一种检测鱼体中15种抗生素的方法与流程

1.本发明属于有机污染物质残留检测的技术领域，，涉及一种检测鱼体中15种抗生素的方法，具体涉及一种超声萃取-固相萃取结合超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)检测鱼体中15种抗生素含量的方法。


背景技术：

2.近年来，我国的水产养殖业发展迅速，规模化与集约化成为养殖的趋势，而水生动物疾病发生的频率也在提高。为了防治水产品疾病和加快水产品生长、繁殖，水产养殖业广泛而大量地使用抗生素。抗生素的离子形态对蛋白质和dna的具有较强的亲和力，投入的抗生素可通过生物蓄积作用在水产品中积累。尽管，水产品中抗生素的残留水平仅为痕量，长时间摄入会引发神经、造血系统，肝、肾内脏和胃肠道等的病变和抗生素过敏反应等毒副作用，因此，水产品中抗生素的残留检测，对人体饮食暴露风险评估和生态风险评估具有重要的意义。
3.水产品中含有丰富的蛋白质和脂肪，这对准确高效地测定水产品中抗生素含量具有较大的挑战。因此，建立一种有效的分离富集方法对准确测定水产品中抗生素的含量尤为重要。样品前处理中常用的提取方法主要有索式萃取法、加速溶剂萃取法、超声萃取法、微波萃取法等。其中，超声萃取法是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，具有操作简单、萃取效率高、温度低、时间短等优点，尤其适用于动物源样品。同时，抗生素的种类多、结构特点差异大，萃取溶剂的选择对回收率高低有着直接的影响，应尽可能最大限度地提高各类抗生素的回收率，而降低与其共存的其他杂质含量。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法(hplc)和高效液相色谱串联质谱法(hplc
–
ms/ms)。hplc
–
ms/ms兼具hplc强的分离能力，同时又具有ms高灵敏度和极强的定性鉴定能力，是目前检测环境复杂基质痕量抗生素残留最有效的手段之一，具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快和自动化程度高等优点。可准确地定性、定量测定复杂混合物的组分。
4.目前针对水产品中多种抗生素的分离富集和共检测尚无一套完整可靠的分析方法，现有的方法普遍存在不稳定、干扰多、检测抗生素的种类和数量有限、回收率有限等问题。因此，需要寻求一种快速、高效、灵敏、准确地检测出水产品中尽可能多的抗生素残留的包括分离富集和共检测的完整可靠的分析方法，以满足日趋严格的残留限量要求。


技术实现要素：

5.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测鱼体中15种抗生素的方法，其能够一次性同时检测出鱼肉中15种抗生素的残留情况，检测结果稳定、干扰小、快速、高效，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检测结果更真实可靠等优点。
6.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种检测鱼体中15种抗生素的方
法，包括：在鱼肉样品中依次加入内标物、提取溶液后超声萃取，获得的萃取液再加入固相萃取柱进行富集后洗脱、去脂，获得的样品溶液采用超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法进行测定，根据保留时间确定样品溶液中15种抗生素，采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中15种抗生素的含量。
7.优选地，所述15种抗生素包括磺胺类的磺胺嘧啶sd(cas号为68-35-9)、磺胺甲基嘧啶sm1(cas号为127-79-7)、磺胺二甲基嘧啶sm2(cas号为57-68-1)、磺胺间二甲氧基嘧啶sdm(cas号为122-11-2)、磺胺甲噁唑smx(cas号为723-46-6)，磺胺类增效剂的甲氧苄啶tmp(cas号为738-70-5)，氟喹诺酮类的恩诺沙星enr(cas号为93106-60-6)、环丙沙星盐酸盐cip(cas号为93107-08-5)、诺氟沙星nor(cas号为70458-96-7)，硝基呋喃类的呋喃唑酮aoz(cas号为67-45-8)，四环素类的盐酸金霉素ctc(cas号为64-72-2)、盐酸土霉素otc(cas号为2058-46-0)、盐酸多西环素dox(cas号为24390-14-5)，喹恶啉类的喹乙醇ola(cas号为23696-28-8)，氯霉素类的氟苯尼考ff(cas号为73231-34-2)。
8.优选地，所述鱼肉样品要进行匀浆。所述匀浆是将采集的鱼体样品洗净，用纱布吸干表面水分，剖取鱼体背部肌肉，将鱼皮分离，鱼肉样品中添加相同质量的水后匀浆。匀浆后的鱼肉样品置于-20℃冷冻。
9.优选地，所述内标物包括磺胺甲恶唑-d
4 smx-d4(cas号为1020719-86-1)、甲氧苄啶-d
3 tmp-d3(cas号为1189923-38-3)、诺氟沙星-d
5 nor-d5(cas号为1015856-57-1)、呋喃唑酮-d
4 aoz-d4(cas号为1217222-76-8)、四环素-d
6 tc-d6(cas号为60-54-8)、喹乙醇-d
4 ola-d4(cas号为1189487-82-8)和氟苯尼考-d
3 ff-d3(cas号为73231-34-2)。
10.更优选地，所述内标物中，磺胺甲恶唑-d
4 smx-d4作为磺胺嘧啶sd、磺胺甲基嘧啶sm1、磺胺二甲基嘧啶sm2、磺胺间二甲氧基嘧啶sdm、磺胺甲噁唑smx的内标物，甲氧苄啶-d3tmp-d3作为甲氧苄啶tmp的内标物，诺氟沙星-d
5 nor-d5作为恩诺沙星enr、环丙沙星cip、诺氟沙星nor的内标物，呋喃唑酮-d
4 aoz-d4作为呋喃唑酮aoz的内标物，四环素-d
6 tc-d6作为金霉素ctc、土霉素otc、盐酸多西环素dox的内标物，喹乙醇-d
4 ola-d4作为喹乙醇ola的内标物，氟苯尼考-d
3 ff-d3作为氟苯尼考ff的内标物。
11.考虑到不同种类的抗生素结构和性质存在很大的差别，添加内标物避免前处理过程中可能会有的损失。
12.优选地，所述鱼肉样品与7种内标物加入的质量之比为5.00
±
0.02：1
×
10-7
：1
×
10-7
：1
×
10-7
：1
×
10-7
：1
×
10-7
：1
×
10-7
：1
×
10-7
。
13.优选地，所述鱼肉样品加入内标物混匀后要避光静置5-15min，优选为10min。
14.优选地，所述提取溶液包括依次加入鱼肉样品中的乙腈、磷酸盐缓冲液。
15.更优选地，所述乙腈与磷酸盐缓冲液加入的体积之比为0.95-1.05:1，优选为1:1。
16.更优选地，所述磷酸盐缓冲液的ph值为2.95-3.05，优选为3。
17.更优选地，所述乙腈加入鱼肉样品后涡旋混合0.5-1.5min，优选为1min。以使蛋白质变性，释放与之结合的抗生素成分。
18.更优选地，所述乙腈磷酸盐缓冲液加入鱼肉样品后涡旋混合0.5-1.5min，优选为1min。为抗生素成分提供相对稳定的ph环境。
19.优选地，所述鱼肉样品加入的质量g与提取溶液加入的体积ml之比为5.00
±
0.02：18-22，优选为5.00
±
0.02：20。
20.优选地，所述超声萃取的时间为15-25min，优选为20min。
21.优选地，所述萃取液要离心后取上清液过滤，获得的提取液用水稀释后调节ph。
22.更优选地，所述离心时间为4-6min，所述离心转速为9000-11000r
·
min-1
。进一步优选地，所述离心时间为5min，所述离心转速为10000r
·
min-1
。
23.更优选地，所述过滤采用玻璃纤维滤膜进行过滤，所述玻璃纤维滤膜地孔径为0.6-0.8μm，优选为0.7μm。
24.更优选地，所述稀释至乙腈的体积比降至10％以下。
25.更优选地，所述ph值调节至2.5-3。可采用4mol
·
l-1
盐酸进行调节。
26.优选地，所述固相萃取柱为oasis hlb小柱。所述oasis hlb小柱由waters公司生产，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性n-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，适用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
27.优选地，所述固相萃取柱在富集前依次采用甲醇、水进行活化，所述活化中甲醇、水的用量均为固相萃取柱填料体积的1-2倍；所述固相萃取柱在富集后依次采用水、甲醇溶液进行淋洗、气推，所述淋洗中水、甲醇溶液的用量均为固相萃取柱填料体积的1-2倍。
28.更优选地，所述甲醇、水、甲醇溶液的用量均为6-12ml。
29.更优选地，所述甲醇溶液为体积百分比浓度≤10％的甲醇水溶液。所述甲醇水溶液中，甲醇与水的比例并没有特别的限定。其目的是洗去固相萃取柱中多余的杂质，但为了防止目标物同时被洗出的可能，淋洗所用水溶液中甲醇的比例不要超过10％。
30.更优选地，所述气推是以氮气气推的方式将固相萃取柱中残留的淋洗溶液排出。
31.优选地，所述固相萃取柱采用甲醇进行洗脱，所述甲醇用量为固相萃取柱填料体积的2-3倍。
32.更优选地，所述甲醇的用量为10-15ml。
33.优选地，所述固相萃取柱中活化、上样、淋洗、洗脱的流速均不超过5ml
·
min-1
。
34.优选地，所述去脂是将洗脱液在水浴中用氮气吹干，加入溶解液溶解残留物，再加入正己烷涡旋混合后离心，取下层清液过滤，获得样品溶液待测。由于乙腈是非极性溶剂，能够提取大量脂肪类杂质，因此需要正己烷进一步除脂。
35.更优选地，所述水浴的温度为35-45℃，优选为40℃。
36.更优选地，所述溶解液选自甲醇、乙腈或体积百分比浓度为70-80％的甲醇水溶液中的一种。
37.更优选地，所述溶解液的用量为0.5-1.5ml，优选为1.0ml。
38.更优选地，所述正己烷的用量为1.5-2.5ml，优选为2.0ml。
39.更优选地，所述涡旋混合的时间为20-40s，优选为30s。
40.更优选地，所述离心时间为4-6min，所述离心转速为9000-11000r
·
min-1
。进一步优选地，所述离心时间为5min，所述离心转速为10000r
·
min-1
。
41.更优选地，所述过滤采用针式过滤器进行过滤，所述针式过滤器的滤膜为孔径为0.22μm的有机相(尼龙)滤膜。
42.优选地，所述样品溶液采用超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法进行测定，包括以下步骤：
43.1)配制标准溶液：取15种抗生素标准品，加入内标物和甲醇溶液，配成标准溶液；
44.2)样品检测：采用超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法的正离子模式和负离子模式分别检测样品溶液和步骤1)中的标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图，与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性，再根据共有特征峰的色谱峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中15种抗生素的浓度。
45.更优选地，步骤1)中，所述标准溶液中7种内标物的浓度为100.0μg
·
l-1
。
46.更优选地，步骤1)中，所述甲醇溶液为体积百分比浓度为65-75％的甲醇水溶液，体积百分比浓度为优选为70％。
47.更优选地，步骤1)中，所述标准溶液中15种抗生素的浓度范围均为1.37-500μg
·
l-1
。
48.更优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法中，采用负离子模式检测氟苯尼考，采用正离子模式检测除氟苯尼考外其它14种抗生素。
49.更优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法中，正离子模式采用waters acquityuplciclass超高效液相色谱串联waters tq-xs质谱仪进行检测。
50.进一步优选地，所述正离子模式进行检测时，所述超高效液相色谱(uplc)的测定条件为：
51.色谱柱：c18柱；柱温：35-45℃；进样量：1-2μl；流速：0.3-0.4ml
·
min-1
；流动相a相为体积百分比浓度为0.4-0.6％的甲酸水溶液；流动相b相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
52.最优选地，所述超高效液相色谱(uplc)的测定条件为：
53.色谱柱：waters acquity uplc beh c18柱(内径2.1
×
柱长50mm，粒径0.7μm)；柱温：40℃；进样量：1.5μl；流速：0.35ml
·
min-1
；流动相a相为体积百分比浓度为0.5％的甲酸水溶液；流动相b相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
54.最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
55.0-1min，a相：b相体积比为92：8-92：8；
56.1-1.2min，a相：b相体积比为92：8-80：20；
57.1.2-2.5min，a相：b相体积比为80：20-80：20；
58.2.5-2.7min，a相：b相体积比为80：20-5：95；
59.2.7-4.5min，a相：b相体积比为5：95-5：95；
60.4.5-4.7min，a相：b相体积比为5：95-92：8；
61.4.7-7.5min，a相：b相体积比为92：8-92：8。
62.进一步优选地，所述正离子模式进行检测时，所述质谱(ms/ms)的测定条件为：
63.电离方式：电喷雾离子源(esi)，正离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式：多反应监测模式mrm；扫描时间为0.1s；碰撞气为氩气；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流流量为1000l
·
hr-1
；锥孔电压为3500v。
64.最优选地，所述除氟苯尼考外其它14种抗生素和对应内标物的母离子质荷比、子离子质荷比、锥孔电压、碰撞能量见表1。
65.表1 14种抗生素和内标的质谱检测条件
[0066][0067]
注：*表示定量离子；**表示定量离子对应的碰撞能量。
[0068]
更优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法中，负离子模式采用岛津30a超高效液相色谱串联ab 5500q-trap质谱仪(美国ab公司)进行检测。
[0069]
进一步优选地，所述负离子模式进行检测时，所述超高效液相色谱(uplc)的测定条件为：
[0070]
色谱柱：c18柱；柱温：35-45℃；进样量：1-2μl；流速：0.3-0.4ml/min；流动相a相为水；流动相b相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
[0071]
最优选地，所述超高效液相色谱(uplc)的测定条件为：
[0072]
色谱柱：waters acquity uplc beh c18柱(内径2.1
×
柱长100mm，粒径0.7μm)；柱温：40℃；进样量：1.5μl；流速：0.35ml/min；流动相a相为水；流动相b相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
[0073]
最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
[0074]
0-1min，a相：b相体积比为90：10-90：10；
[0075]
1-1.2min，a相：b相体积比为90：10-60：40；
[0076]
1.2-3min，a相：b相体积比为60：40-60：40；
[0077]
3-3.5min，a相：b相体积比为60：40-10：90；
[0078]
3.5-5min，a相：b相体积比为10：90-10：90；
[0079]
5-5.2min，a相：b相体积比为10：90-90：10；
[0080]
5.2-7.5min，a相：b相体积比为90：10-90：10。
[0081]
进一步优选地，所述负离子模式进行检测时，所述质谱(ms/ms)的测定条件为：
[0082]
电离方式：电喷雾离子源(esi)，负离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式：多反应监测模式mrm；碰撞气为氮气；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500v，气帘气cur为35psi，喷雾气gs1为50psi，辅助加热气gs2为50psi。
[0083]
最优选地，所述氟苯尼考和对应内标物的母离子质荷比、子离子质荷比、锥孔电压、碰撞能量见表2。
[0084]
表2氟苯尼考和内标的质谱检测条件
[0085][0086]
注：*表示定量离子；**表示定量离子对应的碰撞能量。
[0087]
优选地，步骤2)中，所述内标标准曲线法包括以下步骤：
[0088]
a1)将含有一系列不同浓度的15种抗生素的标准溶液，分别进行高效液相色谱质谱联用法的正离子模式和负离子模式分析，获得15种抗生素成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值与相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值的线性关系，绘制相应的标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到15种抗生素成分的标准曲线的回归方程；
[0089]
a2)将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的15种抗生素成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值，代入步骤a1)中相应成分的标准工作曲线的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中15种抗生素成分的浓度。
[0090]
更优选地，步骤a1)或a2)中，所述标准工作曲线中，以15种抗生素成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值为纵坐标(y轴)，其相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值为横坐标(x轴)。
[0091]
本发明中使用的水均为超纯水。
[0092]
如上所述，本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，采用超声萃取-固相萃取结合高效液相色谱串联质谱技术，对提取方法、富集净化条件、液质检测条件进行优化，具有以下有益效果：
[0093]
(1)本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，采用超声萃取发对鱼肉中的抗生素进行提取，萃取效率高、萃取剂用量少、萃取时间短。
[0094]
(2)本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，使用有机溶剂和缓冲溶液的复合溶液作为提取液，使目标物在提取过程中处于相对稳定的ph环境中，相比仅用有机溶剂提取的方法，目标物回收率更稳定、提取效率高、基质效应小。
[0095]
(3)本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，选择oasis hlb固相萃取柱对7类15种抗生素进行富集净化，回收率高且稳定，选择性强，吸附容量大，能够有效分离干扰物，达到了目标物分离富集的目的。
[0096]
(4)本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，采用内标标准曲线法对抗生素定量，测定结果线性关系好，相对偏差小，提高了分析的精密度。
[0097]
(5)本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，采用超高效液相色谱串联质谱仪进行定量分析检测，灵敏度高，15种抗生素的仪器检测限均低于2μg
·
l-1
，能够满足对鱼肉中痕量抗生素的检测要求。此外，串联三重四级杆质谱仪根据对应母离子碰撞产生的特征碎片离子进行定性分析，选择性强，排除了样品中其他杂质信号的干扰。
[0098]
(6)本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，将指示回收率的内标物质加在添加提取液前，能够更准确地表示整个前处理过程中抗生素的损失，同时，考虑到不同
种类抗生素在前处理过程中有不同程度的损失，对同类抗生素选用同种内标物指示回收率。由于内标物选用得当，使得最终检测结果更加真实可靠。而现有的微量抗生素检测方法中，大多数仅用一种内标物质标定所有种类抗生素，这样检测出的结果会有一些偏差。
[0099]
(7)本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，有机试剂使用量少，环境友好。可一次性同时检测出鱼肉中15种抗生素的残留情况，检测过程耗时少，节约人力物力成本。
[0100]
(8)本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，能够实现快速、高效、灵敏、准确地同时检测出鱼肉中7类15种抗生素，大大提高了检测效率，并且检测结果稳定、干扰小，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检测结果更真实可靠等优点。
附图说明
[0101]
图1为本发明中使用3种不同提取溶液测得的鱼肉中15种抗生素的加标回收率图。
具体实施方式
[0102]
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
[0103]
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0104]
以下实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。
[0105]
实施例1
[0106]
1、样品前处理
[0107]
将采集的鱼体样品洗净，用纱布吸干表面水分，剖取鱼体背部肌肉，将鱼皮分离，鱼肉样品中添加相同质量的水后匀浆，处理后的样品迅速置于-20℃冷冻，待进一步提取。
[0108]
称取5.00g匀浆的鱼肉样品于30ml玻璃离心管中，分别加入100ng的磺胺甲恶唑-d4、甲氧苄啶-d3、诺氟沙星-d5、呋喃唑酮-d4、四环素-d6、喹乙醇-d4和氟苯尼考-d3这7种内标物，充分混匀后，避光静置10min。再向离心管中加入10ml乙腈，涡旋混合1min，乙腈可使蛋白质变性，释放与之结合的药物，再加入10ml ph＝3的磷酸盐缓冲液，涡旋混合1min，缓冲液为目标物提供相对稳定的ph环境，超声萃取20min。然后，以10000r
·
min-1
转速离心5min，取上清液采用孔径为0.7μm的玻璃纤维滤膜过滤，收集提取液，用蒸馏水稀释至250ml，用4mol
·
l-1
盐酸调节ph值至2.5。
[0109]
使用reekofotector plus全自动固相萃取仪，选用的固相萃取柱为oasis hlb小柱。在富集前依次采用甲醇(5ml
·
min-1
，6ml)、水(5ml
·
min-1
，6ml)进行活化，再将250ml提取液以3.5ml
·
min-1
速度上样过柱进行富集，在富集后依次采用超纯水(5ml
·
min-1
，6ml)、体积百分比浓度为5％的甲醇水溶液(5ml
·
min-1
，6ml)进行淋洗、气推干燥，最后采用甲醇洗脱(5ml
·
min-1
，10ml)，获得洗脱液。洗脱液于40℃的水浴中氮气吹干，加1.0ml体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液溶解残留物，转入4ml离心管中，再加入2.0ml正己烷涡旋混合
30s，以10000r
·
min-1
离心5min，弃上层正己烷层，取下层清液，经孔径为0.22μm的有机相(尼龙)针式过滤器进行过滤至棕色进样瓶中，获得样品溶液待测。
[0110]
2、标准溶液
[0111]
取15种抗生素标准品，加入7种内标物和体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液，配成一系列不同浓度标准溶液。其中，15种抗生素包括磺胺嘧啶sd、磺胺甲基嘧啶sm1、磺胺二甲基嘧啶sm2、磺胺间二甲氧基嘧啶sdm、磺胺甲噁唑smx、甲氧苄啶tmp、恩诺沙星enr、环丙沙星cip、诺氟沙星nor、呋喃唑酮aoz、金霉素ctc、土霉素otc、盐酸多西环素dox、喹乙醇ola、氟苯尼考ff。标准溶液中7种内标物的浓度为100.0μg
·
l-1
。一系列不同浓度标准溶液中15种抗生素的浓度分别为1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33、500μg
·
l-1
。
[0112]
3、检测
[0113]
采用超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法的正离子模式和负离子模式分别检测样品溶液和标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图，与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性，再根据共有特征峰的色谱峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中15种抗生素的浓度。
[0114]
具体来说，将含有一系列不同浓度的15种抗生素的标准溶液，分别进行高效液相色谱质谱联用法的正离子模式和负离子模式分析，获得15种抗生素成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值与相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值的线性关系，绘制相应的标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到15种抗生素成分的标准曲线的回归方程。再将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的15种抗生素成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值，代入相应成分的标准工作曲线的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中15种抗生素成分的浓度。
[0115]
其中，超高效液相色谱串联质谱(uplc-ms/ms)法中，采用负离子模式检测氟苯尼考，采用正离子模式检测除氟苯尼考外其它14种抗生素。
[0116]
正离子模式采用waters acquityuplciclass超高效液相色谱串联waters tq-xs质谱仪进行检测。
[0117]
超高效液相色谱(uplc)的测定条件为：色谱柱：waters acquity uplc beh c18柱(内径2.1
×
柱长50mm，粒径0.7μm)；柱温：40℃；进样量：1.5μl；流速：0.35ml
·
min-1
；流动相a相为体积百分比浓度为0.5％的甲酸水溶液；流动相b相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
[0118]
梯度洗脱的具体程序为：
[0119]
0-1min，a相：b相体积比为92：8-92：8；
[0120]
1-1.2min，a相：b相体积比为92：8-80：20；
[0121]
1.2-2.5min，a相：b相体积比为80：20-80：20；
[0122]
2.5-2.7min，a相：b相体积比为80：20-5：95；
[0123]
2.7-4.5min，a相：b相体积比为5：95-5：95；
[0124]
4.5-4.7min，a相：b相体积比为5：95-92：8；
[0125]
4.7-7.5min，a相：b相体积比为92：8-92：8。
[0126]
质谱(ms/ms)的测定条件为：电离方式：电喷雾离子源(esi)，正离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式：多反应监测模式mrm；扫描时间为0.1s；碰撞气为氩气；脱
溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流流量为1000l
·
hr-1
；锥孔电压为3500v。除氟苯尼考外其它14种抗生素和对应内标物的母离子质荷比、子离子质荷比、锥孔电压、碰撞能量见表1。
[0127]
负离子模式采用岛津30a超高效液相色谱串联ab 5500 q-trap质谱仪(美国ab公司)进行检测。
[0128]
超高效液相色谱(uplc)的测定条件为：色谱柱：waters acquity uplc beh c18柱(内径2.1
×
柱长100mm，粒径0.7μm)；柱温：40℃；进样量：1.5μl；流速：0.35ml
·
min-1
；流动相a相为水；流动相b相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
[0129]
梯度洗脱的具体程序为：
[0130]
0-1min，a相：b相体积比为90：10-90：10；
[0131]
1-1.2min，a相：b相体积比为90：10-60：40；
[0132]
1.2-3min，a相：b相体积比为60：40-60：40；
[0133]
3-3.5min，a相：b相体积比为60：40-10：90；
[0134]
3.5-5min，a相：b相体积比为10：90-10：90；
[0135]
5-5.2min，a相：b相体积比为10：90-90：10；
[0136]
5.2-7.5min，a相：b相体积比为90：10-90：10。
[0137]
质谱(ms/ms)的测定条件为：电离方式：电喷雾离子源(esi)，负离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式：多反应监测模式mrm；碰撞气为氮气；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500v，气帘气cur为35psi，喷雾气gs1为50psi，辅助加热气gs2为50psi。氟苯尼考和对应内标物的母离子质荷比、子离子质荷比、锥孔电压、碰撞能量见表2。
[0138]
实施例2
[0139]
鱼肉样品的基质复杂，含有蛋白质、脂肪、糖类、无机盐、水分等化合物。这些样品基质会影响待测物的提取效率，使检测结果产生误差，同时也会污染仪器，直接影响检测效率和准确率。因此，在兽药残留分析中，样品的前处理技术非常关键，主要目的是将目标化合物与样品基质分离，去除干扰杂质。同时，目标抗生素的种类多，物化性质差异大，为了实现鱼肉中多种抗生素提取效率的最大化，本发明采用单因素试验研究了3种不同提取液对目标物的提取效果。
[0140]
按实施例1中步骤1获得匀浆的鱼体样品，设立两组用于对比实验的鱼肉样品，一组为标准样品组，另一组为空白样品组，每组设3个平行。准确称取5.00g的鱼肉样品于30ml玻璃离心管中，分别向鱼肉样品中加入50、100、200ng的15种抗生素的混合标准溶液作为标准样品组，使添加到鱼肉中的15种抗生素的最终浓度分别为20ng
·
g-1
、40ng
·
g-1
、80ng
·
g-1
。空白样品组不添加任何抗生素。
[0141]
分别将标准样品组和空白样品组按实施例1中步骤1进行超声萃取，其中采用3种不同的萃取溶剂，分别为
①
乙腈-ph＝3磷酸盐缓冲溶液(v:v＝1:1)；
②
乙腈-ph＝3柠檬酸缓冲溶液(v:v＝1:1)；
③
酸化乙腈，即体积比为99:1的乙腈和乙酸的混合溶液。再按实施例1中步骤1进行固相萃取(spe)。获得的样品溶液，按实施例1中步骤3进行检测，测得鱼肉中15种抗生素的加标回收率，结果见图1。从图1可看出，采用乙腈:ph＝3磷酸盐缓冲溶液(v:v＝1:1)作为提取溶剂时，回收率最高，效果最好。因此，在鱼肉的实际检测中，选用乙腈:ph＝3磷酸盐缓冲溶液(v:v＝1:1)作为超声萃取的提取溶液。
[0142]
实施例3
[0143]
按实施例1的步骤2，将15种抗生素混合标准溶液用70％的甲醇-水溶液稀释成一系列浓度梯度(1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33、500μg
·
l-1
)，内标以100.0μg
·
l-1
的浓度添加到标准品中，用内标法以成分与内标的浓度比为横坐标，响应值(响应值＝目标物峰面积/内标物峰面积)为纵坐标绘制7点标准曲线，得到标准曲线和相关系数(r2)。同时，采用信噪比法(s/n)确定仪器的检出限和定量限，以3倍信噪比估算检出限(lod)，10倍信噪比估算定量限(loq)。15种抗生素的标准曲线、相关系数、检出限和定量限如表3所示。
[0144]
由表6可知，15种抗生素成分具有良好的线性关系，相关系数(r2)均大于0.98。
[0145]
表3
[0146][0147]
实施例4
[0148]
按实施例1的步骤1和3，对鱼肉样品进行加标回收率实验。设置3组加标浓度，分别为20、40、80ng
·
g-1
，每组样品做3个平行，计算加标回收率(re)和相对标准偏差(rsd)。
[0149]
加标回收率(re％)的计算公式如下：其中，c0为混合标准溶液的浓度，μg
·
l-1
；c1为未加入混合标准溶液样品的检测浓度，μg
·
l-1
；c2为加入混合标准溶液样品的检测浓度，μg
·
l-1
；v0为混合标准溶液的体积，l；v1为未加入混合标准溶液样品的上机前定容体积，l；v2为加入混合标准溶液样品的上机前定容体积，l。
[0150]
本方法考察了鱼肉中15种抗生素3个浓度的加标回收率，结果如4表所示。各抗生素的加标回收率在61.1-124.9％，相对标准偏差均低于10％，加标回收率存在差异，说明不同抗生素存在不同的基质干扰；通过添加内标物计算加标回收率，并用其对检验结果进行校正，可以降低基质干扰带来的影响。
[0151]
表4鱼肉样品中不同加标浓度的加标回收率及相对标准偏差
[0152][0153][0154]
实施例5
[0155]
采集上海某水产养殖区青鱼和市场鲶鱼，按实施例1的步骤1对样品进行提取和富集净化，按实施例1的步骤3对样的实际浓度进行检测分析，以考察本方法对不同种类鱼肉样品的适用性。实际检测得到的青鱼和鲶鱼肌肉样品中15种抗生素含量如表5所示。实验结果表明，本方法可以应用于鱼肉中多种抗生素含量的测定，具有良好的适用性。
[0156]
表5青鱼和鲶鱼肌肉样品中15种抗生素的含量
[0157][0158]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对
上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。