CCR6基因人源化非人动物的构建方法及应用与流程

ccr6基因人源化非人动物的构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种ccr6基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。


背景技术：

2.趋化因子(chemoattractant cytokine)是能够使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，所谓趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动；趋化因子受体是能够特异性结合趋化因子的细胞膜蛋白，是细胞表面g蛋白偶联受体视紫红质家族的一大分支，通常具有七次跨膜结构域。趋化因子及其受体与炎症、肿瘤、自身免疫病、变态反应、获得性免疫缺陷综合征等疾病密切相关。人趋化因子受体6(chemokine receptor 6，ccr6)于1996年由zaballos等人通过简并引物的方法克隆发现，在淋巴/非淋巴组织器官均有表达，主要表达于脾、淋巴结、胸腺、胎肝组织及记忆t细胞、b淋巴细胞和未成熟的树突状细胞等，其唯一趋化因子配体为ccl20，二者结合可引起细胞内肌动蛋白聚合和伪足形成，进而调节细胞的运动和迁移。研究发现，ccr6及其配体在胰腺癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌和血液系统恶性肿瘤细胞中表达上调，并且与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。此外，还有研究发现，ccr6及其配体在受损性银屑病皮肤高表达，使用ccr6小分子拮抗剂可以有效治疗小鼠银屑病；ccr6还参与了溃疡性结肠炎的发生和发展，以及在免疫细胞介导的炎症反应、移植排斥反应中发挥了重要作用。
3.实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
4.鉴于ccr6/ccl20信号轴在肿瘤及自身免疫性疾病等治疗领域的巨大应用潜力，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发ccr6/ccl20信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在
学术和临床研究中具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的第一方面，提供了一种人源化ccr6基因，所述的人源化ccr6基因包含人ccr6基因的至少部分。
6.优选的，所述的人源化ccr6基因包含编码人ccr6蛋白的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，所述的人源化ccr6基因包含编码人ccr6蛋白的胞质区、胞外区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，更优选的，包含编码人ccr6蛋白的胞外区的全部或部分核苷酸序列。
7.优选的，所述的人源化ccr6基因包含与编码seq id no：2的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码seq id no：2的核苷酸序列。
8.优选的，所述的人源化ccr6基因编码人源化ccr6蛋白。
9.优选的，所述的人源化ccr6基因包含人ccr6基因的1号外显子至3号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含人ccr6基因的2号至3号外显子的全部或部分，更优选的，包含人ccr6基因的2号和/或3号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含人ccr6基因的2号外显子的部分和3号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、20、30、50、70、100、105、106bp的核苷酸序列；所述人ccr6基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，3号外显子的部分至少包含500bp的核苷酸序列，例如至少包含500、700、900、1000、1100、1110、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1500、2000、2500、2700、2900、2902bp的核苷酸序列；3号外显子的部分至少包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。
10.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ccr6基因中包含的人ccr6基因选自下列组中的一种：
11.(a)包含seq id no：5所示核苷酸序列的全部或部分；
12.(b)包含与seq id no：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
13.(c)包含与seq id no：5示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
14.(d)具有seq id no：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
15.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ccr6基因转录的mrna选自下列组中的一种：
16.(a)包含seq id no：12所示核苷酸序列的全部或部分；
17.(b)包含与seq id no：12所示核苷酸序列的同一性至少为75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
18.(c)包含与seq id no：12所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或
19.(d)包含seq id no：12所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
20.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ccr6基因还包括非人动物ccr6基因的1号外显子的全部和/或2号外显子的部分；优选的，所述的非人动物ccr6基因的1号外显子的全部和/或2号外显子的部分与nc_000083.7相应的1号外显子、2号外显子至少具有70％、80％、90％或至少95％的同一性；进一步优选的，所述的非人动物ccr6基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分与nm_001190337.1相应的1号外显子、2号外显子一致。
21.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
22.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
23.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
24.优选的，所述的人源化ccr6基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
25.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet-off system/tet-on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
26.本发明的第二方面，提供了一种人源化ccr6蛋白，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6蛋白的全部或部分。
27.优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6蛋白的胞质区、胞外区和/或跨膜区的全部或部分。
28.进一步优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6蛋白的胞外区的全部或部分。
29.优选的，所述的人源化ccr6蛋白是由上述的人源化ccr6基因编码的。
30.优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6基因的1号至3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6基因的2号和/或3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，更优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6基因的2号至3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，更优选的，包含从人ccr6基因的起始密码子开始至终止密码子为止编码的氨基酸序列。
31.优选的，所述的人源化ccr6蛋白至少包含seq id no：5编码的氨基酸序列，或包含与seq id no：5编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
32.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ccr6蛋白中包含的人ccr6蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
33.a)包含seq id no：2所示氨基酸序列的全部或部分；
34.b)包含seq id no：2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
35.c)包含seq id no：2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，
36.d)包含seq id no：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
37.本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人ccr6基因的至少部分。
38.优选的，所述的靶向载体包含人ccr6基因的部分；进一步优选的，所述的人ccr6基因的部分包含人ccr6基因的1号至3号外显子的全部或部分；更优选的，所述的人ccr6基因的部分包含人ccr6基因的2号至3号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人ccr6基因的部分包含人ccr6基因的2号和/或3号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含2号外显子的部分和3号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、20、30、50、70、100、105、106bp的核苷酸序列；所述人ccr6的基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，3号外显子的部分至少包含500bp的核苷酸序列，例如至少包含500、700、900、1000、1100、1110、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1500、2000、2500、2700、2900、2902bp的核苷酸序列；3号外显子的部分至少包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止，优选的，所述的靶向载体包含seq id no：5所示核苷酸序列。
39.优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的dna片段，即5’臂(5’同源臂)，其选自非人动物ccr6基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与ncbi登录号为nc_000083.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与seq id no：3或seq id no：42至少具有90％同源性，或者如seq id no：3或seq id no：42所示。
40.优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的dna片段，即3’臂(3’同源臂)，其选自非人动物ccr6基因基因组dna的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与ncbi登录号为nc_000083.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与seq id no：4或seq id no：43至少具有90％同源性，或者如seq id no：4或seq id no：43所示。
41.优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素a亚基的编码基因(dta)。
42.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列neo。
43.在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为frt重组位点(也可选择常规的loxp重组系统)，所述的特异性重组系统为具有两个frt重组位点，优选分别同向连接在抗性基因的两侧。
44.优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物ccr6基因座上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物ccr6基因2号外显子上。优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
45.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为
啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
46.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
47.本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。
48.本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在ccr6基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于插入、翻转、敲除或替换。
49.本发明的第六方面，提供了一种ccr6基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化ccr6蛋白。
50.优选的，所述的非人动物的内源ccr6蛋白表达降低或缺失。
51.优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化ccr6蛋白。
52.优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6基因的1号至3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6基因的2号和/或3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，更优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含人ccr6基因的2号至3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，更进一步优选的，所述的人源化ccr6蛋白包含从人ccr6基因的起始密码子开始至终止密码子为止编码的氨基酸序列。
53.优选的，所述的人源化ccr6蛋白至少包含seq id no：5编码的氨基酸序列，或包含与seq id no：5编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
54.在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化ccr6蛋白中包含的人ccr6蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
55.a)包含seq id no：2所示氨基酸序列的全部或部分；
56.b)包含seq id no：2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；
57.c)包含seq id no：2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
58.d)包含seq id no：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
59.优选的，所述的非人动物体内的ccr6基因包含人或人源化ccr6基因。
60.优选的，所述的非人动物体内包含编码人ccr6蛋白的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含与编码seq id no：2的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码seq id no：2的核苷酸序列。
61.优选的，所述的非人动物体内包含人ccr6基因的1号外显子至3号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含人ccr6基因的2号至3号外显子的全部或部分，更优选的，包含人ccr6基因的2号和/或3号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含人ccr6基因的2号外显子的部分和3号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、20、30、50、70、100、105、106bp的核苷酸
序列；所述人ccr6基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，3号外显子的部分至少包含500bp的核苷酸序列，例如至少包含500、700、900、1000、1100、1110、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1500、2000、2500、2700、2900、2902bp的核苷酸序列；3号外显子的部分至少包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。
62.在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物体内包含的人ccr6基因选自下列组中的一种：
63.(a)包含seq id no：5所示核苷酸序列的全部或部分；
64.(b)包含与seq id no：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；
65.(c)包含与seq id no：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，
66.(d)具有seq id no：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
67.在本发明的一个具体实施方式中，所述的ccr6基因还包括非人动物ccr6基因的1号外显子的全部和/或2号外显子的部分；优选的，所述的非人动物ccr6基因的1号外显子的全部和/或2号外显子的部分与nc_000083.7相应的1号外显子、2号外显子至少具有70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的同一性；进一步优选的，所述的非人动物ccr6基因的1号外显子的全部和/或2号外显子的部分与nm_001190337.1相应的1号外显子、2号外显子一致。
68.优选的，所述的非人动物的基因组中包含seq id no:44、45、46和/或47所示核苷酸序列。
69.优选的，所述的人源化ccr6基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。
70.在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(tet-off system/tet-on system)或他莫昔芬系统(tamoxifen system)。
71.优选的，所述人或人源化ccr6基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性ccr6基因的内源调控元件。
72.根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自pd-1、pd-l1、il4、il4r、il6、il6r、il17、ccr4和ccr8中的至少一种。
73.根据本发明的一些实施例，所述人或人源化ccr6基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。
74.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
75.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
76.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优
选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
77.本发明的第七方面，提供了一种ccr6基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化ccr6蛋白，或者，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化ccr6基因。
78.优选的，所述的人源化ccr6蛋白为上述的人源化ccr6蛋白，优选的，包含seq id no：2或与seq id no：2同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。
79.优选的，所述的人源化ccr6基因为上述的人源化ccr6基因。
80.优选的，所述的非人动物为上述的ccr6基因人源化的非人动物。
81.优选的，所述的构建方法包括用包含人ccr6基因的1号至3号外显子的全部或部分导入非人动物ccr6基因座，进一步优选的，用包含人ccr6基因的2号至3号外显子的全部或部分导入非人动物ccr6基因座，更优选的，用包含人ccr6基因的2号和/或3号外显子的全部或部分导入非人动物ccr6基因座，更进一步优选的，用包含人ccr6的基因的2号外显子的部分和3号外显子的部分核苷酸序列导入非人动物基因座，进一步优选的，包含2-3号内含子；其中，2号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、20、30、50、70、100、105、106bp的核苷酸序列；所述人ccr6基因的2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，3号外显子的部分至少包含500bp的核苷酸序列，例如至少包含500、700、900、1000、1100、1110、1115、1116、1117、1118、1119、1120、1500、2000、2500、2700、2900、2902bp的核苷酸序列；3号外显子的部分至少包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止，优选的，用包含seq id no：5的核苷酸序列导入至非人动物基因座上。
82.优选的，本技术中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因。
83.优选的，所述的人或人源化ccr6基因可操作连接到至少一条染色体上内源ccr6基因的内源调控元件。
84.所述的人或人源化ccr6基因在非人动物中通过调控元件进行调控。所述的调控元件包括但不限于内源启动子，所述的调控元件可以是内源或者外源的。例如，所述的外源性调控元件可以来自人ccr6基因。
85.在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源调控元件来自非人动物ccr6基因。
86.优选的，所述的导入的位置位于ccr6基因的内源调控元件之后。
87.优选的，所述的导入为替换或插入，在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物ccr6基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物ccr6基因的1号至2号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物ccr6基因的2号外显子的部分被替换，其中，所述非人动物ccr6基因的2号外显子的部分至少包含从非人动物ccr6基因的起始密码子至终止密码子，优选至少包含2号外显子5
’‑3’
的500-1179bp的核苷酸序列，具体为2号外显子长度为500、700、900、1000、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110或1179bp的核苷酸序列。
88.优选的，编码seq id no：1的核苷酸序列被替换。
89.优选的，所述的构建方法包括用包含编码人ccr6蛋白的全部或部分核苷酸序列导
入非人动物ccr6基因座，进一步优选的，用包含与编码seq id no：2的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码seq id no：2的核苷酸序列插入或替换到非人动物ccr6基因座上。
90.优选的，所述的构建方法包括用包含所述人或人源化ccr6基因的核苷酸序列插入或替换到非人动物ccr6基因座上。
91.优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源ccr6基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可给内源ccr6基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。
92.优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人ccr6蛋白或人源化ccr6蛋白。
93.优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。
94.优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向ccr6基因的sgrna与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物ccr6基因，同时所述sgrna的序列在待改变的ccr6基因上的靶序列上。
95.优选的，所述sgrna的5’端靶位点位于ccr6基因的2号外显子序列上。
96.优选的，所述sgrna的3’端靶位点位于ccr6基因的2号外显子序列上。
97.优选的，所述的sgrna的5’端靶位点序列如seq id no:6-11任一项所示。
98.优选的，所述的sgrna的3’端靶位点序列如seq id no:13-17任一项所示。
99.在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向ccr6基因的sgrna及cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得ccr6基因人源化的非人动物。
100.根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将ccr6基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
101.优选的，所述的其他基因为pd-1、pd-l1、il4、il4r、il6、il6r、il17、ccr4和ccr8中的至少一种基因。
102.优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的pd-1、pd-l1、il4、il4r、il6、il6r、il17、ccr4和ccr8蛋白中的至少一种。
103.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。
104.本发明的第八方面，提供了一种ccr6基因敲除的非人动物，所述的非人动物缺失ccr6基因的全部或部分核苷酸序列。
105.优选的，所述的非人动物缺失ccr6基因的2号外显子的全部或部分，其中缺失的2号外显子的部分至少包含从非人动物ccr6基因的起始密码子至终止密码子，优选至少包含2号外显子5
’‑3’
的500-1179bp的核苷酸序列具体为2号外显子5’端长度为500、700、900、1000、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110或1179bp的核苷酸序列。
106.优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。
107.优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。
108.优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是nod-prkdc
scid il-2rγ
null
小鼠、nod-rag 1-/-‑
il2rg-/-(nrg)小鼠、rag 2-/-‑
il2rg-/-(rg)小鼠、nod/scid小鼠或者裸鼠。
109.本发明的第九方面，提供了一种ccr6基因敲除的非人动物的构建方法，使用sgrna进行非人动物的构建。其中，所述的sgrna靶向非人动物ccr6基因，同时所述sgrna的序列在待改变的ccr6基因上的靶序列上是唯一的。
110.优选的，所述sgrna的靶位点位于ccr6基因的1号外显子至2号外显子序列上。进一步优选的，所述sgrna的5’端靶位点位于ccr6基因的2号外显子序列上，更优选的，所述sgrna的3’端靶位点位于ccr6基因的2号外显子序列上。
111.优选的，所述的sgrna的5’端靶位点序列如seq id no:6-11任一项所示。
112.优选的，所述的sgrna的3’端靶位点序列如seq id no:13-17任一项所示。
113.本发明的第十方面，提供了一种sgrna，所述的sgrna靶向非人动物ccr6基因，同时所述sgrna的序列在待改变的ccr6基因上的靶序列上。
114.优选的，所述sgrna的靶位点位于ccr6基因的2号外显子上。进一步优选的，所述sgrna的5’端靶位点位于ccr6基因的2号外显子序列上，更优选的，所述sgrna的3’端靶位点位于ccr6基因的2号外显子序列上。
115.优选的，所述的sgrna的5’端靶位点序列如seq id no:6-11任一项所示。
116.优选的，所述的sgrna的3’端靶位点序列如seq id no:13-17任一项所示。
117.本发明的第十一方面，提供了一种编码上述sgrna的dna分子。优选的，所述的dna分子双链分别为上述sgrna的上下游序列，或者加入酶切位点后的正反向寡核苷酸序列。
118.在本发明的一个具体实施方式中，所述的dna分子双链分别为seq id no:18和seq id no:20，seq id no:19和seq id no:21。
119.在本发明的一个具体实施方式中，所述的dna分子双链分别为seq id no:22和seq id no:24，seq id no:23和seq id no:25。
120.本发明的第十二方面，提供了一种sgrna载体，所述的sgrna载体包含上述sgrna。
121.本发明的第十三方面，提供了一种包含上述靶向载体、上述sgrna、上述dna分子或上述sgrna载体的细胞。
122.本发明的第十四方面，提供了一种上述靶向载体、上述sgrna、上述dna分子、上述sgrna载体或上述的细胞在ccr6基因修饰中的应用。优选包含在敲除、插入或替换ccr6基因中的应用。
123.本发明的第十五方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
124.i)提供上述的ccr6基因人源化的非人动物或ccr6基因敲除的非人动物，或者采用上述的构建方法获得的ccr6基因人源化的非人动物；
125.ii)将步骤i)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接
进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。
126.优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因pd-1、pd-l1、il4、il4r、il6、il6r、il17、ccr4或ccr8修饰的非人动物。
127.优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
128.优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。
129.本发明的第十六方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代，所述的非人动物或其子代选自ccr6基因人源化的非人动物、ccr6基因敲除的非人动物或者多基因修饰的非人动物。
130.本发明的第十七方面，提供了一种疾病动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代，优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。
131.本发明的第十八方面，提供了一种疾病动物模型的制备方法，所述的制备方法包括上述ccr6基因人源化的非人动物、ccr6基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物的步骤；优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症，进一步优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。
132.本发明的第十九方面，提供了上述ccr6基因人源化的非人动物、上述ccr6基因敲除的非人动物、上述构建方法获得的ccr6基因人源化的非人动物、上述ccr6基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代在制备疾病动物模型中的应用，优选的，所述的疾病包括自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。
133.本发明的第二十方面，提供了上述的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或上述的疾病动物模型在制备治疗自身免疫性疾病、肿瘤和/或炎症的药物中的应用。
134.本发明的第二十一方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的疾病动物模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。
135.本发明的第二十二方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的疾病动物模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。
136.优选的，所述组织为瘤组织。
137.本发明的第二十三方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织包含上述的人源化ccr6蛋白或上述的人源化ccr6基因。
138.优选的，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病动物模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。
139.本发明的第二十四方面，提供了一种ccr6基因人源化的细胞，所述的细胞表达人ccr6蛋白或人源化ccr6蛋白。
140.优选的，所述的人源化ccr6蛋白选自上述的人源化ccr6蛋白。
141.优选的，所述的细胞中内源ccr6蛋白的表达降低或缺失。
142.优选的，所述的细胞的基因组中包含人ccr6基因的部分，进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化ccr6基因。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
143.本发明的第二十五方面，提供了一种ccr6基因敲除的细胞，所述的细胞中缺失ccr6基因的全部或部分核苷酸序列。
144.优选的，所述的细胞缺失ccr6基因的2号外显子的全部或部分核苷酸序列，其中缺失的2号外显子的部分至少包含从非人动物ccr6基因的起始密码子至终止密码子，优选至少包含2号外显子5
’‑3’
的500-1179bp的核苷酸序列具体为2号外显子5’端开始至长度为500、700、900、1000、1100、1101、1102、1103、1104、1105、1106、1107、1108、1109、1110或1179bp的核苷酸序列。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
145.本发明的第二十六方面，提供了一种表达上述的人源化ccr6蛋白的构建体，优选的，所述的构建体中包含上述人源化ccr6基因。
146.本发明的第二十七方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。
147.本发明的第二十八方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。
148.本发明的第二十九方面，提供了来源于上述的人源化ccr6蛋白、上述的人源化ccr6基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的疾病动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织的应用，所述的应用包括：
149.在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；
150.在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；
151.或者，
152.在筛选、验证、评价或研究ccr6功能、人ccr6信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。
153.本发明的第三十方面，提供了上述ccr6基因人源化的非人动物、上述ccr6基因敲除的非人动物、上述构建方法获得的ccr6基因人源化的非人动物、上述ccr6基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代在制备人ccr6特异性调节剂或者筛选人ccr6特异性调节剂的产品中的应用。
154.本发明的第三十一方面，提供了一种人ccr6特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向个体施加调节剂，检测调节效果；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。
155.优选的，所述的调节剂选自car-t、药物，进一步优选的，所述的药物为抗体。
156.优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
157.优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。
158.优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。
159.优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
160.优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
161.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
162.优选的，所述人ccr6特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
163.本发明的第三十二方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行调节效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病动物模型。
164.优选的，所述的评价方法还包括向个体植入肿瘤细胞。
165.优选的，所述的干预方案选自car-t、药物治疗，进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白，所述的抗原结合蛋白为抗体。
166.优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。
167.优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法，该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
168.本发明的第三十三方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或疾病动物模型在制备治疗肿瘤、炎症或自身免疫性疾病的药物中的用途。
169.本发明所述的“替换”指将外源遗传物质置于内源基因座处，从而用直系同源或同源核酸序列替换内源基因的全部或一部分。在一个实例中，用相应的人基因或其片段替换内源非人基因或其片段。相应的人基因或其片段是作为被替换的内源非人基因或其片段的直系同源物或同系物，或在结构和/或功能上与被替换的内源非人基因或其片段基本上同一或相同的人基因或片段。在另一个实施例中，在删除内源基因或使内源基因成为非功能性(诸如通过插入错义突变或过早终止密码子)并将相应的人基因或其片段在分开的位置处插入种系中时能发生基因替换。
170.本发明所述的“转基因”指通过人工干预将外源遗传物质插入细胞基因组内，诸如通过显微注射或通过用重组病毒感染直接或间接引入前体细胞内，在掺入外源遗传物质后，在细胞内诱导遗传改变，其中，在此过程中用于稳定整合的载体包括：质粒、逆转录病毒载体和其他动物病毒、yac(酵母人工染色体)、bac(细菌人工染色体)等。
171.本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、b细胞肿瘤、t细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括b细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自b细胞肿瘤、t细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤。优选包括b或t细胞急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓细胞白血病(aml)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)和多发性骨髓瘤(mm)、鼻咽癌、肺癌。
172.本发明所述的“自身免疫性疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。
173.本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。
174.本发明保护的主题“细胞”、“细胞或细胞系或原代细胞培养物”、“组织”、“组织或器官或其培养物”均不能发育为动物，其中，所述的细胞不是干细胞或受精卵细胞，所述的细胞可以是体细胞、淋巴细胞(优选为t细胞或b细胞)或肿瘤细胞等等，所述的组织可以是脾脏、淋巴结、骨髓、肿瘤或其培养物等等。
175.本发明所述的ccr6基因人源化的非人动物体内可以正常表达人ccr6蛋白或人源化ccr6蛋白。可用于针对人ccr6靶位点的药物筛选、药效评估、炎症、自身免疫性疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究ccr6蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。
176.本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。
177.本发明所述的“人源化ccr6蛋白”，包含来源于人ccr6蛋白的部分。其中，所述的“人ccr6蛋白”同“人ccr6蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人ccr6蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人ccr6蛋白的部分”，为连续或间隔的5-374个(优选为10-374个)氨基酸序列与人ccr6蛋白的氨基酸序列一致或与人ccr6蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。
178.本发明所述的“人源化ccr6基因”，包含来源于人ccr6基因的部分和非人ccr6基因的部分。其中，所述的“人ccr6基因”同“人ccr6基因的全部”，即其核苷酸序列与人ccr6基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人ccr6基因的部分”为连续或间隔的20-27347bp(优选为20-1125bp)个核苷酸序列与人ccr6基因一致或与人ccr6基因具有70％以上同源性。
179.本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“2号至3号外显子”包含1号外显子、2-3号内
含子、3号外显子的全部核苷酸序列。
180.本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子与3号外显子之间的内含子。
181.本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人ccr6基因的3号外显子的部分，包含连续或间隔的5-2325bp个，优选10-1116bp个核苷酸序列与人ccr6基因的3号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化ccr6基因”中包含的“3号外显子的部分”至少包括从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。
182.本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段dna片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“ccr6基因座”表示ccr6基因1号至2号外显子上的任选一段的dna片段。优选为1号外显子、2号外显子或其期间的内含子中的任一个或两个或多个的组合，或一个或两个或多个的全部或部分，更优选为ccr6基因的2号外显子上。
183.本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为dna、cdna、pre-mrna、mrna、rrna、hnrna、mirnas、scrna、snrna、sirna、sgrna、trna。
184.本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
185.本发明所述的“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
186.在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。
187.在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿
动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
188.在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自balb/c、a、a/he、a/j、a/wysn、akr、akr/a、akr/j、akr/n、ta1、ta2、rf、swr、c3h、c57br、sjl、c57l、dba/2、km、nih、icr、cfw、faca、c57bl/a、c57bl/an、c57bl/grfa、c57bl/kalwn、c57bl/6、c57bl/6j、c57bl/6byj、c57bl/6nj、c57bl/10、c57bl/10scsn、c57bl/10cr和c57bl/ola的c57bl、c58、cba/br、cba/ca、cba/j、cba/st、cba/h品系的小鼠及nod、nod/scid、nod-prkdcscid il-2rgnull背景的小鼠。
189.本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
190.除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组dna和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：molecularcloning a laboratory manual，2nded.，ed.by sambrook，fritschandmaniatis(cold spring harbor laboratory press：1989)；dna cloning，volumes i and ii(d.n.glovered.，1985)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gaited.，1984)；mullisetal.u.s.pat.no.4，683，195；nucleic acid hybridization(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；transcription and translation(b.d.hames&s.j.higginseds.1984)；culture of animal cells(r.i.freshney，alanr.liss，inc.，1987)；immobilized cells and enzymes(irl press，1986)；b.perbal，a practical guide to molecular cloning(1984)；the series，methods in enzymology(j.abelson and m.simon，eds.inchief，academic press，inc.，new york)，specifically，vols.154and 155(wuetal.eds.)and vol.185，
″
gene expression technology
″
(d.goeddel，e d.)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.h.miller and m.p.caloseds.，1987，cold spring harbor laboratory)；immunochemical methods in cell and molecular biology(mayer and walker，eds.，academic press，london，1987)；handbook of experimental immunology，volumes v(d.m.weir and c.c.blackwell，eds.，1986)；and manipulating the mouse embryo，(cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，1986)。
191.以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
192.本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。
193.下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
194.以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
195.图1：小鼠ccr6基因座和人ccr6基因座对比示意图(非按比例)；
196.图2：小鼠ccr6基因人源化改造示意图(非按比例)；
197.图3：ccr6基因打靶策略及靶向载体v1设计示意图(非按比例)；
no：2))对比示意图如图1所示。
223.为了达到本发明的目的，可在小鼠内源ccr6基因座引入编码人ccr6蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化ccr6蛋白。具体来说，使用基因编辑技术在小鼠ccr6基因调节元件的控制下，用编码人ccr6蛋白的核苷酸序列替换小鼠相应序列，得到人源化ccr6基因座示意图如图2所示，实现对小鼠ccr6基因的人源化改造。
224.进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体v1上含有小鼠ccr6基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人ccr6蛋白的核苷酸序列的a片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：42)与ncbi登录号为nc_000083.7的第8470856至8474796位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：43)与ncbi登录号为nc_000083.7的第8476674至8480827位核苷酸序列相同；a片段上包含的人ccr6基因序列如seq id no：5所示；a片段中人ccr6序列上游与小鼠的连接设计为片段中人ccr6序列上游与小鼠的连接设计为其中序列“cagga”的最后一个“a”是小鼠的最后一个核苷酸，序列中的第一个“a”是人的第一个核苷酸；人ccr6序列下游与小鼠的连接设计为为其中序列“atgtga”的最后一个“a”是人的最后一个核苷酸，序列中的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。
225.靶向载体v1上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统frt重组位点，组成neo盒(neo cassett e)。其中neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为端与小鼠基因的连接设计为其中序列“ggtcac”中的最后一个“c”是小鼠的最后一个核苷酸，序列中的“g”是neo盒的第一个核苷酸；neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为端与小鼠基因的连接设计为其中序列“gatcc”中的最后一个“c”是neo盒的最后一个核苷酸，序列中的“c”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素a亚基的编码基因(dta))。改造后的人源化小鼠ccr6的mrna序列如seq id no：12所示，表达的蛋白序列如seq id no：2所示。
226.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入c57bl/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用pcr和southern blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产f0代嵌合体鼠(黑白相间)。将f0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得f1代鼠，再将f1代杂合小鼠互相交配即可获得f2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图11)后，再通过互相交配即可得到ccr6基因人源化纯合子小鼠。可通过pcr引物对l-gt-f/l-gt-r鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物序列及目的片段长度见表3)，示例性的f1代小鼠(已去除neo标记基因)的鉴定结果见图12，其中，编号为f1-01、f1-02、f1-03的3只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代
且无随机插入的ccr6基因人源化小鼠。
227.此外，还可以引入crispr/cas系统进行基因编辑，设计如图10所示的打靶策略，图中显示了靶向载体v2上含有小鼠ccr6基因上游和下游的同源臂序列，以及人ccr6核苷酸序列。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，seq id no：3)与ncbi登录号为nc_000083.7的第8473879至8474796位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，seq id no：4)与ncbi登录号为nc_000083.7的第8475901至8477196位核苷酸序列相同，人ccr6核苷酸序列(seq id no：5)与ncbi登录号为nm_031409.3的第569至1693位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠ccr6的mrna序列如seq id no：12所示，其表达的蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示。
228.鉴于人ccr6和鼠ccr6具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
229.靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。
230.靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgrna序列，各sgrna在ccr6基因上的靶序列如下：
231.sgrna1靶位点(seq id no：6)：5
’‑
ataatcatccgttccaaagtagg-3’232.sgrna2靶位点(seq id no：7)：5
’‑
caacaggtagacgtcagtcatgg-3’233.sgrna3靶位点(seq id no：8)：5
’‑
tgacgtctacctgttgaacatgg-3’234.sgrna4靶位点(seq id no：9)：5
’‑
tgtcctcaccctaccgttctggg-3’235.sgrna5靶位点(seq id no：10)：5
’‑
gagtaactgcccagaacggtagg-3’236.sgrna6靶位点(seq id no：11)：5
’‑
agtaactgcccagaacggtaggg-3’237.sgrna7靶位点(seq id no：13)：5
’‑
caataaacgcatacaacacgggg-3’238.sgrna8靶位点(seq id no：14)：5
’‑
acgcatacaacacggggttgagg-3’239.sgrna9靶位点(seq id no：15)：5
’‑
tccaataaacgcatacaacacgg-3’240.sgrna10靶位点(seq id no：16)：5
’‑
agaaagtcctcgcctacaccagg-3’241.sgrna11靶位点(seq id no：17)：5
’‑
cgatgcattatcattttcgacgg-3’242.利用uca试剂盒检测多个sgrna的活性，从结果可见sgrna具有不同活性，检测结果见表1和图4。从中选择sgrna6和sgrna7进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表2)，退火后将退火产物连接至pt7-sgrna质粒(质粒先用bbsi线性化)，获得表达载体pt7-ccr6-6和pt7-ccr6-7。
243.表1 sgrna活性检测结果
[0244][0245]
表2 sgrna6和sgrna7序列列表
[0246][0247][0248]
pt7-sgrna载体由质粒合成公司合成含有t7启动子及sgrna scaffold的片段dna(seq id no：26)并依次通过酶切(ecori及bamhi)连接至骨架载体(来源takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
[0249]
取小鼠的原核期受精卵，例如c57bl/6小鼠，利用显微注射仪将pt7-ccr6-6和pt7-ccr6-7质粒的体外转录产物(使用ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与cas9mrna预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯
·
纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(f0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的ccr6基因人源化小鼠品系。
[0250]
可通过常规检测方法(如pcr分析)鉴定f0代小鼠体细胞的基因型，使用5’端引物(l-gt-f/l-gt-r)检测结果和3’端引物(r-gt-f/r-gt-r)进行检测(pcr引物见表3)，部分f0代小鼠的鉴定结果见图5。结合5’端引物检测结果和3’端引物检测结果，经测序进一步验证图5中编号为f0-01、f0-03、f0-04的3只小鼠均为阳性小鼠。
[0251]
表3 pcr检测引物序列及重组片段大小
[0252][0253]
其中，引物l-gt-f位置位于5’同源臂左侧，r-gt-r位于3’同源臂右侧，l-gt-r、r-gt-f和mut-r均位于人ccr6序列上，引物wt-f和mut-f位置位于5’同源臂，wt-r位于小鼠2号外显子。
[0254]
将f0鉴定为阳性的ccr6基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到f1代小鼠。可使用表2中引物对wt-f/wt-r和mut-f/mut-r对f1代小鼠进行基因型鉴定，示例性检测结果见图6，显示编号为f1-06、f1-07、f1-08、f1-10、f1-11、f1-17、f1-21、f1-24和f1-25的9只小鼠为阳性小鼠。
[0255]
对f1代pcr鉴定为阳性的小鼠进行southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组dna，选用bcli酶或ncoi酶消化基因组，转膜，杂交。5’探针和3’探针分别位于5’同源臂上及3’同源臂外侧，具体探针及目的片段的长度见表4。southern blot检测结果见图7，综合3’探针和5’探针的结果表明，除f1-04、f1-17、f1-27、f1-29外，编号为f1-06、f1-07、f1-08、f1-10、f1-11、f1-21、f1-24、f1-25的8只小鼠均无随机插入，证实这8只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的ccr6基因人源化的基因工程小鼠。
[0256]
表4具体探针及目的片段的长度
[0257]
限制性内切酶探针野生型片段大小重组序列片段大小ecorv5’probe6.0kb2.7kbbglii3’probe4.3kb6.1kb
[0258]
探针合成引物如下：
[0259]5’
probe-f(seq id no：35)：5
’‑
cttatggccatttccgagtcacc-3’，
[0260]5’
probe-r(seq id no：36)：5
’‑
agaaagggaagtgggcagttcaa-3’；
[0261]3’
probe-f(seq id no：37)：5
’‑
gagtttgggaagaagaggcctgt-3’，
[0262]3’
probe-r(seq id no：38)：5
’‑
acctgttctgaatgtgggtgg-3’；
[0263]
可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人ccr6蛋白的表达情况，例如使用流式细胞术等。具体来说，分别选取6周龄野生型c57bl/6雌性小鼠和本实施例制备的ccr6基因人源化杂合子雄性小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏组织，制备脾脏单细胞悬液后，使用抗鼠cd45抗体brilliant violet 510
tm anti-mouse cd45、鼠t细胞特异性抗体percp/cy5.5 anti-mouse tcrβchain、抗鼠cd19抗体fitc anti-mouse cd19(mcd19)、抗鼠ccr6抗体apc anti-mouse cd196(ccr6)antibody或抗人ccr6抗体pe anti-human cd196(ccr6)antibody识别染色后进行流式检测。检测结果显示：c57bl/6野生型小鼠脾脏b细胞(特征为mcd45 mcd19 )中mccr6阳性细胞(特征为mc d45 mcd19 mccr6 )比例为14.3％，未检测到hccr6阳
性细胞；ccr6基因人源化杂合子小鼠脾脏b细胞中hccr6阳性细胞比例为7.67％(特征为mcd45 mcd19 hccr6 )，mccr6阳性细胞(特征为mcd45 mcd19 mccr6 )比例为5.4％。结果表明，在野生型c57bl/6小鼠体内只能检测到鼠ccr6蛋白，不能检测到人或人源化ccr6蛋白；在ccr6基因人源化杂合子小鼠体内既可以检测到鼠ccr6蛋白，也能检测到人ccr6蛋白。
[0264]
此外，由于cas9的切割造成基因组dna的双链断裂，通过染色体同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，可能得到ccr6蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物用于检测基因敲除小鼠，结果见图9，经测序进一步验证编号f0ko-01到f0ko-07的小鼠为ccr6基因敲除小鼠。引物分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，引物序列及重组片段大小如表5所示。
[0265]
表5 ccr6基因敲除鼠基因型鉴定pcr引物序列及重组片段大小
[0266][0267][0268]
将f1代鉴定为阳性的杂合小鼠相互交配，获得f2代ccr6基因人源化纯合子小鼠。可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化ccr6 mrna的表达情况，例如rt-pcr等。具体来说，分别取6周龄c57bl/6野生型小鼠和本实施例制得的ccr6基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取小鼠脾脏，按照trizol试剂盒说明书抽提细胞rna，反转录成cdna后进行rt-pcr检测(引物见表6)，检测结果如图8所示：在c57bl/6野生型小鼠体内仅检测到鼠ccr6 mrna，没有检测到人ccr6 mrna；仅在ccr6基因人源化纯合子小鼠体内检测到人ccr6 mrna。
[0269]
表6 rt-pcr引物名称及具体序列
[0270][0271]
与上述方法类似，进一步通过流式细胞术检测ccr6基因人源化纯合子小鼠体内ccr6蛋白的表达情况，检测结果显示：c57bl/6野生型小鼠脾脏b细胞(特征为mcd45 mcd19 )中mccr6阳性细胞(特征为mcd45 mcd19 mccr6 )比例为15.5％，未检测到hccr6阳性细胞；ccr6基因人源化纯合子小鼠脾脏b细胞中hccr6阳性细胞比例为14.1％(特征为mcd45 mcd19 hccr6 )，未检测到mccr6阳性细胞。结果表明，在野生型c57bl/6小鼠体内只能检测到鼠ccr6蛋白，不能检测到人或人源化ccr6蛋白；仅在ccr6基因人源化纯合子小鼠体内可以检测到人ccr6蛋白。
[0272]
实施例2双重人源化或多重双人源化小鼠的制备
[0273]
利用本方法或制得的ccr6基因人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有pd-1、pd-l1、il4、il4r、il6、il6r、il17、ccr4、ccr8等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化ccr6小鼠的基础上，利用分离小鼠es胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得ccr6与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的ccr6小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化ccr6与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人ccr6和其它基因调节剂的体内药效验证等。
[0274]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0275]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0276]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。