一种组合物及其应用的制作方法

1.本技术属于微生物发酵技术领域，更具体地说，它涉及一种组合物及其在毕赤酵母工程菌连续发酵工艺过程中的应用。


背景技术：

2.连续发酵过程是微生物培养到指数生长期时，在发酵罐中一方面以一定速度连续不断地流加新鲜液体培养基，经过充分搅拌被生产菌种利用后又以同样的速度连续不断地将发酵液排出，使发酵罐中微生物的生长和代谢保持旺盛的稳定状态。
3.在毕赤酵母发酵过程中，随着菌体不断的生长、传代，发酵液中湿重逐步提高（发酵结束时最高能至500g/l左右），越来越粘稠，同样的空气条件下，溶解氧（do）降低，加上各种代谢物质的积累，菌体生长环境变得恶劣起来。发酵后期，单位菌体分泌目的蛋白量逐渐降低。随着空气的排出也带走了大量的水分，就成了一个浓缩的过程，不但影响了菌种的蛋白表达也降低了设备的利用率，无形之中增加了生产成本。


技术实现要素：

4.为了提高连续发酵过程中菌株的生长和发酵，本技术提供一种组合物。在连续发酵过程中，该组合物能够促进菌株的生长和发酵。
5.本技术是通过以下方案实现的：本技术提供一种组合物，按照重量份计，包括如下组分：消泡剂0.5~1.5份，三磷酸腺苷0.08~0.5份，甘油10-20份，硫酸铵2-10份。
6.本技术通过长期的摸索，获得了一种组合物。在连续发酵过程中，流加该组合物能够有效降低泡沫，提高溶氧，存进菌体生长和代谢。
7.本技术另一方面提供上述组合物在毕赤酵母工程菌连续发酵工艺过程中的应用。
8.在本技术的一个具体实施方式中，所述毕赤酵母工程菌连续发酵工艺过程包括如下步骤：步骤1：将毕赤酵母工程菌种子液接种至发酵培养基进行培养至菌体湿重达到90g/l以上。优选地，菌体湿重达到90-110g/l；步骤2：流加含ptm1的葡萄糖溶液，调节流加速率使溶氧控制在20％以上，直至菌体湿重达到160g/l以上。优选地，菌体湿重达到160-180g/l；步骤3：流加含ptm1的葡萄糖溶液的同时，流加甲醇诱导外源蛋白表达，根据溶氧调节流加速率，保证溶氧控制在20％以上；步骤4：连续发酵，降低含ptm1的葡萄糖溶液的流加量，提高甲醇的流加量，开始收集发酵液；步骤5：停止流加含ptm1的葡萄糖溶液，再次提高甲醇的流加量，直至菌体湿重达到300g/l以上，优选地，菌体湿重达到300-360g/l；步骤6：流加甲醇的同时，补加权利要求1中所述的组合物，直至外源蛋白表达量不
达标。
9.在本技术的一个具体实施方式中，所述组合物先配制成溶液，所述溶液按照：每1l的水中加入消泡剂0.5~1.5g，三磷酸腺苷0.08~0.5g，甘油10-20g，硫酸铵2-10g进行配制。
10.在本技术的一个具体实施方式中，步骤6中，所述组合物的补加方式为：1-12h：19-22l/h/l，溶氧控制在25%以上，ph5.0-5.5；13-19h：39-42l/h/l，溶氧控制在20%以上，ph5.0-5.5；20-65h：50-53l/h/l，溶氧控制在10%以上，ph5.0-5.5；66h之后：60-62l/h/l，溶氧控制在10%以上，ph5.0-5.5。
11.在本技术的一个具体实施方式中，所述步骤1中，所述发酵培养基包括葡萄糖5%，磷酸二氢铵4%，硫酸镁1%，硫酸钾1%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸钙 0.1%，氢氧化钾 0.16%。
12.在本技术的一个具体实施方式中，所述步骤1培养时间为12-16h，培养过程中维持ph值4.8~5.0。
13.在本技术的一个具体实施方式中，所述步骤2中，葡萄糖溶液的浓度为20%~30%，ptm1的浓度为10~15ml/l。
14.在本技术的一个具体实施方式中，所述步骤2中，葡萄糖溶液的流加量为30~40ml/h/l，例如，葡萄糖溶液的流加量为30ml/h/l，32ml/h/l，34ml/h/l，36ml/h/l，38ml/h/l或40ml/h/l等。
15.在本技术的一个具体实施方式中，所述步骤2中，葡萄糖溶液的流加量为36ml/h/l。
16.在本技术的一个具体实施方式中，所述步骤2中培养时间为5~6h。
17.在本技术一个具体实施方式中，所述步骤3中，甲醇与葡萄糖溶液的体积比为1：（5~10）。例如，甲醇与葡萄糖溶液的体积比为1:5，1:6，1:7，1:8，1:9或1:10等。
18.在本技术一个具体实施方式中，所述步骤3中，甲醇与葡萄糖溶液的体积比为1:8。
19.在本技术一个具体实施方式中，所述步骤3中，葡萄糖的流加量为8ml/h/l。
20.在本技术一个具体实施方式中，所述步骤3中，甲醇的流加量为1ml/h/l。
21.在本技术一个具体实施方式中，所述步骤3的培养时间为3.5~4.5h。
22.在本技术一个具体实施方式中，所述步骤4中，甲醇与葡萄糖溶液的体积比为（3~5）:1，例如甲醇与葡萄糖溶液的体积比为3:1，4:1或5:1等。
23.在本技术一个具体实施方式中，所述步骤4中，甲醇与葡萄糖溶液的体积比为4:1。
24.在本技术的一个具体实施方式中，所述步骤4中，甲醇的流加量为1.0-1.5ml/h/l。例如，甲醇的流加量为1.0ml/h/l，1.1ml/h/l，1.2ml/h/l，1.3ml/h/l，1.4ml/h/l或1.5ml/h/l等。
25.在本技术的一个具体实施方式中，所述步骤5中，甲醇的流加量为2.6-4.0ml/h/l。
26.本技术提供的组合物至少具有以下有益效果之一：本技术提供的组合物，在连续发酵过程中，流加该组合物能够降低发酵液粘度，提高溶氧，改善菌体生长环境，从而提高目标产物的产率和设备的利用率。
附图说明
27.图1为本技术实施例中提供的毕赤酵母工程菌株发酵过程的流程图。
具体实施方式
28.除非另有定义，本技术中使用的所有技术和科学术语具有与本技术所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
29.下面将结合本技术实施例，对本技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
30.本技术提供的组合物按照重量份计，包括如下组分：消泡剂0.5~1.5份，三磷酸腺苷0.08~0.5份，甘油10-20份，硫酸铵2-10份。
31.上述组合物用于菌株发酵过程中时，将上述组合物配制成溶液，配制过程如下：按照每1l的自来水中加入消泡剂0.5~1.5g，三磷酸腺苷0.08~0.5g，甘油10-20g，硫酸铵2-10g混合均匀，配置后121℃，30min灭菌。
32.以下以毕赤酵母工程菌株的生长发酵过程为例说明上述组合物的作用。
33.发酵培养基：葡萄糖5%，磷酸二氢铵4%，硫酸镁1%，硫酸钾1%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸钙0.1%，氢氧化钾0.16%。
34.ptm1：硫酸铜0.6%，碘化钾0.009%，硫酸锰0.3%，钼酸钠0.02%，硼酸0.002%，氯化钴0.05%，氯化锌2%，硫酸亚铁6.5%，硫酸0.5%，生物素0.02%。
35.实施例组合物表1中提供了各个实施例中组合物的成分及含量。
36.表1 1l的水中各组合物的成分及含量组合物溶液的配制：以实施例4为例进行描述，具体过程如下：1l的水中加入消泡剂（本技术的各个实施例中选择的是陶氏df103，也可以选择ppe消泡剂）1.0g，三磷酸腺苷0.2g，甘油15g，硫酸铵5g混合均匀，配置后121℃，30min灭菌，备用。
37.其他实施例中的组合物溶液的制备过程同实施例4。
38.实施例7 生产植酸酶的毕赤酵母工程菌株发酵过程生产植酸酶的毕赤酵母工程菌株的发酵工艺过程如图1所示。本实施例以实施例4形成的组合物为例详细的描述组合物在生产植酸酶的毕赤酵母工程菌株发酵过程中的应
用，具体过程如下：
①
菌体培养阶段：采用65吨的发酵罐，按照10%的接种比例，将3吨种子液接种于30吨发酵培养基中，搅拌速度160rpm，通气量为3000-3300立方米/min，罐压0.05mp，30℃、ph5.0培养，期间测定菌体湿重达到100g/l左右，整个过程约14h。
39.②
碳源饲喂阶段：连续流加25%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1），流加量为36ml/h/l，溶氧控制在20%以上，期间测定菌体湿重达到170g/l左右，整个过程约5h。
40.③
葡萄糖-甲醇混合饲喂阶段：调整25%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1）的流加量为8ml/h/l，同时流加甲醇，甲醇的流加量为1ml/h/l，溶氧在20%以上，持续培养4h。
41.④
甲醇诱导阶段：调整25%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1）的流加量为0.4ml/h/l，甲醇的流加量为1.2ml/h/l，持续培养2h。
42.⑤
连续发酵阶段：停止流加含ptm1的葡萄糖溶液，调整甲醇的流加量为3.2ml/h/l，期间测定菌体湿重达到300g/l，整个过程约58h，期间观察发酵液的液面，发酵液的液面距离灌顶小于1m时，放料，开始收集发酵液，每次放料1000l。
43.⑥
补料阶段：流加实施例4中所制备的组合物溶液，继续收集发酵液，具体过程如下：1-12h：19l/h/l，溶氧控制在25%以上；13-19h：39l/h/l，溶氧控制在20%以上；20-65h：53l/h/l，溶氧控制在10%以上；66h之后：62l/h/l，溶氧控制在10%以上，直至外源蛋白表达量不达标（菌体老化，产酶明显减少）。
44.从开始收集发酵液起，每12小时取样检测发酵液中表达的酶的积累量。
45.对比例1对比例1与实施例7的区别在于，对比例1中无步骤
⑥
，发酵阶段持续进行直至外源蛋白表达量不达标。植酸酶的生产结果如表2所示。
46.表2
从表2可以看出，实施例7中，平均酶活为3183176.8u*t，平均体积为56.1t；而对比例1中平均酶活为2822475.2u*t，平均体积为51.9t，可见，相较于对比文件1，利用本实施例提供的工艺生产的植酸酶酶活提高了12.8%，放罐体积增加了8.1%。
47.实施例8 生产葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌株发酵过程生产葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌株的发酵工艺过程如图1所示。本实施例以实施例1形成的组合物为例详细的描述组合物在生产葡萄糖氧化酶的毕赤酵母工程菌株发酵过程中的应用，具体过程如下：
①
菌体培养阶段：采用65吨的发酵罐，按照10%的接种比例，将3吨种子液接种于30吨发酵培养基中，搅拌速度180rpm，通气量3000-3300立方米/min，罐压0.05mp，30℃、ph5.0培养，期间测定菌体湿重达到100g/l左右，整个过程约12h。
48.②
碳源饲喂阶段：连续流加30%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1），流加量为36ml/h/l，溶氧控制在20%以上，期间测定菌体湿重达到170g/l左右，整个过程约6h。
49.③
葡萄糖-甲醇混合饲喂阶段：调整30%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1）的流加
量为5ml/h/l，同时流加甲醇，甲醇的流加量为1ml/h/l，溶氧在20%以上，持续培养4h。
50.④
甲醇诱导阶段：调整30%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1）的流加量为0.3ml/h/l，甲醇的流加量为1.5ml/h/l，持续培养2h。
51.⑤
连续发酵阶段：停止流加含ptm1的葡萄糖溶液，调整甲醇的流加量为3.6ml/h/l，继续收集发酵液，期间测定菌体湿重达到340g/l，整个过程约58h，期间观察发酵液的液面，发酵液的液面距离灌顶小于1m时，放料开始收集发酵液，每次放料1200l。
52.⑥
补料阶段：流加实施例1中所制备的组合物溶液，继续收集发酵液，具体过程如下：1-12h：21l/h/l，溶氧控制在25%以上；13-19h：40l/h/l，溶氧控制在20%以上；20-65h：51l/h/l，溶氧控制在10%以上；66h之后：60l/h/l，溶氧控制在10%以上，直至外源蛋白表达量不达标。
53.从开始收集发酵液起，每12小时取样检测发酵液中表达的酶的积累量。
54.对比例2对比例2与实施例8的区别在于，对比例2中补料阶段流加不含葡萄糖的发酵培养基。葡萄糖氧化酶的生产结果如表3所示。
55.表3
从表3中可以看出，实施例8中，平均酶活为435614.3u*t，平均体积为56.3t；而对比例1中平均酶活为2822475.2u*t，平均体积为51.8t，可见，相较于对比文件1，利用本实施例提供的工艺生产的植酸酶酶活提高了10.9%，放罐体积增加了8.5%。
56.实施例9生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌株发酵过程生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌株的发酵工艺过程如图1所示。本实施例以实施例6形成的组合物为例详细的描述组合物在生产木聚糖酶的毕赤酵母工程菌株发酵过程中的应用，具体过程如下：
①
菌体培养阶段：采用65吨的发酵罐，按照10%的接种比例，将3吨种子液接种于30吨发酵培养基中，搅拌速度170rpm，通气量3000-3300，罐压0.05mp，30℃、ph5.0培养，期间测定菌体湿重达到100g/l左右，整个过程约13h。
57.②
菌体培养阶段：连续流加20%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1），流加量为36ml/h/l，溶氧控制在20%以上，期间测定菌体湿重达到170g/l左右，整个过程约6h。
58.③
葡萄糖-甲醇混合饲喂阶段：调整20%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1）的流加量为10ml/h/l，同时流加甲醇，甲醇的流加量为1ml/h/l，溶氧在20%以上，持续培养4h。
59.④
甲醇诱导阶段：调整20%葡萄糖溶液（每升中含12ml ptm1）的流加量为0.4ml/h/l，甲醇的流加量为1.5ml/h/l，持续培养2h。
60.⑤
连续发酵阶段：停止流加含ptm1的葡萄糖溶液，调整甲醇的流加量为4.0ml/h/l，继续收集发酵液，期间测定菌体湿重达到360g/l，整个过程约58h，期间观察发酵液的液面，发酵液的液面距离灌顶小于1m时，放料开始收集发酵液，每次放料1500l。
61.⑥
补料阶段：流加实施例6中所制备的组合物溶液，继续收集发酵液，具体过程如下：1-12h：22l/h/l，溶氧控制在25%以上；13-19h：42l/h/l，溶氧控制在20%以上；20-65h：50l/h/l，溶氧控制在10%以上；66h之后：61l/h/l，溶氧控制在10%以上，直至外源蛋白表达量不达标。
62.从开始收集发酵液起，每12小时取样检测发酵液中表达的酶的积累量。
63.对比例3对比例3与实施例9的区别在于，对比例3中补料阶段流加不含葡萄糖的发酵培养基。木聚糖酶的生产结果如表4所示。
64.表4
从表4中可以看出，实施例9中，平均酶活为9481753.1u*t，平均体积为55.8t；而对比例1中平均酶活为8414465.7u*t，平均体积为51.5t，可见，相较于对比文件1，利用本实施例提供的工艺生产的植酸酶酶活提高了12.7%，放罐体积增加了8.3%。
65.综上所述，利用本技术提供的组合物配方安全合理，成本低，无污染，使用方便且工艺简单易行，能够大大提高毕赤酵母工程菌株的发酵生产率和设备利用率降本增效，便于推广，适用于大规模生产。
66.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。