一种双回文DNAzyme纳米线传感器及其制备方法与应用与流程

一种双回文dnazyme纳米线传感器及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种dnazyme纳米传感器的技术领域，更具体的是涉及一种双回文dnazyme纳米线传感器及其制备方法与应用。


背景技术：

2.水体中重金属自然本底含量不具备明显危害，但随着城体扩容和工业化进程加快，大量工业废水及生活污水排入水体，重金属尤其是可溶态重金属进入水体后通过饮水、生物富集以及食物链等方式对水体中的生物产生一系列毒害效应，并最终危害人体健康。重金属是一种很危险的污染物，往往长期积累在生物体内不可降解，在极其微量的情况下也会产生不良后果。各种生态系统都不同程度地受到重金属的影响。重金属通过食物链沉积到人体中，可引起多种疾病甚至癌症，危害还可能遗传到下一代。
3.针对重金属离子污染，一系列重金属离子响应分析方法得到发展，包括原子吸收光谱法(aas)、氢化物发生-原子荧光光谱法(hg-afs)、电感耦合等离子体发射光谱法(icp-oes)和电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)。这些方法检测结果准确、可靠，是常用的重金属检测标准方法。然而，由于仪器昂贵、技术人员专业、操作费时繁琐，还远远不能满足公众对重金属离子测定的需求。
4.为了应对这一挑战，研究人员利用了具有rna裂解特性的dnazymes，这是一种由一条酶链和一条底物链组成的通过selex程序分离出来的催化dna序列。 dnazymes的合成便宜且容易，没有批次间的差异。特定金属离子如zn
2
、pb
2
、 mg
2
、cu
2
和cd
2
的存在可以切割嵌入底物链中的单个rna碱基。结合可编程性、设计灵活性、合成简单性以及对金属离子的高亲和力和特异性的特性，脱氧核糖核酸酶已被确定为用于构建金属离子生物传感器的有前景的候选者。目前，设计基于rna切割活性的dnazyme的传感系统最流行的方法是通过标记具有 fret效应的外源荧光团/猝灭剂(f/q)对来响应分析物。代表性案例包括将f/q 对放置在底物的两端，在切割位点两侧的切割位点旁边标记f/q对，将f和q放置在同一侧但不同的链上，甚至引入两个q/一个f的标记模式。目标分析物(也称为催化辅助因子)的存在会激活酶链，将底物链切割成两部分，从而释放f 并在底物切割后恢复信号。但在某些情况下，仅仅靠合理地安排f/q对以减少 dnazyme的背景不够满足目标信号传导，因为在这些情况下背景抑制是有限的。通常需要与其他信号转导策略(例如，使用酶的核酸等温扩增)组合以提高其检测性能，但会因此带来高成本和操作复杂性的问题。


技术实现要素：

5.为解决现有技术的不足，现提供一种双回文dnazyme纳米线传感器及其制备方法与应用。
6.一种双回文dnazyme纳米线传感器，所述双回文dnazyme纳米线传感器由若干个双回文dnazyme纳米线单体在回文序列作用下通过回文序列的倒置读性组装形成，在形成的过程中产生了荧光猝灭域，荧光猝灭域能够极大的降低体系的固有荧光背景；所述荧光猝
灭域的位置位于两个双回文dnazyme 纳米线单体分子之间；
7.所述双回文dnazyme纳米线单体包括双回文酶链和底物链；
8.荧光基团标记于底物链，猝灭基团标记于双回文酶链；
9.双回文酶链的5’端和3’端各连接有一段回文序列；
10.优选地，双回文酶链两端的回文序列的碱基数不少于10nt；双回文酶链两端的回文序列中的碱基序列不同。
11.一种双回文dnazyme纳米线传感器的制备方法，在pcr管中加入底物链、双回文酶链、hepes缓冲液，混合均匀后在90～100℃下加热变性，以恒定的降温速率降温至25℃，保持25℃条件30min，使得形成的双回文dnazyme 纳米线结构更加的稳定。
12.优选地，所述双回文酶链的浓度为1～5μmol/l。
13.优选地，恒定的降温速率为1min降低1℃。
14.一种双回文dnazyme纳米线传感器在重金属检测中的应用，包括以下步骤：
15.s1:制备双回文dnazyme纳米线传感器：通过双回文dnazyme纳米线单体形成双回文dnazyme纳米线传感器，双回文dnazyme纳米线单体的 dnazyme序列由待检测重金属酶链序列所确定；
16.s2:构建检测样本库：向制备好的dnazyme纳米线传感器中加入重金属离子、hepes缓冲液，混合均匀后在30～40℃下孵育30min～60min；
17.s3:检测荧光信号：向s2孵育完成的产物中加入溶剂，混合均匀后转移至比色皿中进行荧光检测；
18.s4：建立不同浓度的重金属离子样品检测标准曲线；
19.s5：对实际样品进行定量检测：将未知浓度的重金属离子作为检测目标，通过s1、s2、s3进行荧光信号检测，将得到的荧光信号代入s4建立的标准曲线中，计算出实际样品中重金属离子的浓度。
20.优选地，所述s3荧光检测的参数为：
21.激发和发射狭缝宽度设置为10nm；
22.pmt探测器电压设置为650v；
23.荧光基团的激发波长为490nm，发射波长的收集范围为500nm～650nm。
24.优选地，所述s4建立不同浓度的重金属离子样品检测标准曲线的具体步骤为：在s2中加入不同浓度的同种重金属离子，反应后通过s3检测荧光信号，以不同浓度的重金属离子为横坐标，以输出的荧光信号为纵坐标，建立不同浓度的重金属离子样品检测的标准曲线。
25.有益效果：
26.(1)本发明提供的一种双回文dnazyme纳米线传感器在重金属检测中的应用，与原子吸收光谱法、氢化物发生-原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法和电感耦合等离子体质谱法相比，本发明提供的检测方法结果输出及时、操作方法简单、灵活、灵敏、定量、易用、成本低廉。
27.(2)与现有的基于rna切割活性的dnazyme的传感系统相比，本发明通过将回文序列嫁接到普通寡糖核苷酸探针上，只需一个探针即可轻松实现分子间核酸杂交，同时双回文dnazyme纳米线传感器可以通过回文诱导的荧光共淬灭效应和底物链的特异性切割来灵
敏、一步检测重金属离子。
28.(3)双回文dnazyme纳米线传感器具有独特的纳米结构极大地促进了背景降低和信噪比的提高，对于构建任何分析方法都具有重要的意义。
29.(4)双回文链式反应首次被引入到简单的工程化dna纳米组装中，这一特性最大限度地保持了只有两种寡核苷酸的组装简易性，且不牺牲普通dnazyme的识别能力。
30.(5)双回文链式反应模式可做为一种基于双回文dnazyme纳米线传感器的金属离子传感检测平台。其基本规则是在一个普通dnazyme单体的两侧嫁接一个不同的回文，并将m
n
的活性中心替换为其他相应的重金属离子的活性中心。
附图说明
31.图1是实施例中重金属离子检测可行性的凝胶电泳图。
32.图2是实施例中重金属离子检测可行性的荧光信号图。
33.图3是实施例中不同浓度重金属离子的荧光光谱图。
34.图4是实施例中不同浓度重金属离子的标准曲线图。
35.图5是实施例中双回文dnazyme纳米线传感器检测的原理图。
36.图6是实施例中荧光基团f和猝灭基团q在dnazyme上不同标记方式示意图。
具体实施方式
37.为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
38.为了解决饮用水和环境水中重金属离子的灵敏和准确检测等问题，本发明提供了一种基于双回文链式反应和荧光猝灭域的双回文dnazyme纳米线传感器及其在重金属离子检测中的应用。
39.当复合样品中有目标物重金属离子存在时，先通过双回文链式反应制备双回文dnazyme纳米线传感器，然后将双回文dnazyme纳米线传感器和含有目标物的复合样品混合均匀，当有所检测的目标重金属离子时，双回文 dnazyme纳米线传感器会被激活使dnazyme具有切割活性，荧光片段会被切割掉落脱离双回文dnazyme纳米线传感器，使用荧光分光光度计检测传感体系的荧光，体系中的重金属离子含量与所检测到的荧光信号大小呈正比，从而可以实现重金属离子的定量检测。以下提供来自自来水和湖水中铜离子的检测：
40.实施例1
41.对加标自来水中的铜离子进行检测(铜离子浓度为50nmol/l)，具体步骤如下：
42.s1、双回文dnazyme纳米线传感器的制备：
43.在pcr管中加入2μl,10μm的底物链、2μl,10μm的双回文酶链和6μl的 hepes缓冲液，混合均匀后在95℃加热变性5min，然后以1min降低1℃的降温速率降温至25℃，在25℃恒温保持30min，使得形成的双回文dnazyme 纳米线结构更加的稳定，然后在4℃储存备用。
44.s2、双回文dnazyme纳米线传感器检测铜离子的可行性步骤：
45.20μl的铜离子检测体系中包含10μl双回文dnazyme纳米线结构混合液， 2.5μl含加标铜离子的自来水复合样本，7.5μl的hepes缓冲液，混合均匀后在37℃下孵育40min。
46.s3、荧光信号的检测：
47.铜离子激活双回文dnazyme纳米线的切割活性后，dnazyme的底物链被切割，而后一段荧光碎片脱离dnazyme纳米线，此时荧光恢复，使用荧光分光光度计检测体系中的荧光信号；
48.荧光检测参数为：
49.激发和发射狭缝宽度设置为10nm；pmt探测器电压设置为650v；荧光基团的激发波长为490nm，发射波长的收集范围为500nm～650nm。
50.在25μl反应产物中加入90μl双蒸水，混合均匀后转移至微量比色皿中进行荧光测量。
51.s4、建立标准曲线：
52.在s2中加入不同浓度的铜离子，铜离子的浓度分别为:
53.0.1，1，5，10，20，40，60，80，100，150，200，250，300和350nmol/l；
54.反应过后通过s3进行荧光检测，记录不同浓度的铜离子，以不同浓度的铜离子为横坐标，以荧光输出的信号值为纵坐标，建立不同浓度的铜离子样品检测的标准曲线；
55.通过实验，建立的标准曲线为：
56.f
519
＝2.72(c
cu2
/nm) 62.96；
57.相关系数r2＝0.9978。
58.s5、对实际样品进行定量检测：
59.将加标铜离子的自来水实际样品作为检测目标，通过s1、s2、s3的处理方法进行荧光检测，所得荧光检测数值为198.67a.u.，将检测到的荧光数值代入到s4建立的铜离子样品检测的标准曲线中，计算得到加标实际样品中铜离子浓度为49.8929nmol/l，铜离子的回收率为99.76％，相对标准偏差rsd为 4.26％。
60.实施例2
61.对加标湖水中的铜离子进行检测(铜离子浓度为50nmol/l)，具体步骤如下：
62.s1、双回文dnazyme纳米线传感器的制备：
63.在pcr管中加入2μl,10μm的底物链、2μl,10μm的双回文酶链和6μl的 hepes缓冲液，混合均匀后在95℃加热变性5min，然后以1min降低1℃的降温速率降温至25℃，在25℃恒温保持30min，使得形成的双回文dnazyme 纳米线结构更加的稳定，然后在4℃储存备用。
64.s2、双回文dnazyme纳米线传感器检测铜离子的可行性步骤：
65.20μl的铜离子检测体系中包含10μl双回文dnazyme纳米线结构混合液， 2.5μl含加标铜离子的自来水复合样本，7.5μl的hepes缓冲液，混合均匀后在37℃下孵育40min。
66.s3、荧光信号的检测：
67.铜离子激活双回文dnazyme纳米线的切割活性后，dnazyme的底物链被切割，而后一段荧光碎片脱离dnazyme纳米线，此时荧光恢复，使用荧光分光光度计检测体系中的荧光信号；
68.荧光检测参数为：
69.激发和发射狭缝宽度设置为10nm；pmt探测器电压设置为650v；荧光基团的激发波长为490nm，发射波长的收集范围为500nm～650nm。
70.在25μl反应产物中加入90μl双蒸水，混合均匀后转移至微量比色皿中进行荧光测量。
71.s4、建立标准曲线：
72.在s2中加入不同浓度的铜离子，铜离子的浓度分别为:
73.0.1，1，5，10，20，40，60，80，100，150，200，250，300和350nmol/l；
74.反应过后通过s3进行荧光检测，记录不同浓度的铜离子，以不同浓度的铜离子为横坐标，以荧光输出的信号值为纵坐标，建立不同浓度的铜离子样品检测的标准曲线；
75.通过实验，建立的标准曲线为：
76.f
519
＝2.72(c
cu2
/nm) 62.96；
77.相关系数r2＝0.9978。
78.s5、对实际样品进行定量检测：
79.将加标铜离子的自来水实际样品作为检测目标，通过s1、s2、s3的处理方法进行荧光检测，所得荧光检测数值为76.60a.u.，将检测到的荧光数值代入到s4建立的铜离子样品检测的标准曲线中，计算得到加标实际样品中铜离子浓度为5.0139nmol/l，铜离子的回收率为100.28％，相对标准偏差rsd为 5.67％。
80.作为进一步改进，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。