苯甲酰新乌头原碱在制备用于预防和治疗绝经后骨质疏松的药物中的应用

1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及苯甲酰新乌头原碱在制备用于预防和治疗绝经后骨质疏松的药物中的应用。


背景技术：

2.生命体骨丢失导致的骨质疏松对人们的生产、生活造成巨大的影响，目前公知的由于年龄的增大、饮食结构的不合理等多种原因导致骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，致使骨质疏松、骨折、甚至骨矿失调的风险。2010年，我国骨质疏松性骨折患者达233万例，其中髋部骨折36万例，椎体骨折111万例，其他骨质疏松性骨折86万例。骨质疏松作为人类健康的大敌，主要分为两大类：一类是原发性骨质疏松，包括绝经后骨质疏松、老年性骨质疏松和特发性骨质疏松；另一类是继发性骨质疏松。其中针对于绝经后的骨质疏松患者，除了雌激素的缺乏外，还伴有肿瘤坏死因子超家族配体以及促炎因子分泌量的异常升高，会导致骨代谢平衡紊乱，突出表现为破骨细胞的过度活化。成骨细胞的骨形成能力和破骨细胞的骨吸收功能对维持重塑的平衡具有重要作用。目前对绝经后骨质疏松症的治疗多采用补钙和增加雌激素的摄入等药物治疗的方法，效果不甚理想，仍不能有效控制绝经后骨质疏松症的发生。由于破骨细胞的骨吸收功能与成骨细胞骨形成功能失调会导致绝经后骨质疏松等骨病，因此通过抑制破骨分化治疗绝经后骨质疏松是较补钙和摄入雌激素等药物来说是优选的治疗方法。中医药治疗骨伤科疾病历史悠久，中药煎煮过程中会转化多种对骨质疏松有治疗作用的单体和有效成分，但是对于单体和有效成分的研究少之又少，因此需要进行治疗绝经后骨质疏松单体的筛选和有效成分的验证，探索其作用的分子机制，才能更好的治疗和解决绝经后骨质疏松这一问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的就是提供一种苯甲酰新乌头原碱，在制备治疗和预防绝经后骨质疏松上的应用。附子是临床常用的中药，具有回阳救逆，补火助阳，散寒止痛的功效。但是附子中的乌头碱类含有毒性，大剂量或长时间服用会导致中毒甚至危害生命安全，严重影响了其在临床中应用的安全性。附子在长时间煎煮的过程会转化为毒性较低的物质，包括苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱等成分，但是这些成分对于骨代谢的研究尚未见报道。在本研究中我们系统分析了苯甲酰新乌头原碱可抑制破骨分化，并且可作为绝经后骨质疏松治疗的一种药物有效成分。
4.本发明的目的是通过以下方案实现的：
5.本发明提供了苯甲酰新乌头原碱在制备用于预防和治疗绝经后骨质疏松的药物中的应用，苯甲酰新乌头原碱通过抑制raw264.7细胞的破骨分化，并抑制ctsk(组蛋白酶)的表达，达到改善骨质疏松的骨量丢失的治疗，通过mirco-ct的结果也可减少去卵巢之后的骨质流失，且对肝肾功能无显著影响。
6.该发明提供了的中药单体苯甲酰新乌头原碱中药物类型包含口服、注射剂以及外用贴剂，给药方式可以采用静脉、局部注射或皮贴敷。在预防和治疗绝经后骨质疏松上的该药物单体还需要采用常规药用配剂，其中口服用药需要采用赋形剂、静脉药物需要采用稀释剂、经皮贴需要采用载体。
7.该发明提供了中药单体苯甲酰新乌头原碱的质量浓度为15～50μmol，优选为20μmol、40μmol。
8.本发明提供的中药单体苯甲酰新乌头原碱在预防和治疗绝经后骨质疏松上是一种新用途，经细胞和动物试验结果证明，苯甲酰新乌头原碱对破骨细胞的分化有显著的抑制作用以及减少ovx(去卵巢)术后骨量的丢失，同时还能够降低破骨相关蛋白ctsk的表达，具有治疗绝经后骨质疏松的功效，这对绝经后导致的骨质疏松提供了一种新的治疗方法。本发明采用多种药物类型，可根据患者的要求制成不同的剂型形式。此类药物可进行大规模生产，可实施性强，具有很好的应用前景。
附图说明
9.为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
10.图1为不同浓度下、不同时间下苯甲酰新乌头原碱对raw264.7细胞活力的影响对比图；
11.图2为不同浓度下苯甲酰新乌头原碱对raw264.7细胞进行trap染色定量分析后破骨细胞数量统计图；
12.图3为不同浓度下苯甲酰新乌头原碱对破骨细胞进行检测后对trap、细胞活力和ctsk影响的结果图；
13.图4为苯甲酰新乌头原碱对卵巢切除小鼠骨量丢失的影响结果图以及相对骨体积和骨体积分数(bv/tv)之比、骨小梁数量(tb.n)、骨表面积和骨组织体积之比(bs/tv)以及骨小梁之间髓腔平均宽度(tb.sp)的分析图；
14.图5为去卵巢模型组和去卵巢加苯甲酰新乌头原碱模型组两个模型对正向调控基因ctsk的表达对比的数据分析图。
具体实施方式
15.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护范围。
16.实验材料
17.小鼠raw264.7(小鼠单核巨噬细胞)细胞株购自中国典型培养物保藏中心，苯甲酰新乌头原碱购自四川维克奇生物技术公司，将苯甲酰新乌头原碱溶于dmso溶液，配制成不同浓度的药物溶液。培养瓶和培养板购自corning公司，cck8购自sigma公司；青霉素、链霉素购自invitrogen公司，dmem培养基购自gibco公司，胎牛血清购自hyclone公司。
18.实验方法
19.一、动物实验
20.取30只12周龄的c57bl/6雌性小鼠随机分成三组，分别为假手术组，去卵巢(ovx)组和去卵巢(ovx) 苯甲酰新乌头原碱组三组。假手术组，ovx组和ovx 苯甲酰新乌头原碱各有10只小鼠。ovx组和ovx 苯甲酰新乌头原碱组均进行卵巢切除手术，假手术组作为对照组不切除小鼠卵巢外其余操作都与去卵巢组一致。然后将ovx 苯甲酰新乌头原碱组中的小鼠每两天一次腹膜内注射3mg/kg的苯甲酰新乌头原碱；假手术组和ovx组小鼠腹腔注射pbs作为对照。
21.饲养6周后，处死所有小鼠。每组选取3只小鼠的骨组织，提取股骨蛋白，将100μg蛋白溶液加到12％的sds-page电泳胶电泳，分离后转印至pvdf膜，然后将膜与ctsk(1∶500)和β-actin(1∶1000)4℃共孵育过夜。然后将膜与相应的二抗室温共孵育1h，用ecl超敏发光液显色，azure c300化学发光成像系统拍照，并用image pro plus 6.0图像分析软件进行半定量灰度值分析。然后将小鼠股骨收集并固定在10％中性缓冲福尔马林中。去除过量的软组织，将其浸泡在pbs中，并装入2ml eppendorf离心管中以保持位置，防止移动。并制备用于micro-ct分析的清洁的股骨，使用skyscan1176微型ct仪器(bruker)扫描，使用具有恒定阈值的nrecon软件(bruker)重建图像，产生包含股骨骨近端头部的感兴趣体积，并将该体积加载到分析程序ctan(bruker)中。然后在生长板下方0.5mm处产生精细的感兴趣体积，并在高度上产生1mm。手动定义该体积内的小梁骨区域(roi)，并使用恒定阈值来确定该roi内的骨参数。对小鼠的股骨以及胫骨进行观测，并计算对应的骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数目(tb.n)、骨小梁平均厚度(tb.th)以及骨小梁分离度(tb.sp)。
22.二、细胞实验
23.1.首先进行cck8法测定苯甲酰新乌头原碱对raw264.7(小鼠单核巨噬细胞)细胞的增殖的抑制作用。将raw264.7细胞直接种于细胞培养瓶中，加入含100u/ml青霉素、100u/ml链霉素及10％胎牛血清的dmem培养基，置于37℃、5％co2的温箱中孵育，继续培养3-5天,观察到raw264.7细胞细胞集落形成。取生长状态良好且增殖在p3～p8代时的肿瘤细胞，接种于96孔板内，并设置不同浓度梯度的苯甲酰新乌头原碱包括0,10,15,25,50和100μmol。经过24、48、72小时后，在培养基中加入10μl的cck8，孵育4h后，使用酶标仪测量450nm处的吸光度，并记录数据。
24.2、随后进行苯甲酰新乌头原碱对rankl诱导破骨分化的抑制作用及trap阳性细胞的影响。取培养至p8的raw264.7细胞按照每孔20000的密度种植于6孔板，实验分成6个小组。第一组为raw264.7的对照组，第二组为raw264.7且加了rankl的诱导组，第三组为raw264.7且加了rankl和5μmol苯甲酰新乌头原碱，第四组为raw264.7且加了rankl和10μmol苯甲酰新乌头原碱，第五组raw264.7且加了rankl和20μmol苯甲酰新乌头原碱，第六组为raw264.7且加了rankl和40μmol苯甲酰新乌头原碱。在诱导培养的第4天后，当观察到巨大的空泡型细胞即为破骨细胞后，立即进行trap染色。染色结束后在显微镜下观察并拍照，并观察破骨细胞诱导的数量并记录数据进行统计学分析。
25.3.将2中加入rankl诱导的6孔板细胞继续培养5天后提取蛋白，每孔加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的rapi裂解液，用细胞刮将细胞刮下来并收集到提前标记好插入冰中的ep管内，涡旋混匀后插入冰中裂解15min，4℃，12000g，离心15min，收集上清于新的ep管中即为总蛋白样品。根据bca蛋白定量说明书做出标准曲线，记录测定各组蛋白样品的浓
度数值。按照bca定量法分别算出需要加入的蛋白样品的量、ripa裂解液的量以及上样缓冲buffer的量，以及对各组样品的蛋白浓度进行归一化处理，并通过image j软件对显影得到的条带进行灰度分析并绘制图表。另外采用cck8法测定进行40μmol以下浓度的苯甲酰新乌头原碱对细胞活力的影响，进行计算后收集数据绘制图表。
26.4.将3中的raw264.7细胞继续培养到7天后提取总蛋白，用western blot法检测破骨相关蛋白ctsk的表达，其中设定gapdh作为内参蛋白。记录数据制成图表进行分析。
27.三、实验结果
28.图1为不同浓度梯度下苯甲酰新乌头原碱对raw264.7细胞活力的影响，结果显示72h浓度为100μmol的苯甲酰新乌头原碱对细胞活力有轻度抑制作用，所以后续选择50μmol浓度的苯甲酰新乌头原碱作为主要研究对象。
29.图2为raw264.7细胞诱导培养4天后进行tarp染色结果，结果中显示，当使用rankl和40μmol苯甲酰新乌头原碱诱导后破骨细胞数量明显减少，并且有计量依赖性，苯甲酰新乌头原碱的浓度为40μmol时破骨细胞数量最少(p＜0.05)。结果说明，苯甲酰新乌头原碱能抑制破骨细胞的形成。
30.图3为破骨细胞生成指标进行检测的结果，具体指标为trap，细胞活力和ctsk。raw264.7细胞经诱导后五天提取总蛋白，结果a显示细胞活力在40μmol以下并没有显著影响，b显示苯甲酰新乌头原碱浓度在20μmol、40μmol的时候都可以显著抑制trap的染色体阳性数目，该数据具有统计学差异(p＜0.05)，说明苯甲酰新乌头原碱可以明显抑制rankl诱导的raw264.7细胞破骨分化,c显示浓度在20μmol和40μmol的苯甲酰新乌头原碱对ctsk有显著的抑制作用，可明显抑制组分蛋白的上升，说明苯甲酰新乌头原碱可以抑制ctsk的表达，另外苯甲酰新乌头原碱具有抑制信号通路的作用，d中ctsk/β-actin的表达量在同等浓度的rankl的诱导下，当其浓度在20μmol以上时，对于破骨相关的正向调控因子ctsk的表达起到显著的抑制作用(p＜0.05)，结果表明苯甲酰新乌头原碱可以通过抑制ctsk的表达，从而达到抑制破骨细胞的生成减弱破骨分化，从而起到减少骨质流失的作用。
31.图4中a去卵巢组的小鼠骨小梁的数目较假手术组的明显减少，骨小梁间距增大，表现为骨质疏松，给与苯甲酰新乌头原碱之后骨小梁的数目显著多余卵巢切除组，小梁面积统计结果显示去卵巢之后出现明显的骨质疏松，在给与苯甲酰新乌头原碱之后骨质流失明显缓解。给予苯甲酰新乌头原碱治疗之后，骨小梁的数目明显多于卵巢切除组。b、c、d、e四组图为使用计算机软件统计分析相对骨体积和骨体积分数(bv/tv)之比、骨小梁数量(tb.n)、骨表面积和骨组织体积之比(bs/tv)以及骨小梁之间髓腔平均宽度(tb.sp)后发现使用苯甲酰新乌头原碱治疗后，各项指标均优于卵巢切除组，且差异有统计学意义(p＜0.05)，结果显示苯甲酰新乌头原碱有治疗卵巢切除引起的骨质疏松的作用，而且苯甲酰乌头新碱能显著缓解ovx后的骨量丢失，显著提高bv/tv以及tb.n，并能降低tb.sp。
32.图5进一步分析了去卵巢(ovx)与苯甲酰新乌头原碱模型对于卵巢切除导致的骨质疏松的治疗作用，卵巢切除之后破骨正向调控基因ctsk的表达显著上升，且差异有显著统计学意义(p＜0.05)，提示在卵巢切除之后，破骨代谢异常活跃。在给与苯甲酰新乌头原碱治疗之后，苯甲酰新乌头原碱组ctsk的表达量与ovx组相比显著下降，且差异有显著统计学意义(p＜0.05)，提示苯甲酰新乌头原碱可以抑制ovx模型ctsk的表达，从而减少绝经导致的骨质流失。
33.以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。