbp能够特异性结合第二特异性结合配偶体(sbp2)；
[0223]
(g)第二捕获探针群体，所述第二捕获探针群体包括第一区域和第二区域，所述第一区域的长度为至少约12个残基并包括聚(r)序列，所述聚(r)序列包括包含g和a核苷酸的随机序列、非随机重复(a和g)序列，或其组合；所述第二区域包括第三特异性结合配偶体(sbp3)，其中所述sbp3能够特异性结合sbp2；以及
[0224]
(h)包括固定于其上的sbp2的固体载体。
[0225]
在一些实施方式中，本公开涉及包括本文所述的捕获混合物的预混制剂，其中预混制剂不包括蛋白酶k，并且当所述制剂包括水时，所述组分以1.3倍的所列溶液浓度存在。
[0226]
在一些实施方式中，本公开涉及包括如本文所述的捕获混合物的活化的捕获混合物，其中所述捕获混合物包括蛋白酶k。在一些实施方式中，本公开涉及活化的捕获混合物，其通过将本文所述的预混制剂与蛋白酶k组合制备。在一些实施方式中，活化的捕获混合物中的蛋白酶k以约1-20mg/ml，或约1-5mg/ml，或约1-4mg/ml，或约1.5-3mg/ml，或约2mg/ml，或约3mg/ml，或约4mg/ml的浓度存在。在一些实施方式中，活化的捕获混合物通过以下来制备：将预混制剂与蛋白酶k溶液以约3:1至6:1，或约3:1至4:1，或约3.475:1(诸如139ml:40ml)的体积比组合，其中溶液中蛋白酶k的浓度为约4.5-20mg/ml，或约4.5-18mg/ml，或约5-15mg/ml，或约8-10mg/ml，或约9mg/ml，并且蛋白酶k具有约12.5-50u/ml，或约20-30u/ml，或约25u/ml的比活性。
[0227]
在一些实施方式中，本公开涉及包括如本文所述的捕获混合物或活化的捕获混合物和靶核酸的反应混合物。在一些实施方式中，反应混合物进一步包括内部对照和包含氢氧化锂的增强剂。在一些实施方式中，本公开涉及通过将本文所述的预混制剂、蛋白酶k和靶核酸组合而制备的反应混合物。在一些实施方式中，反应混合物通过将预混制剂、蛋白酶
k、内部对照、靶核酸和包含氢氧化锂的增强剂组合来制备。在一些实施方式中，增强剂中氢氧化锂的浓度为0.8m-3.5m，或约1.0m-2.75m，或约1.25m-2.5m，或约1.5m-2.0m，或约1.6m-1.8m，或约1.68m。在一些实施方式中，反应混合物包括蛋白酶k。在一些实施方式中，蛋白酶k以约0.4-2mg/ml，或约1mg/ml的浓度存在于反应混合物中。在一些实施方式中，反应混合物中的蛋白酶k具有约1-6u/ml，或约2.5u/ml的比活性。
[0228]
在一些实施方式中，靶核酸处于溶液相和/或与捕获探针缔合。在一些实施方式中，靶核酸与反应混合物中的靶捕获探针群体的成员缔合。在一些实施方式中，溶液相包括来自动物、环境、食物或工业来源的样品。在一些实施方式中，溶液相包括样品，该样品包括外周血、血清、血浆、脑脊液、痰、尿液或拭子样本。在一些实施方式中，其中靶核酸来源于外周血、血清或血浆。在一些实施方式中，靶核酸源自经过处理以将细胞内组分释放到所述溶液相中的细胞。
[0229]
本文公开的另一方面是一种试剂盒，包括：
[0230]
(a)包括如本文所述的捕获混合物的第一组分；和
[0231]
(b)包括氢氧化锂的第二组分。
[0232]
在本文公开的另一个方面是一种试剂盒，包括：
[0233]
(a)包括预混制剂的第一组分，其中所述预混制剂包括如本文所述的捕获混合物，所述预混制剂不包括蛋白酶k，并且当所述制剂包括水时，所述组分以1.3倍的所列溶液浓度存在；
[0234]
(b)包括氢氧化锂的第二组分；以及
[0235]
(c)包括蛋白酶k的第三组分。
[0236]
在一些实施方式中，第二组分包括浓度为约0.8m-3.5m，或约1.0m-2.75m，或约1.25m-2.5m，或约1.5m-2.0m，或约1.6m-1.8m，或约1.68m的氢氧化锂。在一些实施方式中，第三组分包括浓度为约4.5-20mg/ml，或约4.5-18mg/ml，或约5-15mg/ml，或约8-10mg/ml，或约9mg/ml的蛋白酶k，并且蛋白酶k具有约12.5-50u/ml，或约20-30u/ml，或约25u/ml的比活性。
[0237]
本文公开的另一方面是一种用于从样品中分离靶核酸的方法，所述方法包括：
[0238]
a.使如本文所述的捕获混合物或活化的捕获混合物与包含靶核酸的溶液接触以形成反应混合物；
[0239]
b.在允许第一群体的第一区域与靶核酸进行杂交并且允许sbp(以及sbp3，如果存在的话)与固定于所述载体上的所述sbp2进行缔合的条件下温育反应混合物，从而形成与溶液相接触的杂交复合物；以及
[0240]
c.从所述溶液相中分离出所述载体，从而将所述靶核酸与所述样品中的其他组分分离。
[0241]
在方法的一些实施方式中，步骤(a)包括将本文所述的活化的捕获混合物与内部对照、包括靶核酸的溶液和包括氢氧化锂的增强剂组合。在一些实施方式中，增强剂中氢氧化锂的浓度为0.8m-3.5m，或约1.0m-2.75m，或约1.25m-2.5m，或约1.5m-2.0m，或约1.6m-1.8m，或约1.68m。在一些实施方式中，捕获混合物或活化的捕获混合物不包括固体载体，并且步骤(a)包括将捕获混合物或活化的捕获混合物与固体载体组合。在一些实施方式中，该方法包括将缺乏蛋白酶k的捕获混合物与蛋白酶k混合以形成活化的捕获混合物。
[0242]
在一些实施方式中，靶核酸来源于包含细胞的样品，并且该方法包括在接触步骤之前处理细胞以将细胞内组分释放到所述溶液中。在一些实施方式中，处理包括用洗涤剂处理样品。
[0243]
在一些实施方式中，在允许第二群体的第一区域与靶核酸进行杂交并且允许sbp3与固定于载体上的sbp2进行缔合的条件下进行温育，从而形成与溶液相接触的杂交复合物。
[0244]
在其中捕获探针与靶核酸非特异性杂交并与固定的sbp2特异性结合的温育后，通过将带有附着复合物的固体载体与溶液相分离，将由固定的sbp2、捕获探针和靶核酸构成的复合物与其他样品组分分离。在一些实施方式中，反应混合物还包括包含聚(k)捕获探针和靶核酸的复合物和/或包含聚(r)捕获探针和靶核酸的复合物。然后，可以任选地执行一个或多个洗涤步骤以去除可能已经附着到复合物、复合物的组分或固体载体上的非核酸样品组分。在一些实施方式中，进行以下洗涤步骤：用基本上水性的洗涤溶液洗涤附着于载体的复合物，所述洗涤溶液将杂交复合物保持在固体载体上，然后将附着于固体载体的复合物与包含其他样品组分的洗涤溶液分离。可以在进行随后的测定步骤之前将被捕获的靶核酸与其他捕获复合物组分中的一个或多个分离，或者可以将附着于固体载体的捕获复合物直接用于后续一个或多个步骤。后续步骤包括，例如，使用检测探针对捕获的靶核酸进行检测，和/或对包含在捕获的靶核酸中的一或多个序列进行体外扩增。
[0245]
在一些实施方式中，非特异性靶捕获涉及在基本上水性的溶液中和允许捕获探针与混合物中的靶核酸非特异性地杂交的条件下，将含有或疑似含有靶核酸的样品与本文所述的包括非特异性捕获探针的捕获混合物混合。这样的条件可以涉及短时间内的高温(例如60℃约15min)，然后在室温下温育(例如约20-25℃，约10至90min)。替代地，整个温育可以在室温下进行并且基本上时间较短(例如，约5min)。捕获混合物还包含固定于固体载体上的sbp2，该固相载体通过sbp-sbp2特异性结合对特异性结合非特异性捕获探针。sbp2可以与捕获探针同时或在捕获探针与样品混合之前或之后被引入混合物中。在一些实施方式中，在将捕获探针与样品一起温育之后，将固定探针引入样品与非特异性捕获探针的混合物中，以使捕获探针和靶核酸在捕获探针与固定探针结合之前在溶液相中非特异性地杂交。从而，将固定的sbp2与捕获探针同时引入混合物中以使混合步骤最小化，这对于自动化系统特别有用。在使用带有尾部序列的捕获探针作为sbp的实施方式中，捕获探针在核酸杂交条件下特异性结合固定互补序列(sbp2)，以允许靶核酸非特异性结合捕获探针并通过固定的sbp2连接至固体载体，使靶核酸与其他样品组分分离。同样的原理也适用于由sbp3/sbp2结合对介导的捕获。
[0246]
可以使用本文所述的靶捕获探针群体、活化的捕获混合物、试剂盒和方法从同一样品中同时分离出多个(例如，两个或多个)靶核酸，因为非特异性捕获探针与样品中存在的一种以上核酸结合。在一些实施方式中，可以设计和选择非特异性捕获探针以用于从含有核酸(例如，dna和rna)混合物的样品中优先捕获特定类型的核酸(例如，rna)。在一些实施方式中，通过以下将非特异性捕获探针从混合物中选择性地移除：设计捕获探针以选择性地结合引入到混合物中的不同的固定的特异性结合配偶体，形成特异性捕获复合物，以及然后选择性地分离每一种包含捕获探针和靶核酸的复合物类型。例如，优先与dna和rna混合物中的rna结合的第一捕获探针群体可以通过sbp与固体载体上的固定的sbp2结合，以
及优先与dna和rna混合物中的dna结合的第二捕获探针群体可以通过sbp3与固体载体上的固定sbp2结合。然后，通过选择性地将第一载体和第二载体及其附着复合物去除到测定系统的不同区域或在测定期间的不同时间下，可以将样品的rna组分与同一样品的dna组分选择性地分离。
[0247]
在示例性实施方式中，通过将靶核酸或其溶液与本文所述的捕获混合物或活化的捕获混合物混合来制备反应混合物。将反应混合物在合适的温度下温育以允许形成包括来自第一群体的捕获探针、靶核酸和固定的sbp2的捕获复合物。在一些实施方式中，捕获混合物或活化的捕获混合物包括第二捕获探针群体，并且温育允许形成包括来自第二群体的捕获探针，靶核酸(其可以与第一靶核酸相同或不同)和固定的sbp2的第二捕获复合物。然后将固体载体上的一种或多种捕获复合物从溶液相分离。任选地洗涤载体上的一种或多种捕获复合物以除去溶液相的剩余部分，并将载体上的一种或多种捕获复合物从洗涤溶液分离。检测与固体载体缔合的一种或多种靶核酸，以提供与其他样品组分分离的靶核酸的量的定性检测或定量测量。将理解的是，捕获混合物中可以包括另外的寡核苷酸，诸如辅助寡核苷酸(美国专利号5,030,557,hogan等人)和/或扩增引物。
[0248]
可以使用本文所公开的捕获混合物、活化的捕获混合物和试剂盒从各种类型的样品中分离靶核酸。在一些实施方式中，样品来自动物来源(例如，人、非人脊椎动物、非人哺乳动物)、环境来源(例如，水、植物、土壤、废物)、食物来源(例如，食品、食物制备区域)、废物来源或工业来源(例如生物反应器、细胞培养皿、制药器皿、生物试剂、药物试剂)。示例性动物或人来源包括外周血(全血)、血清、血浆、脑脊髓液、痰、尿液或拭子标本(例如，鼻咽、口腔、伤口、阴道或阴茎分泌物)。在一些实施方式中，样品来自动物、环境、食物、废物或工业来源。在一些实施方式中，样品包括外周血、血清、血浆、尿液、脑脊液、痰、尿液或拭子样本。在一些实施方式中，样品包括细胞裂解物。因此，在一些实施方式中，反应混合物进一步包括样品(诸如前述任一种)。
[0249]
靶核酸可以是病毒、原核、真核或合成来源或其组合，并且可以是dna、rna、修饰的核酸或其组合。在一些实施方式中，靶核酸包括dna。在一些实施方式中，靶核酸包括rna。在一些实施方式中，靶核酸包括病毒核酸。在一些实施方式中，靶核酸包括原核核酸。在一些实施方式中，靶核酸包括真核核酸。在一些实施方式中，靶核酸包括合成核酸。在一些实施方式中，靶核酸包括dna、rna、病毒核酸、细菌核酸、真核核酸和/或合成核酸的组合。
[0250]
可以通过使用任何检测核酸的方法来检测捕获的靶核酸。例如，可以通过使用选择性地结合一般核酸或选择性地结合特定形式的核酸的染料来检测捕获的核酸。可以通过结合与捕获的核酸中的靶序列进行特异性杂交的检测探针来检测特异性核酸，或者可以通过体外核酸扩增处理捕获的核酸中的靶序列以扩增捕获的核酸的部分，随后检测所述部分。在一些实施方式中，通过将样品中的靶核酸与特异性检测探针进行杂交来对靶核酸进行标记。检测探针杂交可以发生在靶捕获之前、与靶捕获同时发生和/或发生在靶捕获之后。通过使用在别处详细描述的众所周知的程序，用吖啶酯(ae)化合物标记示例性形式的检测探针，所述化合物在均相系统中产生化学发光信号(表示为相对光单位或“rlu”)(美国专利号5,658,737，参见第25栏,第27-46行，和nelson等人,1996,生物化学(biochem)35:8429-8438,8432)。
[0251]
该描述和示例性实施方式不应被视为限制。出于本说明书和所附权利要求的目
的，除非另外说明，否则在所有情况下，应将表示数量、百分比或比例的所有数字以及在说明书和权利要求中使用的其他数值理解为在所有情况下由术语“约”修饰至它们还没有如此修饰的程度。因此，除非有相反的指示，否则以下说明书和所附权利要求中列出的数字参数是近似值，其可以根据试图获得的期望特性而变化。至少，并且并非试图将等同原则的应用限制于权利要求的范围，每个数字参数至少应根据所报告的有效数字的数字并通过应用普通的舍入技术来解释。
[0252]
实施例
[0253]
提供以下实施例以说明某些公开的实施方式，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。
[0254]
实施例1.捕获混合物制剂。
[0255]
将捕获混合物制剂1：聚dt
14
磁性颗粒(sera-mag磁性羧化物-改性的sigma-millipore,cat.号44152105050350或内部制备的类似的颗粒(200mg)升温至室温8至48h。将氢氧化锂一水合物(28.5g)添加到混合容器中的水(0.79l)中，并将所得混合物搅拌至少5min。将月桂基硫酸锂(30.0g)添加到混合容器中。将所得混合物混合直至月桂基硫酸锂完全溶解。一旦没有未溶解的固体残留，将hepes(188.0g，游离酸)添加到混合容器中并将所得混合物混合至少5min。将琥珀酸(27.2g)添加到混合容器中，并将所得混合物混合至少5min。所得混合物的ph在7.3至7.5的范围内。将捕获探针(聚(k)
18
)(0.666mg)解冻并添加到混合容器中。将所得混合物混合至少45min，以及然后通过在biostation上测试ph值和电导率来分析均匀性。过滤所得混合物。将消泡剂(foam ban ms-575；0.5ml)用一部分过滤的混合物稀释并混合直到消泡剂均匀分散。在搅拌下将稀释的消泡剂添加到过滤混合物的剩余部分中。将所得本体混合物混合至少5min。将聚dt
14
磁性颗粒以10mg/ml的浓度悬浮，并将悬浮液添加到本体混合物中。将所得捕获混合物(1l)混合30至60min。将捕获混合物在18至25℃的密闭容器中储存最长达14天。
[0256]
使用上述方法，使用表1中列出的试剂和量制备了其他制剂。本体混合物各为1l的总体积。计算每种制剂组合物达到1l总体积所需的水量。在具有蛋白酶k的制剂中，用1.3倍浓度的其他材料制备预混制剂，最后将蛋白酶k的浓缩溶液(例如，9mg/ml，约25u/ml比活性)添加到预混制剂，其体积足以提供1.0倍浓度的活化的捕获混合物，其中蛋白酶k的浓度如表1所示。
[0257]
例如，对于制剂组合物17，使聚dt
14
磁性颗粒(780mg)升温至室温8至48h。将氢氧化锂一水合物(37.05g)添加到混合容器中的水(0.65l)中，并将所得混合物搅拌至少5min。将月桂基硫酸锂(39.0g)添加到混合容器中。将所得混合物混合直至月桂基硫酸锂完全溶解。一旦没有未溶解的固体残留，将hepes、游离酸(244.4g)添加到混合容器中并将所得混合物混合至少5min。将琥珀酸(35.36g)添加到混合容器中，并将所得混合物混合至少5min。所得混合物的ph在7.3至7.5的范围内。将捕获探针((聚(k)
18
)(4.762mg)和聚(r)
18
(4.762mg))解冻并添加到混合容器中。将所得混合物混合至少45min，并在biostation上测试混合物的ph值和电导率。过滤所得混合物。将消泡剂(foam ban ms-575；0.62ml)用一部分过滤的混合物稀释并混合直到消泡剂均匀分散。在搅拌下将稀释的消泡剂添加到过滤混合物的剩余部分中。将所得本体混合物混合至少5min。将聚dt
14
磁性颗粒以10mg/ml的浓度悬浮，并将悬浮液添加到本体混合物中。将所得预捕获混合物(0.78l)混合30至60min。将等份的预捕获
混合物(139ml)与9mg/ml蛋白酶k(约25u/ml；40ml)混合以提供179ml活化的捕获混合物。活化的捕获混合物中试剂的最终浓度见表1，条目17。
[0258]
表1.制剂组合物(列出的质量对应于1l的体积，1.0倍浓度)。
[0259][0260]alioh
·
h2o的质量
[0261]b将制剂组合物2的试剂以一半体积在水中混合，并在所有试剂混合后稀释至1l。在添加foam ban之前过滤混合物。
[0262]
实验中使用的(k)
18
和(r)
18
捕获探针包括靶杂交序列(随机(k)
18
和(r)
18
，其中核苷酸残基包含2
’‑
甲氧基核糖)，并且捕获尾接连接到靶杂交序列((k)
18
或(r)
18
序列)的3
′
末端，由此形成如下所示的连续核酸序列。
[0263]
(k)
18
捕获探针序列：
[0264]5’‑
kkkkkkkkkkkkkkkkkktttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’(seq id no:27)
[0265]
(r)
18
捕获探针序列：
[0266]5’‑
rrrrrrrrrrrrrrrrrrtttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’(seq id no:28)
[0267]
聚a核苷酸的链段被包括以允许捕获探针与涂覆有聚t核苷酸链段的磁性微颗粒进行杂交。捕获探针的一端与磁性微颗粒进行杂交，并且捕获探针的另一端与靶核酸进行
非特异性杂交。通过施加磁场，将缔合有捕获探针和靶核酸的微颗粒从溶液中分离出来。
[0268]
实施例2.全血处理
–
lls浓度的变化
[0269]
该实验用于评估lls浓度对样品裂解的影响。
[0270]
使用全血(1000μl)(a)未进行预处理或(b)使用0.1g(100mg/ml)额外igg进行预处理后。用全血样品(a)或(b)(360μl)处理制剂组合物1(3％lls)和2(10％lls)(450μl)。向每个样品中添加126μl的水性lioh(1.68m)作为增强剂。每个样品管都加盖，以及将样品在轨道摇床上混合(约200rpm，1分钟)。将样品在水浴中在43℃下温育4min，然后在63℃下温育29min，以及然后在43℃下温育15min。测试样品1(a)产生可见的白色凝块。测试样品1(b)(带有igg)产生完全凝结的样品。根据目测，最终lls浓度为10％的样品，没有额外igg的显示出红色小团粒，并且带有igg的显示出显著的凝结。制剂组合物2中的额外lls显著降低了在具有制剂组合物1的全血样品中观察到的凝血。
[0271]
实施例3.全血处理—lls和蛋白酶k的变化。
[0272]
这些实验用于评估样品处理顺序和蛋白酶k活性对样品裂解的影响。
[0273]
测试1.将全血用igg(100mg/ml)处理并涡旋混合。将制剂组合物3-6(450μl)添加到igg处理的全血(360μl)和126μl水性lioh(1.68m)增强剂。每个样品管都盖上盖子，以及将样品在轨道摇床上摇晃(约200rpm，1min)。将样品在水浴中在43℃下温育8min，然后在62℃下温育29min，以及然后在43℃下温育15min。通过施加磁场将磁性微粒和结合的核酸从溶液中分离出来，从而将上清液从被捕获的靶：捕获探针：磁性微粒组合中去除。然后将磁性微粒重悬在洗涤溶液(10mm hepes、150mm nacl、6.5mm naoh、1mm edta、0.3％(v/v)乙醇、0.02％(w/v)对羟基苯甲酸甲酯、0.01％(w/v)对羟基苯甲酸丙酯以及0.1％(w/v)月桂基硫酸钠，ph 7.5)。对重悬的微粒再进行一轮分离，除去上清液，并将其重悬在洗涤溶液中。分离并去除第二轮洗涤溶液后，将微粒在50μl洗脱缓冲液(5mm tris在含防腐剂的水中)中温育，所述洗脱缓冲液破坏核苷酸杂交。通过施加磁场分离磁性颗粒，并回收含有洗脱物的核酸。
[0274]
测试2.将制剂组合物3-6(450μl)与igg处理的全血(360μl)混合，并在定轨振荡器上混合(12hz,1.5min)。将样品在43℃下温育8min，然后用126μl水性lioh(1.68m)增强剂处理，在轨道振荡器上混合(1min)，以及然后在62℃下温育29min，以及然后在43℃下温育15min。如上所述处理磁性珠粒并收集捕获的核酸。
[0275]
测试1和测试2中的每一个都在视觉检查上产生了可比较的结果(未显示)，凝血水平按以下顺序(凝血最少到最多)：a)10％lls/蛋白酶k；b)3％lls/蛋白酶k；c)10％lls；d)3％lls。
[0276]
实施例4：靶核酸捕获—磁性珠粒(sbp)浓度的变化。
[0277]
测试1.用100mg/ml的igg处理全血样品并如本文所述进行处理。向制剂组合物7和8(450μl)添加内部对照(质粒和体外转录物的混合物)。将所得混合物用全血样品(200μl)处理，并且所得混合物最后用1.68m(126μl)的水性lioh增强剂处理。将反应混合物温育并如实施例3中所述分离捕获的靶核酸。
[0278]
如下表2所示，使用靶向c1orf43的寡聚物通过实时pcr分析每种含有核酸的洗脱液的基因组dna回收率。作为对照，在代表100％回收率的拷贝水平下测定了未进行靶捕获的纯化的dna。内部对照低聚物和内部对照靶标也用于排除假阴性结果(数据未显示)。
[0279]
表2.c1orf43寡聚物序列
[0280]
寡聚物序列正向引物tgtttgggtttagggcatct(seq id no:29)反向引物agttattccacattcaccaac(seq id no:30)探针ccacttgacctcccaccagttcc(seq id no:31)
[0281]
根据实时pcr扩增曲线超过固定阈值(ct)的循环数推断出捕获的c1orf43 dna的拷贝水平。表3列出了ct值并估计了使用不同制剂组合物的c1orf43靶核酸的回收百分比。通过比较实时pcr曲线超过固定阈值(ct)的循环数，可以推断出回收率在两种测试条件之间的相对差异。δct(δct)对于给定的条件被定义为加标对照的ct减去该条件的ct。正的δct表明在给定条件下回收的样品中核酸的理论量小于100％。
[0282]
表3.
[0283][0284]
与制剂组合物7(200mg珠粒)相比，制剂组合物8(600mg珠粒)提供了更低的ct值和更高的c1orf43靶核酸的靶回收率百分比。
[0285]
测试2.如测试1中所述处理全血样品，并如本文所述使用制剂组合物8和9、1.68m的lioh增强剂和下表4中指明的靶向水痘-带状疱疹病毒(vzv)orf 28的低聚物进行靶标捕获。
[0286]
表4.vzv orf 28寡聚物序列
[0287]
寡聚物序列正向引物ccaaaactaacaaagccggga(seq id no:32)反向引物gtgataactttcacccggagttg(seq id no:33)探针cgagtggtagcgtctacccgacc(seq id no:34)
[0288]
根据实时pcr扩增曲线超过固定阈值(ct)的循环数推断出捕获的vzv orf 28的拷贝水平。表5列出了ct值并估计了使用不同制剂组合物的vzv orf 28靶核酸的回收百分比。通过比较实时pcr曲线超过固定阈值(ct)的循环数，可以推断出回收率在两种测试条件之间的相对差异。δct(δct)对于给定的条件被定义为加标对照的ct减去该条件的ct。正δct表明在给定条件下回收的样品中核酸的期望量小于100％。
[0289]
表5.
[0290][0291]
与制剂组合物9(2000mg珠粒)相比，制剂组合物8(600mg珠粒)对vzv orf 28靶核酸提供更早的ct和更高的回收率百分比。
[0292]
实施例5.靶dna/rna核酸捕获
–
lioh增强剂浓度的变化。
[0293]
测试1.在全血(wb)样品(每个2.2ml)中加标浓度为100tcid
50
/ml的巨细胞病毒ad-169、mrc-5(zeptometrix，“oc-cmv”)，并将混合物摇动15min。向制剂组合物18(450μl)添加内部对照，并用wb样品(200μl)处理所得混合物。用1.68m或3.3m水性lioh增强剂(126μl)处理所得混合物。如实施例3所述将反应混合物温育并分离捕获的核酸。
[0294]
如下表6所示，使用靶向oc-cmv的寡聚物通过实时pcr分析每种含有核酸的洗脱液的基因组dna回收率。作为对照，在代表100％回收率的拷贝水平下测定了未进行靶捕获的纯化的dna。内部对照低聚物和内部对照靶标也用于排除假阴性结果(数据未显示)。
[0295]
表6.oc-cmv寡聚物序列
[0296]
寡聚物序列正向引物cagatacactatagccgccg(seq id no:35)反向引物ccatggagctggagtgtctaaag(seq id no:36)探针cgtggactccgccagtaacacgtt(seq id no:37)
[0297]
根据实时pcr扩增曲线超过固定阈值(ct)的循环数推断出捕获的oc-cmv dna的拷贝水平。表7列出了使用不同增强剂浓度的oc-cmv靶核酸的ct值。通过比较实时pcr曲线超过固定阈值(ct)的循环数，可以推断出回收率在两种测试条件之间的相对差异。δct(δct)对于测试条件(3.3m增强剂)定义为测试条件的ct减去基线条件的ct(本实验中为1.68m)。正的δct表示给定条件下回收的少于基线条件下的回收的量。
[0298]
表7.
[0299]
入口增强剂lioh(m)平均ctδct11.6831.6 23.339.68.0
[0300]
使用较低lioh浓度的增强剂(1.68m与3.3m)增加的dna回收率。
[0301]
测试2.将全血样品(450μl，在1350μl te缓冲液中按1:3稀释)、血浆样品和血清样品按上述方法处理，并加标rna或dna序列。如本文所述，用制剂组合物12(450μl；28.5glioh；600mg珠粒)和浓度为1.68m、1.5m、1.3m和1.0m的lioh增强剂(126μl)处理样品。如实施例3所述将反应混合物温育并分离捕获的核酸。
[0302]
如下表8和9所示，使用靶向加标rna和dna序列的寡聚物，通过实时pcr分析含有核酸的洗脱液中加标序列的回收率。
[0303]
表8.用于扩增和检测加标rna的寡聚物序列
[0304]
寡聚物序列正向引物aggtcggtactaacatcaag(seq id no:38)反向引物cacgttgtctggaagtttg(seq id no:39)探针tagatggccgtctgtcgtatcca(seq id no:40)
[0305]
表9.用于扩增和检测加标dna的寡聚物序列
[0306]
寡聚物序列正向引物atggtcaattagagacaaag(seq id no:41)反向引物cgttcactattggtctctgc(seq id no:42)探针cggaatcacaagtcaatcatcgcgca(seq id no:43)
[0307]
实时pcr扩增曲线越过固定阈值(ct)的循环数被确定为各种测试条件下捕获效率的量度。表10和11列出了针对不同增强剂浓度确定的ct值。
[0308]
表10.rna结果
[0309][0310]
表11.dna结果
[0311][0312]
将lioh增强剂的浓度降低到1.5m或1.3m不会影响dna检测水平。对于rna ic检测，将lioh增强剂的浓度降低至1.5m或1.3m不会显著影响全血或血浆样品的rna检测水平，但会影响血清样品的检测水平。血浆样品的rfu受较低的lioh增强剂浓度影响，但对全血或血清样品没有观察到显著影响(数据未显示)。
[0313]
实施例6.目标核酸捕获—血浆、血清和全血样品中捕获混合物和增强剂中lioh浓度的变化。
[0314]
将血浆、血清和全血样品解冻并在te缓冲液中按1:3稀释。如上所述，样品被处理并加标rna或dna序列，并用制剂组合物12和13(28.5g和19g lioh；600mg磁性珠粒)和浓度为1.68m和1.5m的lioh增强剂处理，如上所述的。如实施例3所述将反应混合物温育并分离捕获的核酸。
[0315]
如实施例5，测试2中所述，使用靶向内部对照序列的寡聚物测定含有核酸的洗脱液中的加标序列的回收率。
[0316]
实时pcr扩增曲线越过固定阈值(ct)的循环数被确定为各种测试条件下捕获效率的量度。表12和13列出了针对不同增强剂浓度确定的ct值。通过比较实时pcr曲线超过固定阈值(ct)的循环数，推断出回收率在1.68m lioh条件与其他条件之间的相对差异。测试条件的δct(δct)被定义为测试条件的ct减去基线条件的ct(28.5g lioh；每种样品类型1.68m lioh)。正的δct表示给定条件下回收的少于1.68m lioh条件下回收的量。
[0317]
表12.dna结果
[0318][0319]
表13.rna结果
[0320][0321]
随着制剂或增强剂中lioh浓度的增加，ct值最多可提高1ct。δct值之间的细微差别和平均ct值的明显差异是由于舍入误差造成的。
[0322]
实施例7.靶核酸捕获—改变igg预处理和蛋白酶k浓度。
[0323]
如上所述，用0、60、80或100mg/ml igg处理血浆样品。如上所述，将所得混合物用制剂组合物14-16随后用1.68m的lioh增强剂处理，并且分离捕获的靶核酸。
[0324]
如实施例5，测试2中所述，使用寡聚物通过实时pcr分析含有核酸的洗脱液中加标的dna的回收率。
[0325]
实时pcr扩增曲线越过固定阈值(ct)的循环数被确定为各种测试条件下捕获效率的量度。表14列出了针对不同条件确定的ct值。通过比较实时pcr曲线超过固定阈值(ct)的循环数，可以推断出回收率在两种测试条件之间的相对差异。给定条件的δct(δct)被定
义为每种igg浓度的3mg/ml或4mg/ml蛋白酶k实验的ct减去相同igg浓度下2mg/ml蛋白酶k实验的ct。正的δct表明，给定条件的回收低于在相同igg浓度下，2mg/ml蛋白酶k实验中回收的量。
[0326]
表14.dna结果
[0327][0328]
所有样品的ct标准偏差在1个ct单位以内，用较高浓度igg处理的样品的标准偏差较高，表明从这些样品中获得的pcr结果的可变性增加，可能是由于这些样品的可变性。
[0329]
对于大多数样品，将蛋白酶k浓度从2增加到3或4mg/ml不会产生ct的统计学显著变化或在任一方向上超过一个单位的δct。