一种罗伊氏乳杆菌微胶囊及其制备方法与流程

1.本发明属于益生菌制品技术领域，具体涉及一种罗伊氏乳杆菌微胶囊及其制备方法。


背景技术：

2.随着我国逐渐进入老龄化社会，老年人口所占人口比重越来越大，与人体衰老相关的各种健康问题如、皮肤松弛、脱发等逐渐显现并困扰人们的日常生活，生活质量受到影响。在改善皮肤健康、防治脱发方面，现有药物不仅需要长期服用，而且还会有严重的副作用问题。寻找开发抗衰老活性物质已经成为应对人口老龄化问题的研究热点。
3.研究发现，益生菌在延缓人体衰老方面具有重要作用。越来越多的证据表明，益生菌对于人体的健康影响不仅局限于肠道，还有更广泛的作用范围，如内分泌平衡调节、免疫平衡调节、神经系统调节、呼吸系统调节等。因此，通过服用益生菌来延缓衰老、提高皮肤健康状况成为一种新的治疗思路。
4.益生菌只有当施以足够的数量时才能对宿主发挥健康益处，因此活菌量是益生菌株发挥益生功效的前提，保证益生菌的活性具有重要意义。益生菌种活性易受空气湿度、环境温度和氧气等因素的影响失去活性。通过降益生菌制备微胶囊制剂，不仅能够提高其单位活菌量，还能最低程度减轻其受环境因素的影响，保证益生菌货架期内稳定性，使其更耐加工，为下游功能性食品开发奠定基础。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种罗伊氏乳杆菌微胶囊及其制备方法。所使用的罗伊氏乳杆菌分离自百岁老人的新鲜粪便，能够提高皮肤胶原蛋白含量，改善皮肤松弛和毛囊健康，具有显著的抗衰老作用。
6.本发明提供的罗伊氏乳杆菌微胶囊，包含芯材和壁材，其中芯材为罗伊氏乳杆菌vhpribo e18株；所述的罗伊氏乳杆菌vhpribo e18株(lactobacillus reuteri vhpribo e18)，已于2021年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2021153。
7.所述的壁材，其组分包含有海藻酸钠、明胶、糊精、蔗糖、变性淀粉；
8.其中海藻酸钠、明胶、糊精、蔗糖、变性淀粉的质量百分比为2％～5％：5％～10％：5％～10％：3％～6％：8％～12％。
9.作为优选，所述的海藻酸钠、明胶、糊精、蔗糖、变性淀粉的质量百分比为3％：5％：5％：3％：8％。
10.所提供的微胶囊，其一种制备方法，是将海藻酸钠、明胶、糊精、蔗糖、变性淀粉加水搅拌至完全溶解，并与罗伊氏乳杆菌vhpribo e18株菌泥充分混匀，制成冷冻混合液；然后将冷冻混合液进行冷冻干燥制得。
11.其中一种具体的冷冻干燥程序如下：预冷温度-40℃，预冷时间3h，以1℃/min的速
率升温至-30℃以进行一次干燥，时间持续800min，然后以1℃/min的速率升温至25℃进行二次干燥，时间持续2h，冷阱温度-80℃左右，真空度20pa，获得罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊制剂。
12.本发明提供的罗伊氏乳杆菌微胶囊单位活菌量较高，采用倾注法计数微胶囊中的活菌数为2.08
×
10
10
cfu/g，罗伊氏乳杆菌的存活率95.5％。本发明提供的罗伊氏乳杆菌微胶囊经过人工胃液和人工肠液消化后，活菌量没有发生明显变化，本发明制备的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊具有很强的耐胃酸耐胆碱能力。
13.申请人将本发明提供的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊喂食12月龄衰老小鼠70天后，12月龄衰老小鼠皮毛光泽度改善，脱毛现象减少。同时，衰老小鼠皮肤的含水量上升，丙二醛含量下降，皮肤和尾腱中的羟脯氨酸含量上升。衰老小鼠的表皮结构完整度改善，炎性细胞减少，成纤维细胞增多。衰老小鼠灌胃罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊后皮肤衰老指标得以改善。
14.本发明提供的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊，对机体无毒害作用，可添加在食品中，制备成具有抗衰老功效的功能性食品，也可以添加在化妆品中，用于延缓皮肤衰老，具有广阔的应用前景。
附图说明
15.图1为e18菌株api 50chl碳源代谢图谱图；
16.图2为e18菌株riboprinter指纹图谱图；
17.图3为e18菌株的rapd指纹图谱图；
18.图4为e18菌株的rep-pcr指纹图谱图；
19.图5为各组别小鼠皮毛感官评分结果图；
20.图6为各组别小鼠皮肤含水量测定结果图；
21.图7为各组别小鼠皮肤mda含量测定结果图。
22.图8为各组别小鼠皮肤羟脯氨酸含量测定结果图。
23.图9为各组别小鼠皮肤he染色结果图，其中(a)3月龄对照组；(b)12月龄对照组；(c)12月龄涂抹组；(d)12月龄灌胃组；
24.图10为各组别小鼠皮肤毛囊数量、表皮厚度、真皮厚度和胶原纤维含量测定结果图，其中(a)3月龄对照组；(b)12月龄对照组；(c)12月龄涂抹组；(d)12月龄灌胃组*:与3月龄对照组，p《0.05；**:与12月龄对照组，p《0.05。
具体实施方式
25.申请人在之前的研究中发现筛选获得的罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)vhprobi e18株具有抗衰老功效；并使用该菌株来制备相关的菌制剂。
26.申请人将所述罗伊氏乳杆菌vhprobi e18保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：m2021153。
27.本发明所述筛选方法并不局限于实施例所述，已知的能够达到筛选目的的方法均可以，实施例的筛选说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明
的范围。
28.下面结合具体实施例对本发明做详细的描述。
29.实施例1罗伊氏乳杆菌vhprobi e18的分离筛选
30.1、初筛
31.配制mrs琼脂培养基调ph 6.2-6.5，121℃高压灭菌15min。
32.取1g百岁老人的新鲜粪便样本，经无菌生理盐水稀释后放入无菌样品袋中，用匀浆仪拍打混匀；取100μl混匀液梯度稀释，涂布于mrs琼脂培养基后于37℃厌氧培养48h，待平板长出单菌落镜检。根据镜检结果，申请人共筛选出20株潜在乳酸杆菌，分别命名为e01、e02、
……
、e18、e19、e20。
33.2、复筛
34.配制1l的mrs液体培养基121℃高压灭菌15min，待培养基冷却后加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h制成耐酸性培养基。
35.将筛选得到的20株乳酸杆菌e01、e02、
……
、e18、e19、e20按6％接种量分别接种于上述耐酸性培养基中，37℃条件下厌氧静置培养48h，取发酵液进行菌量计数。
36.结果显示，在所述20株乳酸杆菌发酵液中活菌量的对数值中，e18菌株经耐酸性培养基复筛后活菌量最多，对数值高达8.01log cfu/ml。从而说明e18号菌株耐酸能力最高。
37.实施例2菌株鉴定
38.1、菌落形态鉴定
39.将e18菌株接种于mrs琼脂培养基上，37℃厌氧培养24h后，可见e18单菌落呈乳白色，菌落直径在1.5-2mm左右，表面光滑，显微镜下末端呈圆形的弯曲杆菌。
40.2、生理生化特性鉴定
41.本实施例中接种液的准备如下：在无菌条件下，取适量新鲜e18菌液，5000rpm/min离心5min，用pbs缓冲液洗2次，再用同体积pbs缓冲液重菌体后稀释50倍，作为接种液。
42.2.1、盐度耐受性试验
43.在无菌条件下，向96孔板中分别加入190μl盐浓度为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％的bsm液体培养基，每个盐浓度做3个平行，然后再加入10μl接种液，不接菌的孔作为对照。每孔加入50μl高压灭菌过的石蜡油以防止培养过程中水分蒸发。置于37℃恒温培养，观察培养基是否变浑浊。结果显示e18菌株最大耐受盐浓度为5％。
44.2.2、过氧化氢酶实验
45.取新鲜菌液，滴一滴于干净的载玻片上，然后在其上滴加一滴3％过氧化氢溶液，观察到e18菌株不产生气泡，是阴性反应。
46.2.3、碳源代谢试验
47.利用api 50chl试剂条对e18菌株进行碳源代谢实验，实验方法及结果判读具体参见api 50chl试剂盒说明书。e18菌株鉴定结果为：％id＝93且t值＝0.74，api结果为发酵乳杆菌，鉴定评语为好的鉴定(目前api可鉴定种属中没有罗伊氏乳杆菌，故鉴定结果为发酵乳杆菌)。e18菌株api 50chl碳源代谢结果如图1所示。
48.3分子生物学鉴定
49.3.1 16s rdna基因序列分析
50.3.1.1、基因组dna提取
51.参照天根细菌基因组dna提取试剂盒(目录号：dp302)操作。
52.3.1.2、16s rdna基因扩增
53.引物序列:
54.27f：agagtttgatcctggctca；
55.1492r：ggttaccttgttacgactt。
56.通过测序获得e18菌株的16s rdna序列seq id no:1，并将该序列在ncbi数据库中进行比对，初步确定e18菌株为罗伊氏乳杆菌。
57.3.2 riboprinter指纹图谱
58.用一根取菌棒从琼脂培养基平板上沾取已纯化好的单菌落，将其放入有缓冲液的样品管中，用手持搅拌器搅拌使其在缓冲液中悬浮，然后将样品架放入加热器中灭活后放入riboprinter系统中，样品经过dna制备、转膜、成像检测及数据处理后，得到细菌鉴定结果。鉴定结果显示，e18菌株为罗伊氏乳杆菌，其riboprinter指纹图谱结果见图2。
59.3.3 rapd和rep-pcr指纹图谱鉴定
60.3.3.1、rapd指纹图谱鉴定
61.引物序列：gagggtggcggttct。
62.e18菌株的rapd指纹图谱如图3所示。
63.3.3.2、rep-pcr指纹图谱
64.引物序列：ctacggcaaggcgacgctgacg。
65.e18菌株的的rep-pcr指纹图谱如图4所示。
66.将e18菌株的菌落形态以及生理生化特性结果上传至网站http://www.tgw1916.net/bacteria_logare_desktop.html，同时结合文献de clerck e，et al.systematic and applied microbiology,2004,27(1)50公布的结果，进行比对。综合分子生物学的鉴定结果，确定e18菌株为一株新的罗伊氏乳杆菌，将其命名为罗伊氏乳杆菌vhprobi e18。
67.实施例3罗伊氏乳杆菌vhprobi e18对人工胃液和人工肠液的耐受性试验
68.1人工胃液的配制
69.分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和nacl 2g，加入1000ml蒸馏水，用稀盐酸调ph3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
70.2人工肠液的配制
71.分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、kh2po
4 6.8g和牛胆盐3.0g，加入77ml的0.2mol/l的naoh溶液，定容至1000ml，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调ph6.8
±
0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
72.3试验方法
73.取2ml新鲜菌液，5000rpm/min离心5min收集菌体，菌体用生理盐水洗涤3次，再用2ml生理盐水重悬，作为接种液。取1ml接种液，加入到24ml人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm/min)3h，取样1ml，检测活菌量。
74.活菌计数方法按照国标《gb4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌
量，该菌株经过人工肠液消化后的活菌量(log cfu/ml)见表1。
75.表1.人工胃肠液消化后的活菌量
[0076][0077]
从表1可知，本发明筛选到的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18经人工胃液和人工肠液消化后，活菌量上升。从而说明该菌株能够耐受人工胃液和人工肠液，而且还可以进行一定的萌发。
[0078]
实施例4罗伊氏乳杆菌vhprobi e18的溶血性及抗生素耐受性实验
[0079]
1、溶血性实验
[0080]
称取tbs基础培养基的各种组分，溶解，121℃高压灭菌15min，等培养基冷却到50℃的时候加入5％的无菌脱纤维绵羊血，混匀，倒平板。将测试菌株划线接种于准备好的血细胞平板，37℃培养箱培养，24～48h观察测试菌是否有溶血现象。
[0081]
结果显示：罗伊氏乳杆菌vhprobi e18不能生长，血细胞平板没有变化，说明罗伊氏乳杆菌vhprobi e18不产生溶血素，不能够溶解血细胞。
[0082]
2、抗生素耐受性实验
[0083]
微量肉汤稀释法测定抗生素对罗伊氏乳杆菌vhprobi e18的最小抑菌浓度mic值具体结果见表2。
[0084]
表2：罗伊氏乳杆菌vhprobi e18的抗生素mic值表
[0085][0086]
mic单位μg/ml
[0087]
从表2的结果可以看出，本发明提供的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18对红霉素和氨苄西林等常见抗生素敏感，生物安全性良好。
[0088]
实施例5罗伊氏乳杆菌vhprobi e18抗氧化功能测定
[0089]
1、菌株清除dpph(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)和羟基自由基(hrs)能力测定
[0090]
菌株清除dpph自由基能力的测定
[0091]
取1ml待测菌株的pbs菌悬液，加入1ml 0.4mm的现配的dpph自由基溶液，混合均匀后然后置于室温温度下遮光反应30min，然后测定样品在波长517nm处的吸光度a样本，测3次平行。对照组样品以等体积pbs溶液和dpph
·
乙醇混合液，并以等体积pbs菌悬液和乙醇混合液空白调零。清除率按下列公式计算：清除率％＝[1-(a
样品-a
空白
)/a
对照
]
×
100％。结果见表3。
[0092]
表3.dpph自由基清除率表
[0093][0094]
3)菌株清除hrs能力的测定
[0095]
将100μl 5mm的水杨酸钠-乙醇溶液，100μl 5mm的硫酸亚铁，500μl去离子水和200μl乳酸菌pbs菌悬液混匀后加入100μl过氧化氢溶液(3mm)，37℃水浴15min后在510nm波长处测量样品吸光度。羟自由基清除率按照下列公式进行计算。
[0096]
清除率％＝(a
样品-a
控制
)/(a
空白-a
控制
)
×
100％，其中a
控制
为去离子水替代样品，a
空白
为去离子水替代样品和h2o2，结果见表4。
[0097]
表4.hrs自由基清除率表
[0098][0099]
2、菌株抗脂质过氧化实验鉴定
[0100]
亚油酸乳化液的制备：0.1ml亚油酸，0.2ml tween 20，19.7ml去离子水。
[0101]
0.5ml的pbs溶液(ph 7.4)中加入1ml亚油酸的乳化液，1mlfeso4(1％)，再加入0.5ml样品，37℃水浴1.5h，混合液加入0.2ml tca(4％)，2ml tba(0.8％)，100℃水浴30min，迅速冷却，4000rpm/min离心15min，收集上清液在532nm下测吸光度即为a；对照组以0.5ml蒸馏水代替样品即为a0。抑制率/％＝(a0－a)/a0×
100％
[0102]
注：a为样品组吸光度；a0为对照组吸光度，结果见表5。
[0103]
表5.抗脂质过氧化抑制率表
[0104][0105]
实施例6罗伊氏乳杆菌vhprobi e18体外胆固醇降解实验
[0106]
1.胆固醇胶束溶液的配制：准确称取1g胆固醇，溶于无水乙醇中，并定容至100ml，在无菌条件下用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。
[0107]
2.称取蛋白胨10.0g牛肉膏10.0g酵母膏5.0g柠檬酸氢二铵2.0g葡萄糖20.0g，吐温80 1.0ml，乙酸钠5.0硫酸镁0.1硫酸锰0.05，磷酸氢二钾2.0g,胆盐1g，蒸馏水1000ml调节ph值7.3，115℃灭菌30min，然后加入胆固醇溶液使胆固醇终浓度为0.1％。
[0108]
按照0.1％的接种量接种新鲜菌液，37℃静止培养48h，然后取0.2ml菌液，加入1.8ml无水乙醇，混匀，静止10分钟，3000转离心5分钟，取上清液用于测定胆固醇含量。胆固醇测定方法按照gb/t 5009.128-2003《食品中胆固醇的测定》。
[0109]
结果显示：本发明提供的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18对胆固醇的降解率达到
16.24％(此为不含胆盐的数据)。
[0110]
实施例7罗伊氏乳杆菌vhprobi e18的疏水性细胞表面测试
[0111]
1、待测菌液制备：挑取纯化好的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18菌落接种于新配制的mrs液体培养基中，于37℃培养24～48h。再按1％(v/v)的接种量接至mrs液体培养基中于37℃继续培养24～48h后6000
×
g离心10min，收集菌体后用无菌生理盐水冲洗2次，再用灭菌0.1m kno
3 1ml溶液重悬菌体，作为待测菌液。
[0112]
2、表面疏水性测定：吸取50μl上述菌悬液加入2450μl的0.1m kno3并记录od600为a0,取1.5ml菌悬液与500μl二甲苯混匀后在室温下静置10min(此时形成两相体系)。将两相体系涡旋振荡2min后再静置20min,重新形成水相和有机相。小心吸取水相(不要吸到有机相)在600nm处测量吸光度a1。细胞疏水性按公式hydrophobicity％＝(a
0-a1)/a1×
％计算，测三次实验取平均值。
[0113]
结果显示：本发明提供的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18细胞表面疏水性为61.76％，标准差为0.27％。
[0114]
实施例8罗伊氏乳杆菌vhprobi e18的细胞粘附性测试
[0115]
caco-2细胞，进行复苏、传代培养，培养细胞数量扩增至所需用量。加入胰酶后将细胞放回培养箱，肉眼观察到细胞完全脱落后使其尽量成为单细胞状态。使用血球计数板进行细胞计数，使用pbs适量稀释细胞悬液。使用mrs培养基将菌体重悬备用。将待测菌悬液与caco-2细胞共同孵育2h后再用pbs洗去未黏附的细菌。加入胰酶消化后再加入细胞培养液终止消化，收集液体涂布计数。粘附能力(cfu/cells)＝每个培养孔内粘附的细菌总数/每个培养孔的总细胞数。经检测，罗伊氏乳杆菌vhprobi e18黏附能力为4.7。
[0116]
实施例9罗伊氏乳杆菌vhprobi e18在改善衰老小鼠皮肤中的应用
[0117]
1.1 实验动物
[0118]
c57小鼠spf级，雄性，3月龄小鼠6只，12月龄小鼠18只，体重19～25g。实验动物饲养管理的环境条件：室温20～26℃，日温差≤4℃，相对湿度40～70％，明暗交替时间为12/12h。动物饲养于标准小鼠笼具中，每笼6只。动物饲料、饮水：自由摄食、饮水。饲料为spf级大小鼠生长繁育饲料。饮用水是经过高温消毒的城市自来水。
[0119]
1.2 实验方法
[0120]
小鼠适应性饲养7天后随机分为3月龄对照组、12月龄对照组组、12月龄涂抹组、12月龄灌胃组，每组6只小鼠。12月龄灌胃组按照0.2ml/10g灌胃给予益生菌菌液，12月龄涂抹组涂抹与灌胃组等量的益生菌液，3月龄对照组和12月龄对照组灌胃与益生菌等量的生理盐水。共持续70天。
[0121]
1.3 检测指标
[0122]
终末时，对小鼠背部皮毛感官评分，评分规则如表6所示。检测小鼠皮肤含水量、sod活性和mda含量变化，检测小鼠皮肤和尾腱中羟脯氨酸含量。
[0123]
表6.小鼠背部皮毛感官评分量表
[0124]
评价等级得分外观01无光泽、干枯、无油色、开叉、断裂、白毛 2光泽差、无油色、白毛 3有光泽、毛发柔顺、无白毛、黑色毛发
4光泽佳、毛发柔顺亮泽，皮毛光泽贴身、呈亮黑色
[0125]
试验结束后取背部皮肤组织，4％多聚甲醛固定，取材，脱水，石蜡包埋，切片，he染色，检测毛囊数量、真皮厚度和皮脂腺细胞。
[0126]
所有实验数据以均数
±
标准差表示，用microsoft excel进行数据统计和作图，两组数据间比较采用t检验，以p《0.05判定为有显著性差异。
[0127]
1.4 实验结果
[0128]
1.4.1 小鼠背部皮毛感官评定
[0129]
终末期时，3月龄小鼠毛发浓密，光泽整齐；12月龄对照组小鼠毛发干枯，脱毛较多并且有花白毛发；12月龄涂抹组小鼠毛发有光泽，无白色毛发；12月龄灌胃组小鼠毛发浓密有光泽，且呈现黑色。各组小鼠背部皮毛感官评分比较结果如图5所示。
[0130]
1.4.2 小鼠皮肤含水量、mda和羟脯氨酸含量变化
[0131]
12月龄各组别在终末约14～15月龄相对比3月龄对照组终末约5～6月龄，皮肤含水量均显著降低(p《0.05)，下降率约为15.95％；12月龄灌胃组相比12月龄对照组皮肤含水率上升，且具有显著性差异(p《0.05)。各组小鼠皮肤含水率比较如图6所示。
[0132]
与12月龄对照组相比，12月龄灌胃组皮肤mda含量显著降低，且具有显著性差异(p《0.05)，12月龄涂抹组皮肤mda含量显著降低，也具有显著性差异(p《0.05)，12月龄涂抹组与12月龄灌胃组终末状态皮肤mda含量相比差异不具有显著性(p》0.05)。各组小鼠皮肤mda含量比较如图7所示。
[0133]
与12月龄对照组相比，12月龄灌胃组和涂抹组皮肤和尾腱中的羟脯氨酸含量升高，且具有显著性差异(p《0.05)，12月龄涂抹组与12月龄灌胃组终末状态皮肤羟脯氨酸含量相比差异不具有显著性(p》0.05)。各组小鼠皮肤和尾腱中羟脯氨酸含量比较如图8所示。
[0134]
1.4.3 小鼠背部皮肤组织学检查
[0135]
光学显微镜下可见，3月龄对照组小鼠表皮结构完整，细胞分层清晰，具有明显的表皮突和真皮乳头，视野内未见炎性细胞浸润，可见皮脂腺增生，视野内可见真皮层胶原纤维，排列分布均匀成带状；12月龄对照组小鼠表皮变薄明显，角质层脱落可见，结构完整度欠缺，细胞数量减少，排列不规则，胶原纤维层明显减少，纤维断裂、分布不均匀、稀疏，成纤维细胞减少；12月龄灌胃组小鼠上皮细胞增生，排列偶有疏松紊乱，毛囊皮脂腺时有增生，炎性细胞偶有出现，胶原纤维分布松散，断裂可见；12月龄涂抹组上皮细胞增生明显，角质层脱落可见，毛囊和皮脂腺增生明显，炎性细胞可见，皮肤松散可见，胶原纤维层排列分布松散，断裂现象明显。小鼠皮肤典型he切片结果如图9。
[0136]
终末时，与3月龄对照组相比，12月龄对照组小鼠皮肤毛囊密度下降，且具有显著性差异(p《0.05)；与12月龄对照组小鼠相比，12月龄涂抹组和12月龄灌胃组毛囊密度上升，且具有显著性差异(p《0.05)。
[0137]
与3月龄对照组相比，12月龄对照组小鼠皮肤表皮厚度有下降，但没有显著性差异；12月龄各组小鼠肤表皮厚度没有差异。
[0138]
与3月龄对照组相比，12月龄对照组小鼠皮肤真皮厚度下降，且具有显著性差异(p《0.05)；与12月龄对照组小鼠相比，12月龄涂抹组和12月龄灌胃组皮肤真皮厚度上升，且具有显著性差异(p《0.05)。
[0139]
与3月龄对照组相比，12月龄对照组小鼠皮肤胶原纤维面积下降，且具有显著性差
异(p《0.05)；与12月龄对照组小鼠相比，12月龄涂抹组和12月龄灌胃组皮肤胶原纤维面积上升，且具有显著性差异(p《0.05)。各组别小鼠皮肤衰老程度对比结果如图10所示。
[0140]
由上述结果可知，与12月龄对照组小鼠相比，12月龄灌胃组和12月龄涂抹组小鼠皮毛光泽度均有改善，没有出现白毛，脱毛现象减少。12月龄灌胃组和12月龄涂抹组小鼠皮肤含水率上升，mda含量下降。羟脯氨酸作为真皮内含量丰富稳定的氨基酸，其含量可以直接反映出真皮内胶原蛋白的含量变化，是检测皮肤衰老的指标之一。12月龄灌胃组和12月龄涂抹组小鼠皮肤和尾腱中羟脯氨酸含量上升，涂抹和灌胃罗伊氏乳杆菌vhprobi e18可以提高真皮内胶原蛋白的含量。从小鼠皮肤组织学检查看，与12月龄对照组小鼠相比，12月龄灌胃组和12月龄涂抹组小鼠表皮结构完整度改善，炎性细胞减少，成纤维细胞增多，并且灌胃组效果好于涂抹组。此外，12月龄灌胃组和12月龄涂抹组小鼠皮肤毛囊数量上升，真皮厚度增加，胶原纤维含量上升。结果表明罗伊氏乳杆菌vhprobi e18无论是灌胃还是涂抹均可以改善衰老小鼠皮肤指征达到延缓修复皮肤衰老效果。
[0141]
综上所述，本发明提供的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18对模拟人工肠胃液具有很强的耐受能力，这对于益生菌株顺利经过胃肠道在结肠处定植下来发挥益生功能奠定了基础。抗生素抗性试验证实罗伊氏乳杆菌vhprobi e18对常见抗生素敏感，不产溶血素，生物安全性良好。同时，罗伊氏乳杆菌vhprobi e18能够清除dpph和hrs自由基，抑制脂质过氧化，具有一定的抗氧化功能活性，能够降解胆固醇，具有降低血清胆固醇的益生特性。经动物实验证实，罗伊氏乳杆菌vhprobi e18具有抗衰老作用，能够增加皮肤胶原蛋白含量，改善毛囊健康，提升皮肤健康状态。所述罗伊氏乳杆菌vhprobi e18可用于制备延缓修复皮肤衰老效果的功能性食品或化妆品，应用前景广阔。
[0142]
实施例10.微胶囊及其制备方法
[0143]
1、制备罗伊氏乳杆菌菌泥
[0144]
在无菌条件下，将罗伊氏乳杆菌vhprobi e18种子液以3％的体积比接种于发酵培养基中，所述发酵培养基中各组分及其含量分别为：蔗糖30g/l、酵母粉25g/l、大豆蛋白胨15g/l、硫酸镁0.15g/l和硫酸锰0.08g/l；37℃培养24h，转速为100rpm，通风量为1l/min，罐压为0.05mpa。发酵完成后即得到罗伊氏乳杆菌vhprobi e18发酵液，将发酵液在4℃条件下以4000g/min离心10min中弃去上清液，获得罗伊氏乳杆菌vhprobi e18菌泥。
[0145]
2、制备益生菌微胶囊
[0146]
按比例称取海藻酸钠、明胶、糊精、蔗糖和变性淀粉五种包被壁材，加水搅拌至壁材完全溶解，得壁材溶液，其中壁材组分及其质量百分比分别为：海藻酸钠3％、明胶5％、糊精5％、蔗糖3％、变性淀粉8％。
[0147]
向壁材溶液中加入步骤1制备得到的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18菌泥，搅拌均匀，得冷冻混合液；将冷冻混合液置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥程序为：预冷温度-40℃，预冷时间3h，以1℃/min的速率升温至-30℃以进行一次干燥，时间持续800min，然后以1℃/min的速率升温至25℃进行二次干燥，时间持续2h，冷阱温度-80℃左右，真空度20pa，获得罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊制剂。
[0148]
实施例11.制备罗伊氏乳杆菌微胶囊
[0149]
1、制备罗伊氏乳杆菌菌泥
[0150]
在无菌条件下，将罗伊氏乳杆菌vhprobi e18种子液以5％的体积比接种于发酵培
养基中，所述发酵培养基中各组分及其含量分别为：蔗糖50g/l、酵母粉30g/l、大豆蛋白胨25g/l、硫酸镁0.15g/l和硫酸锰0.10g/l；37℃培养36h，转速为150rpm，通风量为1.5l/min，罐压为0.08mpa。发酵完成后即得到罗伊氏乳杆菌vhprobi e18发酵液，将发酵液在4℃条件下以6000g/min离心8min，弃去上清液，获得罗伊氏乳杆菌vhprobi e18菌泥。
[0151]
2、制备益生菌微胶囊
[0152]
按比例称取海藻酸钠、明胶、糊精、蔗糖和变性淀粉五种包被壁材，加水搅拌至壁材完全溶解，得壁材溶液，其中壁材组分及其质量百分比分别为：海藻酸钠5％、明胶10％、糊精10％、蔗糖6％、变性淀粉10％。
[0153]
向壁材溶液中加入步骤1制备得到的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18菌泥，搅拌均匀，得冷冻混合液；将冷冻混合液置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥程序为：预冷温度-60℃，预冷时间2h，以1℃/min的速率升温至-40℃以进行一次干燥，时间持续600min，然后以1℃/min的速率升温至20℃进行二次干燥，时间持续3h，冷阱温度-80℃左右，真空度20pa，获得罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊制剂。
[0154]
实施例12.罗伊氏乳杆菌微胶囊及其制备方法
[0155]
1、制备罗伊氏乳杆菌菌泥
[0156]
在无菌条件下，将罗伊氏乳杆菌vhprobi e18种子液以8％的体积比接种于发酵培养基中，所述发酵培养基中各组分及其含量分别为：蔗糖50g/l、酵母粉25g/l、大豆蛋白胨10g/l、硫酸镁0.05g/l和硫酸锰0.04g/l；37℃培养18h，转速为80rpm，通风量为2l/min，罐压为0.05mpa。发酵完成后即得到罗伊氏乳杆菌vhprobi e18发酵液，将发酵液在4℃条件下以8000g/min离心5min中弃去上清液，获得罗伊氏乳杆菌vhprobi e18菌泥。
[0157]
2、制备益生菌微胶囊
[0158]
按比例称取海藻酸钠、明胶、糊精、蔗糖和变性淀粉五种包被壁材，加水搅拌至壁材完全溶解，得壁材溶液，其中壁材组分及其质量百分比分别为：海藻酸钠2％、明胶8％、糊精10％、蔗糖6％、变性淀粉12％。
[0159]
向壁材溶液中加入步骤1制备得到的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18菌泥，搅拌均匀，得冷冻混合液；将冷冻混合液置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥程序为：预冷温度-30℃，预冷时间3h，以1℃/min的速率升温至-20℃以进行一次干燥，时间持续1000min，然后以1℃/min的速率升温至30℃进行二次干燥，时间持续1h，冷阱温度-80℃左右，真空度20pa，获得罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊制剂。
[0160]
实施例13罗伊氏乳杆菌微胶囊存活率检测
[0161]
取实施例10-12制备得到的罗伊氏乳杆菌微胶囊各1g，经生理盐水梯度稀释后，采用倾注法计数所述微胶囊中的活菌数，并计算微胶囊中单位活菌量及罗伊氏乳杆菌的存活率，结果见表7。
[0162][0163]
表7.罗伊氏乳杆菌微胶囊单位活菌量及菌株的存活率比较
[0164]
唾液乳杆菌制剂单位活菌量唾液乳杆菌的存活率实施例102.08
×
10
10
cfu/g95.5％
实施例111.77
×
10
10
cfu/g89.1％实施例122.38
×
10
10
cfu/g94.2％
[0165]
从表7的结果可以看出，本发明提供的罗伊氏乳杆菌微胶囊单位活菌量高，且罗伊氏乳杆菌vhprobi e18经包被壁材保护后，冷冻干燥后存活率可以达到95.5％，从而说明本发明选用的包被材料和冷冻干燥制备工艺对罗伊氏乳杆菌vhprobi e18的保护作用显著。
[0166]
实施例14罗伊氏乳杆菌微胶囊抗逆性能检测
[0167]
1、抗逆性检测
[0168]
1.1 人工胃液的配制
[0169]
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g和nacl 2g，加入1000ml蒸馏水，用稀盐酸调ph3.0，然后115℃灭菌20min。然后使用前加入3.2g猪粘膜胃蛋白酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
[0170]
1.2 人工肠液的配制
[0171]
分别称取蛋白胨5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖1g、kh2po
4 6.8g和牛胆盐3.0g，加入77ml的0.2mol/l的naoh溶液，定容至1000ml，用稀盐酸或者氢氧化钠溶液调ph6.8
±
0.1，115℃灭菌20min。然后使用前加入1g胰酶，摇匀溶解，置37℃水浴摇床中温水浴1h，以模拟人体温度。
[0172]
1.3 试验方法
[0173]
分别取2g实施例10～12制备得到的罗伊氏乳杆菌微胶囊，用2ml生理盐水重悬，作为接种液。取1ml接种液，加入到9ml提前温水浴1h的人工胃液中，置于37℃水浴摇床以200rpm/min转速振荡2h，分别于0h和2h时取样1ml，检测活菌量。然后取1ml消化2h后的人工胃液，加入到24ml人工肠液中，置于37℃水浴摇床(200rpm/min)3h，取样1ml，检测活菌量。活菌计数方法按照国标《gb4789.35-2016-食品微生物检验乳酸菌检验》测定菌量，实施例10～12制得的微胶囊经过人工胃液和人工肠液消化后的活菌量(logcfu/g)见表8。
[0174]
表8.罗伊氏乳杆菌微胶囊对人工胃液和人工肠液的耐受效果
[0175][0176]
从表8的结果可以看出，本发明提供的罗伊氏乳杆菌微胶囊经过人工胃液和人工肠液消化后，活菌量没有发生明显变化，从而说明本发明制备的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊具有很强的耐胃酸耐胆碱能力。
[0177]
申请人将本发明提供的罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊喂食12月龄衰老小鼠70天后，12月龄衰老小鼠皮毛光泽度改善，脱毛现象减少。同时，衰老小鼠皮肤的含水量上升，丙二醛含量下降，皮肤和尾腱中的羟脯氨酸含量上升。衰老小鼠的表皮结构完整度改善，炎
性细胞减少，成纤维细胞增多。衰老小鼠灌胃罗伊氏乳杆菌vhprobi e18微胶囊后皮肤衰老指标得以改善。
[0178]
本发明提供的罗伊氏乳杆菌微胶囊的制备工艺过程简单，包被材料便宜，产业化成本低，能有效提高罗伊氏乳杆菌vhprobi e18在存储加工运输过程中的稳定性，有力提高了罗伊氏乳杆菌vhprobi e18的实际使用效果，可广泛应用于食品、保健品等领域。