一种金沙藤对照提取物及其质量控制方法和应用与流程

1.本发明属于中药技术领域，具体地说，涉及一种金沙藤对照提取物及其质量控制方法和应用。


背景技术：

2.金沙藤为海金沙科植物海金沙lygodinm japonicum(thunb.)sw.、小叶海金沙lygodium microphyllum(cav.)r.br.、曲轴海金沙lygodium flexuosum(l.)sw.的干燥地上部分，主要含挥发油、黄酮类、酚酸类和苯丙素类化合物，收载于《广西中药材标准》、《广西壮药质量标准》等地方药材标准。目前的金沙藤药材的质量控制方法中，需要采用多种单一成分作为对照品对金沙藤药材的质量进行鉴别和测定，步骤较为繁琐，且不能完善的反应金沙藤药材的真实质量。
3.三金片为2015年版《中国药典》收载的中成药品种，金沙藤药材是处方五味药材之一，但目前其标准薄层鉴别项下缺少金沙藤药材的质量控制方法，且没有对应的明确的指标成分，同时缺少相关对照品，基础研究较为薄弱。
4.有鉴于此特提出本发明。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种金沙藤对照提取物及其质量控制方法和应用。本发明提供的金沙藤对照提取物，可以作为对照物质用于检测金沙藤药材及制剂的质量，解决了对照品缺乏的问题，也完善了金沙藤制剂的质量控制标准，有利于提升制剂整体质量。
6.为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
7.本发明的第一目的是提供一种金沙藤对照提取物，金沙藤对照提取物由以下方法制成：
8.取金沙藤药材，用水加热回流提取，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩，离心，滤过，加入等量的乙酸乙酯，搅匀，静置，取上清液，减压回收乙酸乙酯，加适量甲醇溶解，离心取上清液，加入适量的微粉硅胶，减压干燥成稠膏，冷冻干燥，再加入适量微粉硅胶，粉碎，即得。
9.本发明提供的一种金沙藤对照提取物，可以作为对照物质用于检测金沙藤药材及制剂的质量，解决了对照品缺乏的问题；同时大大简化了对照品的制备步骤，方便使用者，也有利于提高检测效率。
10.进一步的方案，所述金沙藤对照提取物中水分的含量不超过5.0％。
11.进一步的方案，所述金沙藤对照提取物为浅棕色或棕色粉末，具有引湿性。
12.本发明检测并明确了金沙藤对照提取物的形状和性质，有利于为确定存储和包装条件提供理论依据。根据金沙藤对照提取物的含水量和引湿性，可以采用全封闭的棕色安剖瓶，这样既防止储藏过程中潮解吸湿，也方便用户使用，储藏条件为4℃，避光保存。在使
用时应快速完成称样。
13.本发明的第二目的是提供一种如上所述的金沙藤对照提取物的质量控制方法，包括：检测金沙藤提取物的水分和引湿性；采用薄层色谱法对金沙藤提取物进行鉴别；采用高效液相色谱法对金沙藤提取物进行含量测定。
14.进一步的方案，采用薄层色谱法对金沙藤提取物进行鉴别的方法包括：
15.(1)制备金沙藤对照提取物溶液；
16.(2)制备金沙藤药材供试品溶液；
17.(3)照薄层色谱法，吸取金沙藤药材供试品溶液和金沙藤对照提取物溶液点于同一薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸混合溶液为展开剂，进行薄层鉴别。
18.进一步的所述展开剂中，二氯甲烷：甲醇：甲酸的体积比为(8-12):2:0.2。
19.采用上述展开剂，且展开剂中各成分的比例如上时，展开的效果好，在不同薄层板上展开的差异小，更稳定，且展开剂无毒，使用方便。
20.作为优选的实施方式，二氯甲烷：甲醇：甲酸的体积比为8:2:0.2。
21.进一步的方案，采用高效液相色谱法对金沙藤提取物进行含量测定的方法包括：
22.(1)取咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷对照品制成对照品溶液；
23.(2)制备金沙藤对照提取物溶液；
24.(3)采用高效液相色谱法，检测对照品和金沙藤对照提取物溶液中各成分的含量，色谱条件包括：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，0.4％磷酸为流动相b，梯度洗脱；柱温30℃，检测波长为354nm；流速为1ml/min；理论板数按咖啡酸峰计算应不低于10000。
25.进一步的，所述梯度洗脱的条件包括：
[0026][0027]
本发明通过大量的条件实验摸索了最佳的色谱条件、洗脱条件，在上述方法下，所得色谱图的分离度好，干扰少，峰形好，稳定度高，方法学验证效果好，有利于准确测量各成分的含量。
[0028]
本发明的第三目的是提供一种利用如上所述的金沙藤对照提取物检测金沙藤制剂质量的方法，其特征在于，包括：
[0029]
(1)制备金沙藤对照提取物溶液；
[0030]
(2)制备金沙藤制剂供试品溶液；
[0031]
(3)照薄层色谱法，吸取金沙藤制剂供试品溶液和金沙藤对照提取物溶液点于同一薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸-丙酮为展开剂，进行薄层鉴别；
[0032]
优选的，所述金沙藤制剂包括三金制剂。
[0033]
本发明将金沙藤对照提取物应用于金沙藤制剂，例如三金片的质量检测，填补了
金沙藤中指标的检测空白，进一步完善了金沙藤制剂的质量控制标准，有利于提升制剂整体质量。
[0034]
优选的，薄层板为高效硅胶g薄层板。
[0035]
进一步的，展开剂中环己烷：乙酸乙酯：甲酸：丙酮的体积比为15:15:0.5:1。
[0036]
采用上述展开剂，且展开剂中各成分的比例如上时，展开的效果好，在不同薄层板上展开的差异小，更稳定。
[0037]
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
[0038]
1、本发明提供的金沙藤对照提取物，可以作为作为对照物质用于检测金沙藤药材及制剂的质量，解决了对照品缺乏的问题；同时大大简化了对照品的制备步骤，方便使用者，也有利于提高检测效率。
[0039]
2、本发明针对金沙藤对照提取物提出并优化了质量控制条件，有利于金沙藤对照提取物的生产和使用。另外还提出了质量标准草案，有利于产品质量控制。
[0040]
3、本发明将金沙藤对照提取物应用于金沙藤制剂，例如三金片的质量检测，填补了金沙藤中指标的检测空白，进一步完善了金沙藤制剂的质量控制标准，有利于提升制剂整体质量。
[0041]
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
[0042]
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
[0043]
图1是本发明实施例3中，采用硅胶g-merck板，展开剂为二氯甲烷-甲醇-甲酸(8：2：0.2)条件下的展开效果图；
[0044]
图2是本发明实施例3中，采用硅胶g-merck板，展开剂为二氯甲烷-甲醇-甲酸(10：2：0.2)条件下的展开效果图；
[0045]
图3是本发明实施例3中，采用硅胶g-merck板，展开剂为二氯甲烷-甲醇-甲酸(12：2：0.2)条件下的展开效果图；
[0046]
图4是本发明实施例3中，采用青岛海洋硅胶g板，展开剂为二氯甲烷-甲醇-甲酸(8：2：0.2)条件下的展开效果图；
[0047]
图5是本发明实施例3中，采用聚酰胺薄膜的展开效果图；
[0048]
图6是本发明实施例3中，采用甲醇-冰醋酸-水(4:1:5)为展开剂的展开效果图；
[0049]
图7是实施例4中对照品溶液与供试品溶液的色谱图，其中，金沙藤对照提取物(a)、金沙藤药材(b)和对照品(c)；1：咖啡酸，2:异槲皮苷，3:山柰酚-3-o-芸香糖苷，4:紫云英苷；
[0050]
图8是采用实施例4中采用waters柱(a)与agilent柱(b)的色谱图；
[0051]
图9是实施例4方法耐用性中采用waters symmetry shield
tm rp18柱的色谱图；
[0052]
图10是实施例4方法耐用性中采用shiseido capcell pakc18柱的色谱图；
[0053]
图11是实施例4方法耐用性中采用eclipse xdb-c18柱的色谱图；
[0054]
图12是实施例5中方法1的结果图；
[0055]
图13是实施例5中方法2的结果图。
[0056]
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
[0057]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0058]
仪器与试剂：waters 2695型高效液相色谱仪。色谱柱:agilent zorbax sb-c18(250
×
4.6mm，5um)和waters symmetry shield
tm rp18(250
×
4.6mm，5um)。超声波清洗器(型号kq-500e，昆山超声仪器有限公司)。电子天平(型号xs105du，型号fx-200)。硅胶g薄层板(merck公司和青岛海洋公司)、聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥西甲生化塑料厂)。甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，美国fisher公司)，乙醇、三氯化铝、二氯甲烷、正丁醇、冰醋酸和乙酸乙酯(分析纯，国药集团公司)，水由milli-q系统(美国millipore公司)制备。
[0059]
金沙藤对照提取物(批号:191103、191104、190904)、金沙藤药材(批号:191103、191104、190904)、三金片(批号:190904、190930、190935)均由桂林三金药业股份有限公司提供。对照品咖啡酸(110885-201703.99.7％)、异槲皮苷(111809-201804，97.2％)、山柰酚-3-o-芸香糖苷(112007-201602，90.8％)由中国食品药品检定研究院提供。紫云英苷(98.61％)由桂林三金药业股份有限公司提供。
[0060]
实施例1金沙藤对照提取物制备
[0061]
取金沙藤药材，用水加热回流提取2次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液减压浓缩至约1.5-2倍药材重量的清膏，离心，滤过，加入等量的乙酸乙酯，搅匀，静置，取上清液，减压回收乙酸乙酯，加适量甲醇溶解，离心取上清液，加入适量的微粉硅胶，减压干燥成稠膏，冷冻干燥，再加入适量微粉硅胶，粉碎，即得。所述金沙藤对照提取物为浅棕色或棕色粉末。
[0062]
参照本实施例方法，制备了3个批次的金沙藤对照提取物(批号:191103、191104、190904)。
[0063]
实施例2检测金沙藤对照提取物的水分和引湿性
[0064]
1、水分检测
[0065]
方法：
[0066]
减压干燥器取直径12cm左右的培养皿，加入五氧化二磷干燥剂适量，使铺成0.5～l cm的厚度，放入直径30cm的减压干燥器中。
[0067]
测定法：取金沙藤对照提取物供试品2～4g，混合均匀，分取约0.5～l g，置已在供试品同样条件下干燥并称重的称量瓶中，精密称定，打开瓶盖，放入上述减压干燥器中，减压至2.67kpa(20mmhg)以下持续半小时，室温放置24小时。在减压干燥器出口连接无水氯化钙干燥管，打开活塞，待内外压一致，关闭活塞，打开干燥器，盖上瓶盖，取出称量瓶迅速精密称定重量，计算供试品中的含水量(％)。
[0068]
结果
[0069]
3批次金沙藤对照提取物的水分分别为2.3％(批号191103)、1.4％(批号191104)、1.8％(批号190904)。
[0070]
2、引湿性
[0071]
方法：
[0072]
药物的引湿性是指在一定温度及湿度条件下该物质吸收水分能力或程度的特性。具体试验方法如下:
[0073]
1)取干燥的具塞玻璃称量瓶(外径为50mm，高为15mm)于前一天置于适宜的25℃士1℃恒温干燥器(下部放置氯化铵或硫酸铵饱和溶液)或人工气候箱(设定温度为25℃士1℃，相对湿度为80％土2％)内，精密称重(m1)。
[0074]
2)取金沙藤对照提取物供试品适量，置上述称量瓶中并平铺于称量瓶内，供试品厚度一般约为1mm，精密称重(m2)。
[0075]
3)将称量瓶敞口，并与瓶盖同置于上述恒温恒湿条件下24小时。
[0076]
4)盖好称量瓶盖子，精密称重(m3)。增重百分率＝(m3-m2)/(m2-m1)
×
100％。
[0077]
5)引湿性特征描述与引湿性增重的界定。潮解:吸收足量水分形成液体。极具引湿性:引湿增重不小于15％。有引湿性:引湿增重小于15％但不小于2％。略有引湿性。引湿增重小于2％但不小于0.2％。无或几乎无引湿性:引湿增重小于0.2％。
[0078]
结果：3批次金沙藤对照提取物的引湿增重分别为7.8％(批号191103)、6.5％(批号191104)、8.3％(批号190904)，引湿性特征描述均为有引湿性。
[0079]
实施例3金沙藤对照提取物的薄层鉴别
[0080]
金沙藤的化学成分主要以黄酮及酚酸类化合物为主，这类成分在薄层鉴别方面专属性较低，故以金沙藤药材与对照提取物作比较，建立薄层鉴别方法。传统的氯仿-甲醇-甲酸系统常用于展开黄酮及酚酸类成分，考虑到氯仿毒性较强。本实验以二氯甲烷替代氯仿，并以二氯甲烷-甲醇-甲酸不同的比例，探索较为良好的薄层展开条件，并考察了硅胶g板与聚酰胺薄膜的展开效果，具体如下：
[0081]
1、样品提取方法：称取金沙藤药材1g，加水25ml，水浴回流提取1h，放冷后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯，蒸干，用1ml甲醇溶解，即得供试品溶液。
[0082]
取金沙藤对照提取物50mg，加甲醇溶解后定容至10ml，即得金沙藤对照提取物溶液。
[0083]
展开方法：照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶g薄层板或聚酰胺薄膜上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％％三氯化铝乙酪溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365nm)下检视。
[0084]
结果判断：对照提取物色谱中，在与金沙藤药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。
[0085]
2、薄层鉴别结果
[0086]
以硅胶g薄层板(merck和青岛海洋)、聚酰胺薄膜及不同比例的展开剂展开，其中点样量均为1μl，点e1、e2、e3分别为金沙藤对照提取物(对应批号为191103、191104、190904)，点ll、l2、l3分别为金沙藤药材(对应批号为191103、191104、190904)。
[0087]
采用硅胶g-merck板在不同展开剂下展开的结果如图1-3所示。由展开结果可看出，二氯甲烷-甲醇-甲酸(8：2：0.2)系统展开效果较好，对比同展开剂下merck和青岛海洋
硅胶g板(图1和图4)，其展开差异较小。
[0088]
聚酰胺薄膜展开结果如图5所示，其中二氯甲烷-甲醇-甲酸(10∶2∶0.2)展开系统较好。
[0089]
尝试用甲醇-冰醋酸-水(4:1:5)为展开剂，展开结果如图6所示，效果较差。
[0090]
因此，综合上述结果，采用二氯甲烷-甲醇-甲酸为展开剂，其中，二氯甲烷：甲醇：甲酸的体积比为8：2：0.2或10：2：0.2；优选8：2：0.2。
[0091]
实施例4金沙藤对照提取物的高效液相色谱法测定
[0092]
1、色谱条件：照《中国药典》2015年版一部高效液相色谱法(通则0512)测定。
[0093]
色谱柱为waters symmetry shield
tm rp18(250
×
4.6mm，5um)，以乙腈为流动相a，0.4％磷酸为流动相b，梯度洗脱，洗脱程序见下表1；柱温30℃，检测波长为354nm，流速为1ml/min；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定。
[0094]
表1洗脱程序
[0095]
时间(min)流动相b(％)0-4090
→
7540-4575
→
6045-5060
→
10
[0096]
2、溶液的制备
[0097]
对照品溶液的制备：取咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含咖啡酸0.01mg、异槲皮苷0.04mg、山柰酚-3-o-芸香糖苷0.06mg、紫云英苷0.02mg的溶液，即得。
[0098]
供试品溶液的制备，取金沙藤对照提取物约50mg，精密称定，置25ml具塞容量瓶中，加10％甲醇定容到刻度，摇匀，超声提取30min，取上清液，即得供试品溶液。
[0099]
3、结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定。供试品色谱中呈现与对照品色谱保留时间相同的色谱峰，色谱图如图7所示，其中，金沙藤对照提取物(a)、金沙藤药材(b)和对照品(c)；1:咖啡酸，2:异槲皮苷，3:山柰酚-3-o-芸香糖苷，4:紫云英苷。
[0100]
通过对比咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷对照品的光谱图，在对照提取物中对应峰与对照品的光谱图一致，因此确定对照提取物中的指标成分。
[0101]
4、色谱条件探索
[0102]
(1)本实验以0.4％磷酸和乙腈为流动相，分别选用色谱柱agilent zorbaxsb-c18(250
×
4.6mm，5um)和waters symmetry shield
tm rp18(250
×
4.6mm，5um)进行色谱条件优化，通过优化梯度洗脱程序，其色谱图如图8所示，两色谱柱分离效果均可达到测定要求，进一步通过分离度及峰形比较，最后选用waters symmetry shield tm rp18色谱柱进行分析，优化后的洗脱程序如上表1所示。
[0103]
(2)检测波长选择
[0104]
由于不同波长下，金沙藤对照提取物的成分较为复杂，通过提取不同波长下的色谱图比较，发现检测波长为354nm左右，测定的指标成分(咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷)干扰较少，且峰形较好，吸收值较为一致。故本实验选定检测波长为354nm。
[0105]
5、方法学考察
[0106]
对照品溶液的制备：取咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含咖啡酸0.01mg、异槲皮苷0.04mg、山柰酚-3-o-芸香糖苷0.06mg、紫云英苷0.02mg的溶液，即得。
[0107]
供试品溶液的制备：取本品约50mg，精密称定，置20ml具塞容量瓶中，加甲醇溶解定容到刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0108]
(1)灵敏度和线性
[0109]
分别精密吸取制备的对照品溶液1、5、10、20、30μl进样，以峰面积y和进样量x进行回归计算，结果表明线性关系在范围内良好(r》0.999)；采用逐级稀释法，信噪比(s/n)大于3为检出限，信噪比(s/n)大于10为定量限，结果见表2。
[0110]
表2方法的线性范围、检出限及定量限
[0111][0112]
(2)精密度
[0113]
取对照品溶液20μl，按照上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷峰面积的rsd(n＝6)分别为0.3％、0.2％、0.3％和0.2％，表明仪器精密度良好。
[0114]
表3精密度实验结果
[0115][0116][0117]
(3)重复性
[0118]
取对照提取物(191103)6份，精密称定，按照供试品溶液制备方法制成样品溶液，按照上述色谱条件进样20μl，分别计算咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷的含量，结果上述4个成分的平均含量(n＝6)为:0.51％、0.16％、0.24％和0.75％，rsd分别为0.4％、0.5％、0.4％和0.5％，表明方法重复性良好。
[0119]
表4重复性实验结果
[0120]
编号咖啡酸％异槲皮苷％山柰酚-3-o-芸香糖苷％紫云英苷％10.5030.1620.2370.74420.5030.1610.2370.74330.5060.1620.2380.74540.5060.1620.2380.7550.5080.1630.2390.75260.5060.1630.2380.747均值0.510.160.240.75rsd％0.40.50.40.5
[0121]
(4)稳定性
[0122]
取同一份供试品溶液，放置于室温，分别于0、2、5、12、.24、36、48h进样测定，记录峰面积。结果咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷峰面积的rsd(n＝7)分别为0.3％、0.6％、0.6％和0.2％，表明方法稳定性良好。
[0123]
表5稳定性实验结果
[0124][0125]
(5)回收率
[0126]
取已知含量的6份对照提取物(191103)约25mg，精密称定，分别加入制备的对照品溶液10ml，按照供试品溶液制备方法制成样品溶液，按照上述色谱条件进样20μl，分别计算咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷的回收率，结果上述4个成分的平均回收率(n＝6)为：100.1％、97.7％、92.5％和101.0％，rsd分别为0.3％、0.5％、0.3％和1.0％，表明方法准确性良好。
[0127]
表6回收率实验结果
[0128][0129]
(5)方法耐用性
[0130]
本实施例通过选用不同的色谱柱考察方法的耐用性，分别用eclipse xdb-c18(250
×
4.6mm，5um)、waters symmetry shicld
tm rp18(250
×
4.6mm，5um)、shiseido capcell pakc18(250
×
4.6mm，5um)色谱柱，采用建立的色谱条件分别分析10％甲醇提取物(a)、金沙藤药材(b)、对照提取物(c)及对照品溶液(d)，结果如图9-图11所示，结果表明，测定目标成分的分离度均较好，方法耐用性较好。
[0131]
(6)含量测定
[0132]
按本实施例所建立的方法对3批次对照提取物进行测定，测定结果见表7。
[0133]
表7 3批次对照提取物测定结果
[0134]
提取物101103批次101104批次190904批次咖啡酸0.50％0.64％0.56％异槲皮苷0.16％0.14％0.21％山柰酚-3-o-芸香糖苷0.24％0.11％0.36％紫云英苷0.74％0.66％0.80％
[0135]
实施例5金沙藤对照提取物用于三金片薄层鉴别研究
[0136]
三金片是由金沙藤、金樱根、菝葜、羊开口、积雪草五种药材煎制而成，涉及的化学成分较为复杂，本实验通过探索不同的提取溶剂、提取方式，并以不同的展开系统，采用聚酰胺薄膜分别展开，根据展开斑点效果及阴性样品对比，优化出适宜的薄层鉴别方法，具体研究内容如下:
[0137]
1、方法
[0138]
方法1：取三金片10片，研细，加水50ml，水浴回流提取1h，放冷后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯，蒸干，用1ml甲醇溶解，即得供试品溶液。同法取不含金沙藤药材的三金片，制成阴性供试品溶液。另取金沙藤对照提取物50mg，加甲醇溶解后定容至10ml，即得对照提取物溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述方法制成的溶液各1μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，分别以甲醇-冰醋酸-水(4:1:5)、二氯甲烷-甲醇-甲酸(10:2:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清嘶，置紫外灯(365nm)下检视。
[0139]
方法2：取三金片10片，研细，加甲醇20ml，超声提取1h，放冷后过滤，即得供试品溶液。同法取不含金沙藤药材的三金片，制成阴性供试品溶液。另取金沙藤对照提取物50mg，加甲醇溶解后定容至10ml，即得对照提取物溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述方法制成的溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，分别以环己烷-乙酸乙酯-甲酸-丙酮(15:15:0.5:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。
[0140]
结果判断:在供试品色谱中，在与金沙藤对照提取物色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0141]
2、实验结果
[0142]
(1)方法1结果
[0143]
bk为阴性三金片，e为对照提取物，s1、s2、s3分别为三金片(对应批号为190904、190930、190935)，不同的展开系统如图12所示，甲醇-冰醋酸-水(4:1:5)系统展开效果稍好，阴性样品干扰较少。
[0144]
(2)方法2结果
[0145]
e1、e2、e3为对照提取物(对应批号为191103、191104、190904)，s1、s2、s3分别为三金片(对应批号为190904、190930、190935)，不同的薄层板展开结果如图13所示，高效薄层板展开效果较好，国产青岛海洋薄层板展开效果一般。
[0146]
综合比较来看，方法2对应的展开效果比较稳定，故以方法2为供试品处理方法，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸-丙酮(15:15:0.5:1)为展开剂。
[0147]
实施例6金沙藤对照提取物质量标准草案
[0148]
金沙藤对照提取物
[0149]
本品为海金沙科植物海金沙lygodium japonicum(thunb.)sw.、小叶海金沙lygodium microphyllum(cav.)r.br.、曲轴海金沙lygodium flexuosum(l.)sw.的干燥地上部分经提取制成的对照提取物。
[0150]
【性状】本品为浅棕色或棕色粉末，有引湿性。
[0151]
【鉴别】(1)称取金沙藤药材1g，加水25ml，水浴回流提取1小时，放冷后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯，蒸干，用1ml甲醇溶解，即得供试品溶液。另取金沙藤对照提取物50mg，加甲醇溶解后定容至10ml，即得对照提取物溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以二氯甲烷-甲醇-甲酸(8∶2∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯(365nm)下检视。对照提取物色谱中，在与金沙藤药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0152]
(2)取本品约50mg，精密称定，置25ml具塞容量瓶中，加10％甲醇溶液定容到刻度，摇匀，超声提取30min，取上清液，即得供试品溶液。除供试品溶液外，其他照〔含量测定〕项下的方法试验，供试品色谱图中应呈现与咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷色谱峰保留时间相同的色谱峰。
[0153]
【检查】水分︰不得过5.0％(通则0832第三法)。
[0154]
引湿性﹑有引湿性(通则9103)。
[0155]
【含量测定】照高效液相色谱法〈通则0512)测定。
[0156]
色谱条件与系统适用性试验︰以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，0.4％磷酸为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；柱温30℃，检测波长为354nm；流速为1ml/min；理论板数按咖啡酸峰计算应不低于10000。
[0157]
时间(min)流动相b(％)0-4090
→
7540-4575
→
6045-5060
→
10
[0158]
对照品溶液的制备，取咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中含咖啡酸0.0l mg、异槲皮苷0.04mg、山柰酚-3-o-芸香糖苷0.06mg、紫云英苷0.02mg的溶液，即得。
[0159]
供试品溶液的制备：取本品约50mg，精密称定，置20ml具塞容量瓶中，加甲醇溶解定容到刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
[0160]
测定法﹑分别晴密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，计算咖啡酸、异槲皮苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷和紫云英苷的含量，即得。
[0161]
本品按干燥品计算，含咖啡酸(c9h8o4)不得少于0.30％，含异槲皮苷(c
21h20o12
)不得少于0.10％，含山柰酚-3-o-芸香糖苷(c
27h30o15
)不得少于0.10％，含紫云英苷(c
21h20o11
)不得少于0.50％。
[0162]
【贮藏】遮光，密封，置阴凉干燥处。
[0163]
实施例7三金片质量标准草案
[0164]
三金片
[0165]
【鉴别】取本品15片(小片)或10片(大片)，研细，加甲醇20ml，超声提取1小时，放冷后过滤，即得供试品溶液。另取金沙藤对照提取物50mg，加甲醇溶解后定容至10ml，即得对照提取物溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一高效硅胶g薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸-丙酮(15:15:0.5:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照提取物色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0166]
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。