一种光敏染色上样凝胶体系及其制备方法与流程

40分钟形成第三段胶；
13.步骤4：再次使用缓冲液配制含有丙烯酰胺、双丙烯酰胺的储存液，稀释至适宜浓度，并加入四甲基乙二胺、过硫酸铵进行混合，并将第三段胶上的液体吸除干净后灌注于第三段胶上形成第二段胶；
14.步骤5：将灌注完凝固后的胶管保存在缓冲液中；
15.步骤6：再次使用缓冲液配制含有丙烯酰胺、双丙烯酰胺的储存液，并加入核黄素磷酸钠、丙二醇和二甲基甲酰胺配制的苏丹黑b溶液，即为染色上样胶，避光保存，与血清样品混合后光照30分钟，形成第一段胶。
16.本发明与现有技术相比的优点在于：本发明提供了一种光敏染色上样凝胶体系、使用其分离检测低密度脂蛋白亚类的凝胶体系的制备方法以及使用其分离检测高密度脂蛋白亚类的凝胶体系的制备方法。本发明得到的上样凝胶通过添加光敏催化剂、脂类染色剂、缓冲溶液并调节其浓度使其具有上样、染色、成胶30分钟一次完成，并配合相应的凝胶体系用于低密度脂蛋白亚类和高密度脂蛋白亚类的分离和检测，使其具有简单实用、重复性好，与进口的lipoprint subfractions kit相比具有同样效果，而且价格低廉，易于推广使用。
附图说明
17.图1为低密度脂蛋白凝胶管图解。
18.图2为高密度脂蛋白凝胶管图解。
19.图3是美国lipoprintldl subfractions kit试剂盒检测低密度脂蛋白获得的凝胶电泳图谱。
20.图4是本发明低密度脂蛋白检测凝胶体系得到的凝胶电泳图谱。
具体实施方式
21.一种光敏染色上样凝胶体系，是由以下重量份原料制成：包括蔗糖13-20wt％，丙烯酰胺2.5-3.0wt％，双丙烯酰胺0.15-0.3wt％，核黄素磷酸钠0.5-1wt％，苏丹黑b0.006-0.008g％，丙二醇1-2wt％，二甲基甲酰胺为0.5-1wt％，tris-盐酸缓冲液。
22.预制物品配制方法：
23.配制0.045m的tris-盐酸缓冲液，调节ph为6-8备用，此溶液为缓冲液
①
；
24.配制含有30％的丙烯酰胺、2.5％的双丙烯酰胺储存液，此溶液为储存液
①
；
25.配制0.045m的tris-盐酸缓冲液，调节ph为5.1-5.4备用，此溶液为缓冲液
②
；
26.使用ph值为5.1-5.4的tris-盐酸缓冲液配制含有28％的丙烯酰胺、2％的双丙烯酰胺储存液，此溶液为储存液
②
；
27.使用ph值为5.1-5.4的tris-盐酸缓冲液配制含有9％的丙烯酰胺、2.4％的双丙烯酰胺储存液，此溶液为储存液
③
；
28.配制0.045m的tris-盐酸缓冲液，调节ph为5.3-5.6备用，此溶液为缓冲液
③
；
29.使用ph值为5.3-5.6的tris-盐酸缓冲液配制含有9％的丙烯酰胺、2.4％的双丙烯酰胺储存液，此溶液为储存液
④
；
30.使用ph值为5.3-5.6的tris-盐酸缓冲液配制含有28.7％的丙烯酰胺、0.9％的双
丙烯酰胺储存液，此溶液为储存液
⑤
；
31.称取6-8mg苏丹黑b粉末，使用比例为5:3的丙二醇和二甲基甲酰胺配制2ml的苏丹黑b溶液备用；
32.配制1％的核黄素磷酸钠溶液10ml备用；
33.称取蔗糖8.5g，量取丙烯酰胺、双丙烯酰胺储存液
①
5ml，量取1％的核黄素磷酸钠溶液30ul，量取1-2ul苏丹黑b溶液，用0.045m的tris-盐酸缓冲液(ph6.7-6.8)稀释至50ml，即为染色上样胶，避光保存。
34.实施例一：低密度脂蛋白检测凝胶体系，使用染色上样胶及低密度脂蛋白电泳分离柱，构成三段凝胶管用于分离低密度脂蛋白亚类：
35.所述电泳分离柱包括三段凝胶，第一段为上样凝胶，第二段为叠加胶，第三段为分离胶。所述第一段上样胶为含有2.5-3.0wt％聚丙烯酰胺凝胶柱；所述第二段叠加胶含有1.5-2.5wt％聚丙烯酰胺凝胶柱；所述第三段分离胶含有2.5-3.0wt％聚丙烯酰胺凝胶柱。
36.配制步骤：
37.步骤1，配制低密度脂蛋白凝胶管，量取丙烯酰胺、双丙烯酰胺储存液
②
1.5ml，四甲基乙二胺15ul，过硫酸铵(10％)75ul，0.045m tris-盐酸缓冲溶液(ph5.1-5.4)13.41ml。
38.步骤2，将洁净的石英管用封口膜封底，每管灌注步骤1配制的液体1.4ml，垂直静止20-40分钟，为第三层胶。
39.步骤3，量取丙烯酰胺、双丙烯酰胺储存液
③
100ul，四甲基乙二胺1ul，过硫酸铵(10％)5ul，加894ul缓冲溶液
②
，将第三层胶上的液体吸除干净，取混合物73-76ul灌注于第三层胶之上，作为第二层胶。
40.步骤4，将灌注完凝固后的胶管保存在缓冲液
②
中。
41.需说明的是，第一段分离胶为25ul血清样品加200ul染色上样凝胶，颠倒混匀，光照30分钟后形成。
42.第二段分离胶中，凝胶柱的长度为0.1-0.25cm；所述第三段分离胶，凝胶柱的长度为5-6cm。第二段及第三段分离胶管保存在缓冲液
②
中。
43.需注意的是，使用的电泳缓冲液为tris-硼酸，ph值为8.0-8.3，tris浓度为5-15g/l，硼酸浓度为4-6g/l。
44.实施例二：高密度脂蛋白检测凝胶体系，使用染色上样胶及高密度脂蛋白电泳分离柱，构成三段凝胶管用于分离高密度脂蛋白亚类：
45.所述电泳分离柱包括三段凝胶，第一段为染色上样凝胶，第二段为叠加胶，第三段为分离胶。所述第一段上样胶为含有2.5-3.0wt％聚丙烯酰胺凝胶柱；所述第二段叠加胶含有1.5-2.8wt％聚丙烯酰胺凝胶柱；所述第三段分离胶含有7-9wt％聚丙烯酰胺凝胶柱。
46.配制步骤：
47.步骤1，配制高密度脂蛋白凝胶管，量取丙烯酰胺、双丙烯酰胺储存液
⑤
4.3ml，四甲基乙二胺15ul，过硫酸铵(10％)75ul，缓冲溶液
③
10.61ml，混合。
48.步骤2，将洁净的石英管用封口膜封底，每管灌注步骤1配制的液体1.2-1.3ml，垂直静止20-40分钟，为第三层胶。
49.步骤3，量取储存液
④
110ul，四甲基乙二胺1ul，过硫酸铵(10％)5ul，加884ul缓冲溶液
③
，混合。将第三层胶上的液体吸除干净，取混合物73-76ul灌注于第三层胶之上，作为
第二层胶。
50.步骤4，将灌注完凝固后的胶管保存在缓冲液
③
中。
51.需进行说明的是，第一段分离胶为25ul血清样品加300ul染色上样胶(含微量溴酚蓝指示剂)，颠倒混匀，光照30分钟后形成；第二段分离胶中，凝胶柱的长度为0.1-0.25cm；第三段分离胶，凝胶柱的长度为4-5cm。
52.需注意的是，凝胶体系使用的电泳缓冲液为tris-硼酸，ph值为8.0-8.3，tris浓度为5-15g/l，硼酸浓度为4-6g/l；除电泳缓冲液外，其它缓冲液及储存液均含有防腐剂苯甲醇(0.05-2％)或proclin 300(0.03％)。
53.进一步的，实施例一与实施例二的第一段胶形成后，在上层加入电泳缓冲溶液，此端为负极，放入电泳槽中电泳50-60分钟，获得分离的低密度脂蛋白区带，经扫描仪扫描，得到含有极低密度脂蛋白(1条带)、中密度脂蛋白(3条带)、低密度脂蛋白(7条带)、高密度脂蛋白(1条带)，并用脂蛋白分析软件分析，获得最终各条带的百分比、所含胆固醇含量以及低密度脂蛋白平均颗粒大小，并分型。
54.表1图3与图4的凝胶电泳图谱数据对比图
[0055][0056]
[0057]
如表1所示的数据为图3和图4反映的指标的对比，从数据看，两组的结果相似，表明了本发明实施例一低密度脂蛋白检测凝胶体系得到的凝胶与与进口的lipoprint ldl subfractions kit相比具有同样效果。
[0058]
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，只是本发明的实施方式之一，实际方式并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的实施例，均应属于本发明的保护范围。