一种温敏性星型聚合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于聚合物合成领域，具体涉及一种具有温度敏感特性的星型聚合物载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.癌症严重威胁人类健康和生命，而化学治疗因其有效性，仍是迄今为止临床上对癌症治疗应用最为广泛和有效的方法之一。然而，由于药物在体内的失活和非特异性识别，大多数化疗药物具有治疗效果低和毒副作用大的特点，极大地增加了患者的痛苦。因此，发展新的具有高治疗效果和低毒副作用的抗癌试剂和方法，对延长癌症病人的寿命和提高其生存质量，以及改善我国乃至全世界范围内对癌症的巨大医疗负荷就显得极为迫切和具有广泛而深远的意义。
3.研究表明，利用载体输送药物可以增加药物在肿瘤部位的积累，避免和减少药物在体内的分布及经肾脏快速排出，抑制药物对正常细胞造成的毒副作用。在过去的几十年里，人们已经发展了聚合物囊泡、胶束、水凝胶、药物键合聚合物以及其他药物载体。药物通过物理包埋进入聚合物或通过化学键合连接在聚合物上，这两种方式都可以保护疏水药物的活性并增强其水溶性。作为药物载体的聚合物纳米材料，要保证其在肿瘤细胞外的血液中长期稳定循环，就必须具有足够的稳定性。为了提高传统自组装胶束的稳定性，各种具有高级结构的聚合物如星型聚合物、树型聚合物或超支化聚合物等，由于其特殊的结构和性质，引起了人们对其理论研究和实际应用方面的极大兴趣。其中，星型聚合物因其制备相对容易、结构新奇、性能独特，有潜在的应用前景。
4.经典的具有低临界溶解温度(lower critical solution temperature，lcst)型温敏性聚合物，包括聚(n,n'-二乙基丙烯酰胺)(pndeaam)、聚(n,n'-二甲基氨基乙酯)(pdmaema)、聚(n-丙烯酰基吡咯烷酮)(pnap)、聚(2-异丙基-2-恶唑啉)(pipo)、弹性蛋白多肽、聚(甲基乙烯基醚)(pvme)、聚(n-乙烯基己内酰胺)(pnvc)和聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipaam)等，是一类十分具有使用价值的材料。在这类聚合物中，由于pnipaam的lcst值(约33℃)接近于人体正常生理温度(37℃)，因此受到研究者广泛而深入的研究。作为药物载体，温敏性聚合物在人体正常生理温度(37℃，低于lcst)时应保持亲水性，这样可以避免其被巨噬细胞捕捉，从而延长药物在血液里的循环时间，而当药物载体到达肿瘤组织时，由于此处的温度较正常组织高，约为40℃(稍高于lcst)，聚合物会发生亲水到疏水的相转变过程，聚合物链收缩，药物得以释放出来。因此，将温敏性聚合物与星型结构相结合，能创造出具有二者优点的新材料。
5.现有技术中，专利号cn2010581995.7发明的是一种温敏性星型嵌段共聚物，但该聚合物采用的是一种具有温敏性的单体nipaam进行聚合，所调节的温度范围较窄，且不容易调节至人体正常生理温度范围；专利号cn201711017437.6发明的是一种可以负载金纳米粒子的温度响应型核交联星型聚合物，内核为核交联星型聚合物，外臂是温敏性链段，整个聚合物在结构上与本发明有很大的差别。专利号cn201510640908.8发明的是一种星型聚合
物稳定的ph响应性乳液，星形聚合物为八甲基丙烯酰氧丙基笼型倍半硅氧烷为内核聚甲基二甲氨基乙酯为臂的星型聚合物，作为ph响应性乳化剂使用，不具有温度敏感性。专利号cn101961494b发明的是用于细胞内药物传递的星形聚合物纳米药物载体，该载体为具有还原敏感性的两亲性星形纳米聚合物，不具有温度敏感性。本发明专利的合成方法参考了兰州大学赵四杰硕士毕业论文和兰州大学涂晓燕博士毕业论文部分，但本专利将温敏性长链接枝到星型聚合物表面，形成了温敏性星型聚合物，并通过药物负载实验和细胞实验进行验证，这在目前的专利和文章中是没有报道过的。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种温敏性星型聚合物，所述温敏性星型聚合物具有易于调节的lcst，所形成的纳米粒子稳定，且对细胞没有毒性，可作为抗癌药物载体。
7.本发明的另一目的是提供一种温敏性星型聚合物载体的制备方法以及该温敏性星型聚合物载体的应用，所述制备方法操作简单、反应条件温和。
8.为此，本发明提供一种温敏性星型聚合物，其结构式为：
[0009][0010]
其中，
[0011][0012]
n、m、p为1-200范围内的自然数。
[0013]
为此，本发明还提供一种温敏性星型聚合物的制备方法，包括如下步骤：
[0014]
(1)将季戊四醇、ε-己内酯和异辛酸亚锡混合均匀，除氧后，在搅拌条件下反应，反应结束后，经真空干燥得到4s-pcl-oh，4s-pcl-oh的结构式为：
[0015][0016]
其中，
[0017]
p为1-200范围内的自然数；
[0018]
(2)将4s-pcl-oh、三乙胺和2-溴异丁酰溴加入二氯甲烷中，在搅拌的条件反应，反应结束后，经真空干燥得到4s-pcl-ibubr，4s-pcl-ibubr的结构式为：
[0019][0020]
其中，
[0021]
p为1-200范围内的自然数；
[0022]
(3)将4s-pcl-ibubr、n-羟乙基丙烯酰胺、n-异丙基丙烯酰胺、三(2-二甲氨基乙基胺)混合均匀，除氧后，在搅拌条件下反应，反应结束后，经透析后冻干得到4s-pcl-b-p(nipaam-st-heaam)，其结构式如下：
[0023][0024]
其中，
[0025][0026]
n、m、p为1-200范围内的自然数。
[0027]
本发明所述的温敏性星型聚合物的制备方法，优选的是，步骤(1)中，所述季戊四醇、所述ε-己内酯和所述异辛酸亚锡的摩尔比为1:20-40:0.01-0.10，进一步优选1:28:0.06。
[0028]
本发明所述的温敏性星型聚合物的制备方法，优选的是，步骤(1)中，所述反应的条件为：40～150℃、4-8h，进一步优选6h。
[0029]
本发明所述的温敏性星型聚合物的制备方法，优选的是，步骤(2)中，所述4s-pcl-oh、所述三乙胺和所述2-溴异丁酰溴的摩尔比为1:10-20:10-15，进一步优选1:16:12。
[0030]
本发明所述的温敏性星型聚合物的制备方法，优选的是，步骤(2)中，所述反应的条件为：常温、36～48h。
[0031]
本发明所述的温敏性星型聚合物的制备方法，优选的是，步骤(3)中，所述4s-pcl-ibubr、所述n-羟乙基丙烯酰胺、所述n-异丙基丙烯酰胺、所述三(2-二甲氨基乙基胺)的摩尔比为1:2-8:20-60:0.01-0.50，进一步优选1:4.6:35.6:0.16。
[0032]
本发明所述的温敏性星型聚合物的制备方法，优选的是，步骤(3)中，所述反应的条件为：50～70℃、4～10h。
[0033]
为此，本发明还提供一种上述的温敏性星型聚合物作为抗癌药物载体的应用。
[0034]
本发明提供的温敏性星型聚合物的制备方法，具体的，包括如下步骤：
[0035]
(1)按摩尔比为1:28:0.06，将季戊四醇、ε-己内酯(ε-cl)和异辛酸亚锡混合均匀，除氧，40～150℃下搅拌反应6h，经真空干燥得到4s-pcl-oh；反应式如下：
[0036][0037]
其中，
[0038][0039]
(2)按摩尔比为1:16:12，将4s-pcl-oh、三乙胺和2-溴异丁酰溴(i-bubr)加入二氯甲烷(dcm)中，常温搅拌反应36～48h，经真空干燥得到4s-pcl-ibubr；反应式如下：
[0040][0041]
其中，
[0042][0043]
(3)按摩尔比为1:4.6:35.6:0.16，将4s-pcl-ibubr、n-羟乙基丙烯酰胺(heaam)、n-异丙基丙烯酰胺(nipaam)、三(2-二甲氨基乙基胺)混合均匀，除氧，50～70℃下搅拌反应4～10h，经透析后冻干得到4s-pcl-b-p(nipaam-st-heaam)；反应式如下：
[0044][0045]
其中，
[0046][0047]
本发明温敏性星型聚合物的lcst值为37.9℃，介于人体正常生理温度(37℃)和肿瘤局部高热(约40℃)之间，满足生物医学要求。
[0048]
本发明温敏性星型聚合物能够物理包埋药物，具有作为抗癌药物载体的应用前景。
[0049]
与现有技术相比本发明的优点和效果：
[0050]
本发明得到的温敏性星型聚合物具有lcst易于调节，且在人体正常生理温度下可形成稳定的纳米粒子，可保证粒子在人体内的长时间稳定循环。该温敏性星型聚合物的内核具有疏水性，能够物理包埋疏水性药物，外层聚合物长链在人体正常生理温度下具有亲水性，能够保护药物不被过早释放，当在肿瘤局部高热下粒子会发生亲水性到疏水性的转变，药物在肿瘤部位得到快速释放，达到治疗效果。该温敏性星型聚合物可作为疏水性药物载体应用。所采用的制备方法反应操作简单，条件温和。
附图说明
[0051]
图1本发明实施例1的温敏性星型聚合物的粒径随温度变化的相转变行为图。
[0052]
图2本发明实施例1的温敏性星型聚合物形成的纳米粒子的透射电镜图。
[0053]
图3本发明实施例3的温敏性星型聚合物形成的纳米粒子的体外药物释放曲线图。
[0054]
图4本发明实施例3的温敏性星型聚合物形成的纳米粒子对hela细胞的体外细胞毒性图。
[0055]
图5本发明实施例3的温敏性星型聚合物载药纳米粒子对hela细胞的体外细胞毒性图。
具体实施方式
[0056]
以下对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。
[0057]
实施例1
[0058]
温敏性星型聚合物的制备
[0059]
a)称取0.1375g季戊四醇和3.2279gε-己内酯置于反应管，冻-抽-解冻除氧三次，密封反应管，140℃油浴中大力搅拌约8min，使其成为均相。冷冻后氮气保护下加入24.3mg异辛酸亚锡，再次冻-抽-解冻除氧三次，密封，140℃反应6h。反应结束后，待反应管冷却，向内加入少量四氢呋喃稀释产物，过量冷无水甲醇沉淀，离心，得到粗产物，再次用四氢呋喃稀释，冷无水甲醇沉淀并离心，重复过程三次，最后真空干燥得4s-pcl-oh。
[0060]
b)称取1.7g上述聚合物4s-pcl-oh，溶于7ml无水二氯甲烷，溶解得均匀混合物。将混合物置于冰浴中，加入0.4g三乙胺，搅拌约10min，再加入0.7g 2-溴异丁酰溴，0℃搅拌20min，然后常温搅拌反应48h。反应结束后，将溶剂旋干，加四氢呋喃溶解，抽滤除去不溶物，将滤液在过量的冷无水甲醇中沉淀，离心，得到粗产物，再次加入四氢呋喃稀释，冷无水甲醇沉淀和离心，重复过程三次，最后真空干燥得大分子引发剂4s-pcl-ibubr。
[0061]
c)称取0.09g上述所得的大分子引发剂4s-pcl-ibubr、0.198g单体n-羟乙基丙烯酰胺、1.52gnipaam和13.8mg配体三(2-二甲氨基乙基胺)溶于1.5mln，n-二甲基甲酰胺和1.5ml异丙醇，溶解完全后置于聚合管，冻-抽-解冻除氧三次，氮气保护下加入7.18mg溴化亚酮固体粉末，继续冻-抽-解冻循环三次，封管，60℃反应2h。反应完成后，空气淬灭，加入少量四氢呋喃稀释，用过量冷无水乙醚沉淀，离心，少量n，n-二甲基甲酰胺溶解后对水透析48h，冻干后得到白色絮状固体4s-pcl-b-p(nipaam-st-heaam)。
[0062]
实施例2-1
[0063]
温敏性星型聚合物的相转变行为测试
[0064]
配制浓度为1.0mg/ml的温敏性星型聚合物(实施例1制备)的磷酸盐缓冲溶液(pbs，ph7.4，离子强度为150mm)3ml，转移至紫外样品池中，然后在lambda 35紫外-可见分光光度计上测定，以0.2℃/min的速率升温，记录其在500nm波长下的透过率，绘制透过率-温度曲线，定义透过率变化值的50％即为聚合物的lcst值。
[0065]
实施例1的温敏性星型聚合物的粒径随温度变化的相转变行为图参见图1。
[0066]
实施例2-2
[0067]
温敏性星型聚合物的透射电镜图
[0068]
测试前，先将10μl聚合物(实施例1制备的温敏性星型聚合物)水溶液滴在200目碳膜铜网上，15min后用滤纸边缘吸走多余的溶液，然后滴加浓度为1％的磷钨酸溶液进行染色，10min后用滤纸吸走多余的溶液，并将铜网自然晾干待用。在加速电压200kev条件下，使用tem观察温度敏感性星型聚合物自组装胶束的形貌。
[0069]
实施例1的温敏性星型聚合物形成的纳米粒子的透射电镜图参见图2。
[0070]
实施例3
[0071]
温敏性星型纳米粒子的制备
[0072]
将1.0mg阿霉素盐酸盐(dox
·
hcl)溶于2.0ml n，n-二甲基甲酰胺中，再加入0.26g三乙胺，避光条件下常温搅拌过夜，以除去药物中的盐酸盐。然后，将10mg星型聚合物(实施例1制备的温敏性星型聚合物)溶于2.0ml n，n-二甲基甲酰胺中，并转移至上述含阿霉素(dox)的n，n-二甲基甲酰胺溶液中，搅拌1h后将溶液逐滴加入4.0ml超纯水中，滴加完后继续搅拌1h。将混合溶液转移至截留分子量为3500的透析袋中，用超纯水透析24h，前12h每隔3h换一次透析水，以除去未完全包封的自由阿霉素。透析完成后，将透析袋内的溶液冻干，得到温度敏感性的载药纳米粒子。
[0073]
实施例4
[0074]
温敏性星型载药纳米粒子的体外药物释放曲线图
[0075]
以pbs为释放介质，考察聚合物载药纳米粒子(实施例3制备的温度敏感性的载药纳米粒子)分别在温度为25、37和40℃下的阿霉素药物释放行为。具体过程为：称取一定质量的聚合物载药纳米粒子，溶于pbs，配制成浓度为1mg/ml的载药纳米胶束。将1ml聚合物溶液转入截留分子量为3500的透析袋内，放入装有25mlpbs的离心管内，然后在恒温水浴摇床内进行药物释放，设置摇床转速为120转/min。在预定的时间，0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48和96h，从离心管取出3ml释放介质并收集在5ml离心管内，同时补充3ml新鲜的pbs溶液，平行做3组。最后，使用uv-vis分光光度计测定样品在485nm波长下的吸光度。96h时将透析袋内的溶液冻干，称量一定质量的样品，溶于n，n-二甲基甲酰胺中，测定其在485nm波长下的吸光度。将不同时间内阿霉素的累积释放浓度与总的阿霉素的浓度相比，即可得到阿霉素累积释放百分比曲线。整个操作过程均在避光条件下进行。
[0076]
实施例3的温敏性星型聚合物形成的纳米粒子的体外药物释放曲线图参见图3。
[0077]
实施例5
[0078]
温敏性星型聚合物对hela细胞的体外细胞毒性图
[0079]
首先，将100μl hela细胞种于96孔细胞培养板，细胞密度为2500个/孔，放入5％co2环境且温度为37℃的培养箱中培养24h。将实施例1制备的温敏性星型聚合物样品配制
成一系列不同浓度的试样，然后再用培养基稀释10倍。用pbs冲洗掉细胞并在每个孔内加入40μl不同浓度的聚合物样品，37℃下培养4h后，再次用pbs冲洗掉细胞，并加入100μl培养基，培养24h后加入20μl 3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2氢-四唑(mts)染色剂，最后将细胞放入5％co2环境且温度为37℃的培养箱中培养3h。将酶标仪的波长设置为490nm，测定每个孔对应样品的吸光度，从而计算出对应的细胞存活率及其半数抑制浓度(ic
50
)值。
[0080]
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的保护范围。