一种人参皂苷多西他赛脂质体、其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及一种复方人参皂苷多西他赛脂质体、其制备方法和应用；进一步公开了一种高效低毒的注射用复方人参皂苷多西他赛脂质体、其制备方法和应用。


背景技术：

2.脂质体是一种定向载药系统，属于靶向给药系统的一种特殊剂型，它可以将药物包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒类似于生物膜结构中双分子层微小囊泡，进入人体内主要被网状内皮系统吞噬，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在靶向组织中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。
3.本发明是在cn201610693884.2、cn201811447245.3和cn201811447243.4等中国发明申请专利的基础上进行的技术创新。上述三篇申请专利都公开了以人参皂苷为膜材的脂质体在包载紫杉醇等化疗药物之后，其相关脂质体质量稳定、药效显著等技术优势。
4.cn201610693884.2公开了一种以人参皂苷rg5及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用，处方中除了包括磷脂、皂苷、药物、冻干保护剂外，还可进一步包括胆固醇、抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠等其他辅料。
5.cn201811447245.3公开了一种以人参皂苷rh5h及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用，该专利在cn201610693884.2基础上，进一步解决了人参皂苷的溶血性问题。同样，处方中除了包括磷脂、皂苷、药物、冻干保护剂外，还可进一步包括胆固醇、抗氧化剂、大豆油和/或油酸钠等其他辅料。
6.cn201811447243.4公开了一种以人参皂苷rg3及其衍生物为膜材的空白脂质体和应用。该专利将rg3、rh2等皂苷通过超微粉等技术手段，解决了人参皂苷在氯仿中的溶解度问题，从而解决了rg3和rh2等人参皂苷必须在氯仿中成膜的难题，制备得到了质量符合标准的rg3类脂质体。
7.上述现有技术仍存在一些不足的地方，例如部分方案中脂质体生产均质步骤所需压力较大，滤膜除菌过滤的速度慢，截留率高，产品收率明显较差；需要添加2-6倍量的大豆油。但是由于大豆油的添加，又不利于制剂冻干，影响药物的长期保存。
8.复方制剂的核心是药物在体内的协同相互作用，并能显著提高药物临床治疗效果。复方制剂各功能组分合理的比例范围是构成复方制剂的核心，尤其是复方脂质体在功能组分发生变化而引起的药物协同、体内药代、体内组织分布、药效等改变，均鲜有人涉及。因此，针对注射用复方人参皂苷多西他赛脂质体(以下简称“ginposome-dtx”或“ginposome-ctx”)，在主药“多西他赛”已确定，如何选择最合适的“协同作用药物兼辅料”人参皂苷和关键辅料“磷脂”及其相关比例，制备出配伍合理、粒径小、质量稳定、药效和毒性均达到最佳效果，使得本发明的药物和关键辅料特定比例的组合物具有创新性和唯一性，具有十分重要的意义。
9.处方筛选中，药物、磷脂、皂苷、冻干保护剂和制备工艺等诸多因素中，任何一个因素的变化都将对产品的质量、药效和安全性产生致命的影响。例如增加皂苷与紫杉醇的质
量比，能增加复方脂质体的质量稳定性和协同抗肿瘤效果，增加对肿瘤组织的靶向性分布，但也会增加皂苷在人体内的累积毒性并造成不可控器官损伤；合适的皂苷与紫杉醇的质量比，对该类型脂质体的稳定性、主动靶向性、药效学和安全性有非常重要的关联性。同时，选择不同的冻干保护剂，对脂质体冻干过程中脂质双层结构的不受破坏和冻干药物复溶后恢复脂质体的特性有至关重要的作用。例如，在冻干保护剂的选择中，不同冻干保护剂对冻干曲线具有不同影响，尤其是在复方脂质体的共溶点、是否塌陷、脂质体复溶后是否显著改变、一次冻干温度和时间设定、冻干总时间长短等诸多方面具有重要影响。
10.药品的安全性和有效性是药品的两个基本属性，缺一不可，药品的审批和使用都是基于两者之间的风险收益比来考量，尤其是改良型新药，其核心就是提高有效性和安全性。
11.在毒理学研究中，制剂学研究起着至关重要的作用，尤其是处方比例和制备工艺的选择对急性毒性、长期毒性和各个功能器官的累积毒性的各个影响，都将直接决定着该复方脂质体是否符合新药申报要求。
12.可见，上述脂质体处方膜成分中的磷脂、人参皂苷、多西他赛和冻干保护剂糖类成分的最佳比例范围对所构成的复方脂质体的良好药学稳定性、体内分布、药效学和毒理学等性质具有重要作用。但是，这个最佳比例，现有技术未给出任何上述组分及比例以及工艺与药理活性、药代及毒理之间的推导关系。由于涉及的变量多，其筛选必须通过大量实验和创造性劳动的付出。
13.因此，如何选择一个最佳的复方药物配伍，如何制定最佳的制备工艺，以便生产出一种药效更好、毒性更低，质量和其他指标都能符合药品要求的注射用复方人参皂苷多西他赛脂质体，以便符合药品申报要求，需要大量的研究工作和技术攻关。


技术实现要素：

14.本发明所要解决的技术问题是针对现有多西他赛脂质体存在的不足，而提供一种(复方)人参皂苷多西他赛脂质体、其制备方法和应用；其性质稳定、粒径小、药物包封率高、体内相容性良好、体内释药良好、药效更好、毒性更低、配伍合理；且其具有较好制备工艺，制备条件易于实现，利于产业化；实现了制备工艺与产品性能结合的优化。
15.本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题。
16.本发明提供了一种(复方)人参皂苷多西他赛脂质体(简称“ginposome-dtx”或“ginposome-ctx”)，其包括如下质量分数的组分：8-18份磷脂、1-1.5份人参皂苷、1份多西他赛及15-35份冻干保护剂；所述人参皂苷多西他赛质体不含有胆固醇、大豆油、油酸钠中的一种或多种。
17.在本发明的某一方案中，所述人参皂苷多西他赛脂质体，其由如下质量分数的组分组成：8-18份磷脂、1-1.5份人参皂苷、1份多西他赛及15-35份冻干保护剂。
18.在本发明的某一方案中，所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化磷脂和脑磷脂中的一种或多种，或含有0.01-10％的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(mpeg2000-dspe)的蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化磷脂和脑磷脂中的一种或多种，优选蛋黄卵磷脂和/或大豆磷脂，更优选蛋黄卵磷脂。
19.在本发明的某一方案中，所述的多西他赛与所述的磷脂的质量比可为1:8-12，例
如1:10；例如，所述的多西他赛与蛋黄卵磷脂的质量比为1:10。
20.在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷可为20(s)-人参皂苷rg3、人参皂苷伪rg3、20(s)-人参皂苷rh2、伪人参皂苷gq、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1和人参皂苷rp1中的一种或多种，优选20(s)-人参皂苷rg3和/或20(s)-人参皂苷rh2，更优选20(s)-人参皂苷rg3。
21.在本发明的某一方案中，所述的多西他赛与所述的人参皂苷的质量比可为1:1或1:1.5。
22.在本发明的某一方案中，所述的多西他赛与所述的20(s)-人参皂苷rg3的质量比为1:1；或，所述的多西他赛与所述的20(s)-人参皂苷rg3的质量比可为1:1.5；或，所述的多西他赛与所述的20(s)-人参皂苷rh2的质量比可为1:1；或，所述的多西他赛与所述的20(s)-人参皂苷rh2的质量比为1:1.5。
23.在本发明的某一方案中，所述的冻干保护剂可为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种，优选葡萄糖。
24.在本发明的某一方案中，所述的冻干保护剂与所述的多西他赛的质量比可为20-35:1；例如25-35:1，又例如25:1、30:1或35:1。例如，所述葡萄糖与所述的多西他赛的质量比为25:1。
25.在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷多西他赛脂质体粒径d90≤150nm，包封率≥98％。
26.在本发明的某一方案中，所述人参皂苷的hplc纯度≥99％。
27.在本发明的某一方案中，所述的人参皂苷多西他赛脂质体包括如下质量分数的组分：10份磷脂、1份或1.5份人参皂苷、1份多西他赛及25份冻干保护剂。
28.在本发明的某一方案中，所述人参皂苷多西他赛脂质体可包括如下质量分数的组分：
29.10份磷脂、1份20(s)-人参皂苷rg3、1份多西他赛及25份冻干保护剂；
30.或，10份磷脂、1.5份20(s)-人参皂苷rh2、1份多西他赛及25份冻干保护剂；
31.或，10份磷脂、1份20(s)-人参皂苷rg3、1份多西他赛及30份冻干保护剂；
32.或，10份磷脂、1.5份20(s)-人参皂苷rh2、1份多西他赛及30份冻干保护剂。
33.在本发明的某一方案中，所述人参皂苷多西他赛脂质体可包括如下质量分数的组分：
34.10份蛋黄卵磷脂、1份20(s)-人参皂苷rg3、1份多西他赛及25份葡萄糖；
35.或，10份蛋黄卵磷脂、1.5份20(s)-人参皂苷rh2、1份多西他赛及25份葡萄糖。
36.或，10份蛋黄卵磷脂、1份20(s)-人参皂苷rg3、1份多西他赛及30份葡萄糖。
37.或，10份蛋黄卵磷脂、1.5份20(s)-人参皂苷rh2、1份多西他赛及30份葡萄糖。
38.本发明还提供了一种空白脂质体，其包括如下质量分数的组分：8-18份磷脂、1-2份人参皂苷和20-35份冻干保护剂；所述脂质体不含有胆固醇、大豆油、油酸钠中的一种或多种。
39.在本发明的某一方案中，所述空白脂质体可以负载有药物活性物质，优选地，所述药物活性物质可以为紫杉烷类衍生物；例如紫杉醇和/或多西他赛；又例如多西他赛。
40.在本发明的某一方案中，所述空白脂质体中，所述的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化磷脂和脑磷脂中的一种或多种，或含有0.01-10％的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲
氧基聚乙二醇2000的蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化磷脂和脑磷脂中的一种或多种。
41.在本发明的某一方案中，所述空白脂质体中，所述的磷脂可为10份。
42.在本发明的某一方案中，所述空白脂质体中，所述的人参皂苷可为20(s)-人参皂苷rg3、人参皂苷伪rg3、20(s)-人参皂苷rh2、伪人参皂苷gq、人参皂苷rg5、人参皂苷rk1和人参皂苷rp1中的一种或多种，优选20(s)-人参皂苷rg3和/或20(s)-人参皂苷rh2，更优选20(s)-人参皂苷rg3。
43.在本发明的某一方案中，所述空白脂质体中，所述的人参皂苷的质量比可为1份、1.5份或2份。
44.在本发明的某一方案中，所述空白脂质体中，所述的冻干保护剂可为海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种，优选葡萄糖。
45.在本发明的某一方案中，所述空白脂质体中，所述的冻干保护剂可为25-35份，又例如25份、30份或35份。
46.在本发明的某一方案中，所述空白脂质体可以包括如下质量分数的组分：9份蛋黄卵磷脂、1.8份rg3以及20-35份冻干保护剂；
47.或，10份大豆磷脂、2份rh2以及20-35份冻干保护剂；
48.或，10份蛋黄卵磷脂：1.5份伪rg3以及20-35份冻干保护剂；
49.或，10份蛋黄卵磷脂：1.5份伪gq以及20-35份冻干保护剂；
50.或，10份蛋黄卵磷脂：1.5份rk1以及20-35份冻干保护剂；
51.或，10份蛋黄卵磷脂：1.5份rp1以及20-35份冻干保护剂。
52.本发明还提供了一种人参皂苷多西他赛脂质体的制备方法，其包括如下步骤；
53.步骤1、将多西他赛、人参皂苷、磷脂与有机溶剂的溶液a1，进行浓缩成膜；
54.步骤2、将步骤1得到的膜在水中保温水化后，与冻干保护剂溶液混合均匀，得到脂质体溶液a2；
55.步骤3、其为方案1或方案2；
56.方案1(高压均质法)包括如下步骤：
57.将步骤2得到的所述的脂质体溶液a2进行高压均质，控制粒径d90小于100nm，得到脂质体溶液a3a。
58.方案2(高速剪切 挤出法)包括如下步骤：
59.将步骤2得到的所述的脂质体溶液a2进行剪切后，通过150nm孔径挤出板挤出，控制粒径d90小于100nm，得到脂质体溶液a3b；
60.其中，多西他赛、人参皂苷、磷脂以及冻干保护剂溶液的定义同如上所述(复方)人参皂苷多西他赛脂质体中所述。
61.在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的有机溶剂可为甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷中的一种或多种，优选甲醇和/或乙醇与氯仿和/或二氯甲烷的混合溶剂；例如乙醇：氯仿＝1：1(体积比)的混合溶剂。所述的有机溶剂的用量可不做具体限定，以能溶解多西他赛、人参皂苷、磷脂即可。例如多西他赛与所述的有机溶剂的质量体积比为1g/60-120ml，例如1g/80ml。
62.在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的溶液a1较佳地为将多西他赛、所述的人参皂苷、所述的磷脂等加热溶解于有机溶剂中得到；例如，将所述的人参皂苷、所述
的磷脂加入到多西他赛与所述的有机溶剂的溶液中，加热溶解得到；所述的加热可为水浴加热至35-65℃，例如55℃。
63.在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的浓缩可为减压浓缩；所述的减压浓缩可为真空＝-0.08mpa～-0.1mpa，例如-0.089～-0.1mpa；所述的浓缩至溶剂全部挥发完全即可；总浓缩时间较佳地为低于4小时。
64.在本发明的某一方案中，所述的步骤1中，所述的浓缩可为在旋蒸瓶中进行，转速可为40～60rp/min，例如50rp/min。
65.在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的水可为注射用水。
66.在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的冻干保护剂溶液的浓度可为0.20-0.35mg/ml，例如0.25mg/ml。
67.在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的水化的温度可为35-65℃，优选40-45℃。
68.在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的水化为在旋蒸瓶中进行，转速为40～60rp/min，例如50rp/min。
69.在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的水化以溶液均一即可，例如2-4小时。
70.在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的多西他赛：冻干保护剂溶液＝1g：100ml。
71.在本发明的某一方案中，所述的步骤2中，所述的冻干保护剂溶液的体积与所述的水的体积相同。
72.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案1中，所述的高压均质为在均质机中使用0～10℃冷冻水冷切循环；较佳地，确保脂质体溶液的温度在5-10℃。
73.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案1中，所述的高压均质的压力在800-1400bar之间，例如1200bar。
74.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案1中，所述的高压均质的次数可为3-4次，例如4次。
75.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述的剪切可在室温下进行。
76.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述的剪切的转速为1500～2200rp/min；例如2000rp/min。
77.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述的剪切的时间为5～10min；例如5min。
78.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述挤出的温度为35-45℃，例如40℃。
79.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述挤出板的孔径为150nm。
80.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述挤出的压力为600～800psi；例如800psi。
81.在本发明的某一方案中，所述的步骤3的方案2中，所述挤出的次数可为3-4次，例如4次。
82.本发明还提供了一种注射用人参皂苷多西他赛脂质体的制备方法，其包括如下步
骤；
83.步骤1-1、如上所述的人参皂苷多西他赛脂质体的制备方法中的步骤1-3，得到脂质体溶液a3a或a3b；
84.步骤2-1、将所述的脂质体溶液a3a或a3b除菌过滤，得到脂质体溶液a4；
85.步骤3-1、将所述的脂质体溶液a4进行冷冻干燥，得到注射用人参皂苷多西他赛脂质体。
86.所述的制备方法中，所述的除菌过滤、冷冻干燥的条件和操作可为本领域该类工艺中常规的条件和操作；本发明中优选如下：
87.本发明的某一方案中，所述的步骤2-1中，所述的除菌过滤可采用0.22μm滤膜。
88.本发明的某一方案中，所述的步骤3-1中，所述的冷冻干燥可在西林瓶中进行，所述西林瓶可为本领域常规的西林瓶，例如30ml或50ml西林瓶。
89.本发明的某一方案中，所述的步骤3-1中，所述的冷冻干燥可依次包括：预冻、一次干燥、二次干燥；具体地，可包括如下步骤：
90.步骤a、定量分装于西林瓶中的脂质体溶液a4至于冷冻干燥箱内，其中，冷冻干燥的搁板温度匀速降至-10
±
1℃，保温1小时，再将搁板温度升至-13
±
1℃，保温1小时，再将搁板温度继续降至-55
±
1℃，待制品温度达-45
±
1℃后，开始计时继续保温3小时；
91.步骤b、当步骤a中保温结束后，将冷凝器温度快速降至-50
±
1℃以下，抽真空至10pa以下，将搁板(约1.5小时)温度升至-25
±
1℃后，开始计时保温18个小时，再快速将搁板温度升至-15
±
1℃后，保温待制品冰晶完全消失，再继续保温4小时；
92.步骤c、当步骤b中保温结束后，将搁板温度快速(1小时内)升至15
±
1℃，保温3小时，然后将搁板温度升至30
±
1℃，待制品温度升至25
±
1℃时，保温12小时结束，即可。
93.本发明的某一方案中，步骤3-1之后还可进一步包括后处理，所述的后处理的条件和操作可为本领域该类工艺中常规的条件和操作；例如，所述的后处理包括如下步骤：步骤c中所述的保温结束后，全压塞，出箱；轧盖，即可。
94.本发明还提供了一种注射用复方人参皂苷多西他赛脂质体，其由如上所述的注射用人参皂苷多西他赛脂质体的制备方法制备得到。
95.在本发明的某一方案中，所述的注射用人参皂苷多西他赛脂质体的粒径d90≤150nm，包封率≥98％。在本发明的某一方案中，所述人参皂苷的纯度≥99％。
96.本发明还提供了一种如上所述的人参皂苷多西他赛脂质体、或上所述的空白脂质体、或如上所述的注射用复方人参皂苷多西他赛脂质体在制备治疗和/或预防癌症药物中的应用。
97.所述的癌症可为乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、头颈癌和食管癌。
98.术语“粒径d90”是指一个样品的累计粒度分布百分数达到90％时所对应的粒径。它的物理意义是粒径小于它的颗粒占90％。
99.本发明的处方缩写解释如下所示：
[0100][0101]
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0102]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0103]
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的复方人参皂苷多西他赛脂质体具有对肿瘤细胞的靶向作用、抗多药耐药作用、增效减毒和药物协同作用。以实施例中注射用复方人参皂苷rg3多西他赛脂质体为例，药效显著优于不在本发明请求保护的范围内的技术方案；说明了rg3在注射用复方人参皂苷rg3多西他赛脂质体中起到了更好的“药物、辅料、膜材、靶头”等多种作用，起到了良好的药物协同作用。具体地：
[0104]
(1)药效显著提高。尤其是dtx-rg3(1.0)/lp组和dtx-rh2(1.5)/lp组药效最优，其中剂量(10mg/kg)的抑瘤率(68％)均达到或超过了非本发明处方脂质体组高剂量(20mg/kg)的抑瘤率，所以，抑瘤效果提高了2倍；
[0105]
(2)glut1靶向性显著提高。在荷瘤鼠的glut1靶向性实验中，所述的人参皂苷脂质体的glut1靶向性都是比普通胆固醇脂质体的靶向性提高了4倍以上，而普通非优选的人参皂苷脂质体的glut1靶向性都是比普通胆固醇脂质体的靶向性提高了2倍以下。
[0106]
(3)毒副作用显著降低。按本发明的处方制备的脂质体，dtx-rg3(1.0)/lp的急性毒性(ld50≥150mg/kg)和dtx-rh2(1.5)/lp(ld50≥150mg/kg)比taxotere组(ld50约25mg/kg)降低了6倍以上，比普通胆固醇多西他赛脂质体(ld50在25～50mg/kg之间)降低了3-4倍，比dtx-c-rg3(1.8)/lp和dtx-c-rh2(2.0)/lp等的非本发明处方人参皂苷脂质体(ld50
＝50-100mg/kg左右)降低了1.5-2倍左右。sd大鼠长期毒性实验中，taxotere组出现了动物死亡，表明taxotere组的毒性作用大。本发明人参皂苷rg3多西他赛脂质体或人参皂苷rh2多西他赛脂质体的毒性比taxotere的毒性降低了4-6倍以上。
具体实施方式
[0107]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0108]
实验药物和器材
[0109]
实验药物：20(s)-人参皂苷rg3(简称：rg3)、人参皂苷伪rg3(简称：伪rg3)、人参皂苷rp1(简称：rp1)、人参皂苷伪gq(简称：伪gq)、人参皂苷rk1(简称：rk1)、人参皂苷rg5(简称：rg5)、20(s)-人参皂苷rh2(简称：rh2)、人参皂苷rk2(简称：rk2)、20(s)-人参皂苷rg2(简称：rg2)、20(s)-人参皂苷rh1(简称：rh1)、20(s)-原人参二醇(简称：ppd)、20(s)-原人参三醇(简称ppt)等为本领域常规市售可得，例如上海本素医药科技有限公司、苏州星海金森生物医药有限公司、上海源叶生物科技有限公司等。
[0110]
多西他赛注射剂：taxotere，厂家：英国aventis公司，采购自上海雷氏大药房。
[0111]
本发明所述的人参皂苷分子结构式如下：
[0112]
[0113]
[0114][0115]
试验仪器：下述实施例中所使用的仪器为上海本素医药科技有限公司、复旦大学药学院自有仪器设备，其设备型号和来源信息如下：
[0116]
安捷伦液相色谱：安捷伦1100一套，奥泰3300elsd，安捷伦科技(中国)有限公司；
[0117]
旋蒸蒸发仪：zx98-1 5l，上海鲁伊工贸有限公司；
[0118]
超声波清洗机(sb3200dt，宁波新芝生物科技股份有限公司)；
[0119]
氮吹仪(hgc-12a，天津市恒奥科技发展有限公司)；
[0120]
探头超声仪(jyd-650，上海智信仪器有限公司，中国)；
[0121]
高压均质机(b15，加拿大avestin)；
[0122]
微型挤出器(mini-extruder，avanti polar lipids inc)；
[0123]
激光粒度分析仪(nano zs,英国马尔文公司)；
[0124]
马尔文粒度仪malvern nanosizer zs90(英国马尔文公司)；
[0125]
酶标仪(thermo scientific，waltham，ma，usa)；
[0126]
酶标仪(infinitie 200，瑞士tecan trading co.，ltd)；
[0127]
流式细胞仪(bd biosciences，usa)；
[0128]
流式细胞仪(cytoflex s，beckman coulter，inc.，usa)；
[0129]
倒置荧光显微镜(leica，dmi 4000d，germany)；
[0130]
荧光显微镜观察(zeiss lsm 710，oberkochen，germany)；
[0131]
激光共聚焦显微镜(leica，dmi 4000d，germany)；
[0132]
共聚焦活体显微镜(confocal intravital microscopy,ivm)；
[0133]
正置双光子显微镜(dm5500 q；nikon)；
[0134]
小动物活体光学成像系统(in vivo imaging system,ivis)(perkinelmer，usa)；
[0135]
生物大分子相互作用仪biacore t 200仪器(ge，usa)；
[0136]
洁净工作台(sw-cj-1fd，苏州安泰空气技术有限公司)；
[0137]
20l旋转蒸发仪：r5002k，上海夏丰实业有限公司；
[0138]
冷冻干燥机：fd-1d-80，上海比朗仪器制造有限公司；
[0139]
冷冻干燥机：pdfd glz-1b，上海浦东冷冻干燥设备有限公司；
[0140]
电子天平：cpa2250(精度0.00001g)，赛多利斯(上海)贸易有限公司；
[0141]
电子天平：jy3003(精度0.001g)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；
[0142]
光电显微镜(xds-1b，重庆光电仪器有限公司)；
[0143]
细胞培养箱(ccl-170b-8，新加坡esco)。
[0144]
动物和细胞株
[0145]
动物：balb/c裸小鼠，鼠龄3-4周，中科院上海药物研究所生产。
[0146]
肿瘤细胞株：
[0147]
乳腺癌原位瘤4t1细胞株，复旦大学药学院提供
[0148]
乳腺癌mcf-7细胞株，复旦大学药学院提供；
[0149]
三阴性乳腺癌mda-mb-231细胞株，复旦大学药学院提供；
[0150]
实施例1注射用复方人参皂苷rg3多西他赛脂质体的制备
[0151]
1.处方：蛋黄卵磷脂10g，人参皂苷rg3 1g，多西他赛1g，葡萄糖25g，无水乙醇40ml，氯仿40ml，注射用水200ml。
[0152]
2.成膜：配置处方量的无水乙醇和氯仿(1:1)混合溶剂备用。
[0153]
将处方量的多西他赛加入混合溶剂溶解备用，再将处方量的人参皂苷rg3和蛋黄卵磷脂加入混合溶剂中，加热溶解，转移入1l旋蒸瓶中，减压浓缩，水浴温度55℃，转速50转/min，真空度-0.089～-0.1mpa，旋蒸至溶剂全部挥发完全。
[0154]
3.水化：配置葡萄糖溶液：将25g无水葡萄糖加入到100ml注射用水，搅拌溶解后配置成0.25mg/ml的葡萄糖水溶液，40℃水浴加热备用。
[0155]
将100ml注射用水加入到成膜后的旋蒸瓶中，水浴温度40-45℃，转速50转/min，水化并完全溶解，时间约2h。
[0156]
然后再加入100ml的葡萄糖水溶液，搅拌均匀，备用。
[0157]
4.高压均质：水化后的溶液转移至均质机，均质机使用0～10℃冷冻水冷切循环，均质压力设置1200bar，循环均质3
‑‑
4次，至d90小于100nm。
[0158]
5.除菌过滤：将均质后的溶液过0.22μm滤膜除菌过滤。
[0159]
6.分装：将除菌过滤后的溶液按装设定量8～10ml分装进30或50ml西林瓶中。
[0160]
7.预冻：产品进箱后，搁板温度匀速降至-10℃左右，保温1小时，再将搁板温度约升至-55℃，保温1小时，保温结束，再将搁板温度继续降至-55℃左右，待制品温度达-45℃后，开始计时继续保温约3小时。
[0161]
8.一次干燥：将冷凝器温度快速降至-50℃以下，抽真空至10pa以下，将搁板(约1.5小时)温度升至-25
±
1℃后，开始计时保温约18个小时，再快速将搁板温度升至-15
±
1℃后，保温待制品冰晶完全消失，再继续保温4小时左右；
[0162]
9.二次干燥：搁板温度快速(1小时内)升至15℃左右，保温约3小时，然后将搁板温度升至25℃左右，待制品温度升至25℃时，保温12小时左右。保温结束，检查真空度情况，结束整个冻干过程，全压塞，出箱。
[0163]
10.轧盖和包装：将上述脂质体轧盖和包装，即得注射用复方人参皂苷rg3多西他赛脂质体(处方1)。
[0164]
实施例2注射用复方人参皂苷rg3多西他赛脂质体的制备
[0165]
将实施例1中的人参皂苷rg3的处方量提高至1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷rg3多西他赛脂质体。
[0166]
实施例3注射用复方人参皂苷rg3多西他赛脂质体的制备
[0167]
1.处方：蛋黄卵磷脂10g，人参皂苷rg3 1.5g，多西他赛1g，葡萄糖25g，无水乙醇40ml，氯仿40ml，注射用水200ml。
[0168]
2.成膜：同实施例1的成膜法。
[0169]
3.水化：同实施例1的水化法。
[0170]
4.高速剪切和挤出：将上述脂质体溶液，室温下，在2000rp/min快速剪切5min。
[0171]
将脂质体溶液温度控制在35-45℃，连接挤出装置，安装150nm孔径挤出板，在800psi压力下挤出。
[0172]
5.后续步骤同实施例1的各个步骤。
[0173]
实施例4注射用复方人参皂苷rh2多西他赛脂质体的制备
[0174]
将实施例1中的人参皂苷rg3变更为人参皂苷rh2 1.0g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷rh2多西他赛脂质体。
[0175]
实施例5注射用复方人参皂苷rh2多西他赛脂质体的制备
[0176]
将实施例1中的人参皂苷rg3变更为人参皂苷rh2 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷rh2多西他赛脂质体。
[0177]
实施例6注射用复方人参皂苷伪rg3多西他赛脂质体的制备
[0178]
将实施例1中的人参皂苷rg3变更为人参皂苷伪rg3 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷伪rg3多西他赛脂质体。
[0179]
实施例7注射用复方人参皂苷rg5多西他赛脂质体的制备
[0180]
将实施例1中的人参皂苷rg3变更为人参皂苷rg5 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷rg5多西他赛脂质体。
[0181]
实施例8注射用复方人参皂苷rk1多西他赛脂质体的制备
[0182]
将实施例1中的人参皂苷rg3变更为人参皂苷rk1 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷rk1多西他赛脂质体。
[0183]
实施例9注射用复方人参皂苷rp1多西他赛脂质体的制备
[0184]
将实施例1中的人参皂苷rg3变更为人参皂苷rp1 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷rp1多西他赛脂质体。
[0185]
实施例10注射用复方人参皂苷伪gq多西他赛脂质体的制备
[0186]
将实施例1中的人参皂苷rg3变更为人参皂苷伪gq 1.5g，其他同实施例1，制备得到注射用复方人参皂苷伪gq多西他赛脂质体。
[0187]
效果实施例1
[0188]
(a)根据下表处方，并按实施例1相同方法(不需要冻干步骤)，对人参皂苷的种类比较结果如下表：
[0189]
[0190][0191]
上述系列实验证明，在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，本发明中的人参皂苷为：rg3、伪rg3、rh2、伪gq、rg5、rk1和rp1等7个时，ginposome-dtx或ctx具有较好制备工艺，制备条件易于实现，利于产业化的。人参皂苷为rk2、rg2、rh1、ppd和ppt时，需要添加其他辅料，并且制备条件比较苛刻的。
[0192]
(b)对磷脂的种类和比例进行了比较：
[0193]
备注：蛋黄卵磷脂(epc)、大豆磷脂(spc)、脑磷脂(pe)、鞘磷脂(sm)、氢化磷脂(hspc)、磷脂酰丝氨酸(ps)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基卵磷脂(dopc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc)、1-棕榈酰基-2-油酰基基磷脂酰乙醇胺(pope)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)、聚乙二醇2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺(mpeg-dspe)、聚乙二醇2000-二油酰基磷脂酰乙醇胺(mpeg-dope)。
[0194]
按实施例1相同方法(不需要冻干步骤)，对磷脂种类和比例的比较结果如下表：
[0195]
[0196]
[0197][0198]
上述实验证明，在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，能良好包裹多西他赛，制备工艺较易实现的磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化磷脂、脑磷脂和混合磷脂(上述4个磷脂中含有0.01-10％mpeg-dspe)。其他磷脂与rg3也能良好包裹多西他赛，但需添加大豆油等其他辅料，或提高均质压力和均质次数。上述实验同时说明：在成膜性方面，本发明中的磷脂：多西他赛＝8-18：1时，效果较佳，优选为8-12：1。
[0199]
(c)按实施例1相同方法(不需要冻干步骤)，对人参皂苷的最佳比例进行了比较：
[0200]
[0201][0202]
上述实验证明，在不添加大豆油或胆固醇等其他辅料情况下，本发明中皂苷：多西他赛＝1-3：1的比例范围时，效果较佳。但由于本发明应用实施例4毒代动力学的研究结果，本发明只选择了皂苷：多西他赛＝1-1.5：1的比例范围。
[0203]
(d)按实施例1相同方法，对冻干保护剂进行了比较：
[0204]
[0205]
[0206][0207]
在冻干保护剂的选择中，不同冻干保护剂对产品复溶后脂质体的包封率，粒径分布有显著影响，对冻干曲线的经济性也存在较大影响。通过上述实验，在不添加大豆油等其他辅料情况下，本发明中的冻干保护剂为葡萄糖、海藻糖、蔗糖、乳糖和半乳糖中的一种或多种，多西他赛与冻干保护剂的比例为：冻干保护剂/多西他赛＝25-35倍量，例如15倍量葡萄糖时，ginposome-dtx的复溶粒径为200nm，介于合格与不合格之间，25或35倍量时，与多西他赛脂质体具有良好匹配性。因综合考虑制剂学的经验数据，本发明确定的多西他赛与冻干保护剂的比例为：冻干保护剂/多西他赛＝25-35倍量。
[0208]
应用实施例1：glut1的细胞摄取实验
[0209]
1)实验目的：通过添加葡萄糖抑制剂等证明glut1靶向机制；通过glut1靶向验证本发明的人参皂苷种类和比例、磷脂种类和比例。
[0210]
2)实验方法：为了比较4t1对各实验组的摄取，探讨复方制剂的摄取机制，将4t1细胞按2
×
105的细胞密度接种于12孔板中，对于实验组 葡萄糖、实验组 根皮苷和实验组 槲皮素组，12小时后分别用20mm的葡萄糖溶液、根皮苷溶液和槲皮素溶液代替培养基。这三种溶质应在无葡萄糖培养基中溶解，孵育1小时后，加入各实验组药物(紫外荧光显色剂的浓度为100ng/ml)，孵育4小时后，消化，用新鲜pbs溶液洗涤，采用流式细胞仪进行分析。
[0211]
3)实验组制备方法：按本发明实施例1方法制备(多西他赛改为香豆素，不需要冻干步骤)
[0212]
应用实施例4毒代实验结果，下述实验未开展人参皂苷/多西他赛超过2.0的处方的实验。
[0213]
实验组：
[0214]
处方内容简称
蛋黄卵磷脂：胆固醇：荧光探针＝9：1.8：1c6-c/lp蛋黄卵磷脂：rg3：荧光探针：胆固醇＝9：1.8：1：2.25c6-c-rg3/lp蛋黄卵磷脂：rg3：荧光探针＝9：1.8：1c6-rg3/lp大豆磷脂：rh2：荧光探针：胆固醇＝10：2：1：2.25c6-c-rh2/lp大豆磷脂：rh2：荧光探针＝10：2：1c6-rh2/lp大豆磷脂：rg5：荧光探针：大豆油＝4：3：1：2c6-rg5/lp蛋黄卵磷脂：伪rg3：荧光探针＝10：1.5：1c6-伪rg3(1.5)/lp蛋黄卵磷脂：伪gq：荧光探针＝10：1.5：1c6-伪gq(1.5)/lp蛋黄卵磷脂：rk1：荧光探针＝10：1.5：1c6-rk1(1.5)/lp蛋黄卵磷脂：rp1：荧光探针＝10：1.5：1c6-rp1(1.5)/lp
[0215]
实验结果如下：
[0216][0217]
实验结论：
[0218]
1)相同处方下，添加胆固醇后，其glut1靶向性大幅度降低。
[0219]
2)本发明处方的靶向性相对胆固醇脂质体提高了4倍以上，非优选处方的人参皂苷脂质体的靶向性相对胆固醇脂质体提高了约2倍。
[0220]
应用实施例2：乳腺癌(mcf-7)体内药效学研究
[0221]
1)试验方法：将肿瘤细胞株(mcf-7)注入小鼠皮下，建立皮下肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3(接种后7d)时，将小鼠随机分组(n＝8每组)治疗，每组尾静脉注射空白溶剂(5％葡萄糖，blank)、dtx-c/lp组、dtx-rg3(0.5)/lp组、dtx-rg3(1.0)/lp组、dtx-rg3(1.5)/lp组、dtx-rg3(2.0)/lp组、dtx-rh2(0.5)/lp组、dtx-rh2(1.0)/lp组、dtx-rh2(1.5)/lp组、dtx-rh2(2.0)/lp组、dtx-c-rg3(1.8)/lp组(蛋黄卵磷脂：rg3：胆固醇：多西他赛＝9：1.8：2.25：1)、dtx-c-rh2(2.0)/lp组(大豆磷脂：rh2：胆固醇：多西他赛＝10：1：2.25：1)，剂量按多西他赛计高中低三组(20mg、10mg、5mg)，每7天给一次药，持续到第28天，给药的同时测量肿瘤的长度、宽度和记录体重。计算肿瘤体积(v)的公式为:v＝(w2×
l)/2。
长度(l)为实体瘤的最长直径，宽度(w)是垂直于长度的最短直径。在第28天实验结束，所有动物均处死，取出肿瘤进行影像学和组织学检测。
[0222]
备注：多西他赛 rg3＝20mg/kg 30mg/kg，表示药物浓度，下同。
[0223]
因应用实施例4的毒代结果，本实施例未开展dtx-rg3(2.0以上)/lp组的研究。
[0224]
2)试验结果如下：
[0225]
[0226][0227]
结论：
[0228]
1)dtx-rg3(1.0)/lp组、dtx-rh2(1.5)/lp组的药效最佳，在第21天肿瘤完全消失。二组的中剂量(多西他赛＝10mg/kg)的抑瘤率与dtx-c-rg3(1.8)/lp组和dtx-c-rh2(2.0)/lp组的高剂量组(多西他赛＝20mg/kg)的抑瘤率基本一致。即：抑瘤效果比非本发明组提高了约2倍以上。
[0229]
2)dtx-c/lp组出现了动物死亡，表明毒性作用大。
[0230]
3)药效高低与人参皂苷的比例高低不具有线性关系，根据本处方，人参皂苷rg3/多西他赛的比例在1.0～1.5时，药效最佳，优选1.0；人参皂苷rh2/多西他赛的比例在1.0～2.0时，药效最佳，优选1.5。
[0231]
应用实施例3：急性毒性(ld50)研究(sd大鼠)
[0232]
1)实验方法：大鼠160～260g，6～9周龄，每组6只，给药方式：缓慢静推(约1ml/min)，给药频率：3次/天。
[0233]
本试验供试品多西他赛剂量设置为25，50，100和150mg/kg/天，供试品中含rg3分别25，50，100和150mg/kg/天；含rh2分别为37.5，75，150和225mg/kg/天。同时设置溶媒对照组(5％葡萄糖注射液)、市售阳性对照组(taxotere组)、rg3脂质体组和dtx-c-rg3/lp组，缓慢静推(约1ml/min)，3次/天，每次给药间隔至少4h。
[0234]
2)实验分组：共计13组，5％葡萄糖组、dtx-c/lp、dtx-c-rg3(1.8)/lp组、dtx-c-rh2(2.0)/lp组和药效学的实验分组一致，其他组别名称如下述表格所示。
[0235]
3)实验组制备方法：根据处方要求，依实施例1方法制备。
[0236][0237][0238]
3)实验结果如下表：
[0239]
备注：因应用实施例4的毒代结果，本实施例未开展dtx-rg3(2.0或以上)/lp组的研究。
[0240][0241]
通过以上实验显示，本发明的技术方案具有优良的制剂学和glut1靶向性，使得相关制剂的降毒效果最佳，相对胆固醇脂质体组(dtx-c/lp)和多西他赛注射剂(taxotere)，毒性普遍降低4-6倍左右；相对dtx-c-rg3(1.8)/lp组和dtx-c-rh2(2.0)/lp组，毒性普遍降低了1.5-2倍。
[0242]
应用实施例4：毒代动力学(tk)研究
[0243]
1.实验目的：研究各实验组的累积毒性。
[0244]
2.实验方法：本实验tk组共设置8组，分别为溶媒对照组(5％葡萄糖注射液)、市售阳性对照组taxotere组(10mg/kg)、供试品1(dtx-rg3(1.0)/lp组：10mg/kg和20mg/kg)、供试品2(dtx-rh2(1.5)/lp组：10mg/kg和20mg/kg)、供试品3(dtx-rh2(2.0)/lp组，10mg/kg和20mg/kg)。每组10只sd大鼠，雌雄各半，共80只。静脉注射给药，每周给药1次，连续给药四周，溶媒对照组分别于d1和d29给药前及给药后1hr采集全血，供试品1、供试品2、供试品3和市售阳性对照组分别于d1和d29给药前及给药后3min、15min、30min、1hr、3hr、6hr、24hr采集全血，全血收集至含edta-k2抗凝剂的试管中，置于碎冰上，离心收集血浆用于分析检测。
[0245]
采用lc-ms/ms法对血浆中多西他赛及20(s)-rg3、20(s)-rh2的浓度进行检测，多西他赛分析方法定量下限为：25.000ng/ml，rg3和rh2分析方法定量下限为50.000ng/ml。采用winnonlin软件的非房室模型对血浆浓度数据进行分析，并进行参数计算，研究其供试品的毒代动力学特点，为临床试验提供参考。
[0246][0247][0248]
3.实验结果，在本次试验条件下：
[0249]
1)d1和d29给药后，雌雄sd大鼠静脉注射给予供试品1、供试品2和供试品3后血浆中人参皂苷rg3和rh2的暴露量(以auc(0-t)计)随着给药剂量的增长而增长，增长幅度高于剂量的增长。
[0250]
2)d1给药后，雌雄sd大鼠静脉注射给予供试品1、供试品2和供试品3后血浆中人参皂苷rg3和rh2的暴露量(以cmax计)与给药剂量成正比例。
[0251]
3)d1和d29给药后，雌雄sd大鼠静脉注射给予供试品1后血浆中多西他赛的暴露量(以auc(0-t)和cmax计)随着与给药剂量的增长而增长，增长幅度高于剂量的增长。
[0252]
4)d1和d29给药后，雌雄sd大鼠静脉注射给予供试品2后血浆中人参皂苷rg3和rh2
的暴露量(以cmax计)与给药剂量成正比例。
[0253]
5)在本次试验条件下，连续给药后，雌雄sd大鼠静脉注射给予供试品1和供试品2后血浆中人参皂苷rg3和rh2基本无蓄积倾向；雌雄sd大鼠静脉注射给予供试品1和供试品2和供试品3后血浆中多西他赛基本无蓄积倾向；雌雄sd大鼠静脉注射给予供试品3后血浆中多西他赛和人参皂苷rh2的暴露量有轻微蓄积；雌雄sd大鼠静脉注射给予市售对照组血浆中多西他赛的暴露量无蓄积。
[0254]
结论：dtx-rg3(1.0)/lp组无累积毒性风险。
[0255]
dtx-rh2(1.5)/lp组无累积毒性风险。
[0256]
dtx-rh2(2.0)/lp组有轻微累积毒性风险。
[0257]
应用实施例5：sd大鼠长期毒性研究
[0258]
1)实验方法：大鼠160～260g，6～9周龄，每组6只，给药方式：缓慢静推(约1ml/min)，给药频率：1次/周(d1、d8、d15、d22、d29)。
[0259]
2)实验分组：设置了5％葡萄糖组(溶媒对照组)、taxotere组(阳性对照组)、taxotere rg3/lp组、dtx-rg3/lp组、dtx-rh2/lp组，共计5组。
[0260]
本试验供试品多西他赛剂量设置为5，10和20mg/kg，供试品中多西他赛和rg3的质量比为1：1.0，多西他赛和rh2的质量比为1：1.5，故含rg3分别5、10和20mg/kg，含rh2分别为7.5、15、30mg/kg。(按实施例1的制备方法制备得到)
[0261]
每组的给药剂量设置如下：
[0262][0263]
3)实验结果如下：
[0264]
结果1：taxotere组长期毒性实验结果(第30天的检查结果)
[0265]
给药剂量5mg/kg10mg/kg20mg/kg动物死亡比例无死亡无死亡33.3％动物平均体重变化情况 15％ 2％-18％肝组织损伤情况无损伤中度重度肾组织损伤情况无损伤中度重度脾组织损伤情况无损伤中度重度心脏组织损伤情况无损伤中度重度
[0266]
结果2：taxotere组 rg3/lp组长期毒性实验结果(第30天的检查结果)
[0267][0268]
结果3：dtx-rg3/lp组长期毒性实验结果(第30天的检查结果)
[0269][0270][0271]
结果4：dtx-rh2/lp组长期毒性实验结果(第30天的检查结果)
[0272][0273]
以上大鼠长期毒性实验结果表明：
[0274]
1)taxotere组出现大鼠死亡，体重减轻严重，各器官重度损伤，表示毒性大。
[0275]
2)dtx-rg3/lp组和dtx-rh2/lp组，都未出现大鼠死亡，体重几乎未减轻，各器官主要轻度损伤，表示长期毒性大幅度降低。
[0276]
应用实施例6：注射用复方人参皂苷多西他赛脂质体对三阴性乳腺癌(mda-mb-231)体内研究
[0277]
动物：balb/c裸小鼠，鼠龄3-4周，上海药物研究所生产。
[0278]
肿瘤细胞株：三阴性乳腺癌mda-mb-231细胞株
[0279]
由中科院上海药物研究所提供。
[0280]
移植瘤模型：用上述各细胞株接种于裸小鼠右侧腋窝皮下，细胞接种量为5
×
106/只，形成移植瘤后再在裸小鼠体内传1代后使用。
[0281]
实验方法：将肿瘤细胞株注入小鼠皮下，建立皮下肿瘤模型。当肿瘤体积达到100mm3(接种后7d)时，将小鼠随机分为4组(n＝8每组)治疗，每组尾静脉注射空白溶剂(5％葡萄糖)、taxotere组、dtx-rg3/lp组(20mg/kg多西他赛计，20mg/kg人参皂苷rg3计)、dtx-rh2/lp组(20mg/kg多西他赛计，30mg/kg人参皂苷rh2计)，每7天给一次药，持续到第28天，给药的同时测量肿瘤的长度、宽度和记录体重。计算肿瘤体积(v)的公式为：v＝(w2
×
l)/2。长度(l)为实体瘤的最长直径，宽度(w)是垂直于长度的最短直径。在第28天实验结束，所有动物均处死，取出肿瘤进行影像学和组织学检测。
[0282]
三阴性乳腺癌mda-mb-231：根据体内药效学实验方法，针对三阴性乳腺癌mda-mb-231体内药效学的研究数据如下。
[0283][0284]
结果显示：针对三阴性乳腺癌mda-mb-231荷瘤鼠，同等剂量下，taxotere组抑瘤效果一般(抑瘤率68％)，dtx-rg3/lp组和dtx-rh2/lp组效果最佳，在第28天肿瘤都已完全消失。该实验结果表明：复方制剂药效显著，具有显著的药物协同作用。