一种新的小鼠视觉诱发电位记录方法与流程

evoked potentials.j neurosci methods.325,108316.
9.makowiecki,k.,garrett,a.,clark,v.,graham,s.l.,rodger,j.,2015.reliability ofvep recordings using chronically implanted screw electrodes inmice.transl vis sci technol.4(2),15.
10.marenna,s.,castoldi,v.,d'isa,r.,marco,c.,comi,g.,leocani,l.,2019.semi-invasive and non-invasive recording ofvisual evokedpotentials in mice.doc ophthalmol.138(3),169-179.
11.ridder,w.h.,3rd,nusinowitz,s.,2006.the visual evoked potential in the mouse
‑‑
origins and response characteristics.visionres.46(6-7),902-913.
12.robson,a.g.,nilsson,j.,li,s.,jalali,s.,fulton,a.b.,tormene,a.p.,holder,g.e.,brodie,s.e.,2018.iscev guide to visual electrodiagnostic procedures.doc ophthalmol.136(1),1-26.
13.tomiyama,y.,fujita,k.,nishiguchi,k.m.,tokashiki,n.,daigaku,r.,tabata,k.,sugano,e.,tomita,h.,nakazawa,t.,2016.measurement ofelectroretinograms and visually evoked potentials in awake movingmice.plos one.11(6),e0156927.
14.young,b.,eggenberger,e.,kaufman,d.,2012.current electrophysiology in ophthalmology:a review.curr opin ophthalmol.23(6),497-505.


技术实现要素：

15.针对目前现有的记录小鼠vep方法的不足：包括记录到的振幅小以及易损伤脑组织，本发明的目的是建立一种新的、微创的、可靠的小鼠视觉诱发电位记录方法。
16.本发明的小鼠视觉诱发电位记录方法，包括以下步骤：
17.将小鼠做好视觉诱发电位记录前处理，在黑暗条件下，用celeris小动物视觉电生理检测系统采用侵入法对小鼠进行记录，具体操作如下：
18.将接地电极插入尾巴的皮下、参考电极插入鼻子的皮下，接地电极和参考电极的阻抗均维持在1.5-2kω，将两个带集成刺激器的角膜电极置于湿润的角膜表面；将头顶部的毛剃掉，用手术刀将皮肤切开一个口，露出头顶部矢状线和人字缝，然后将活性电极插入矢状线与人字缝的交点，活性电极与头顶部的水平夹角为30
°
～45
°
，进针5-6mm深度，活性电极阻抗维持在1.5～2kω之间；其他参数设置如下：通过角膜刺激器向左右每只眼睛分别给予100次1hz、0.05cd.s/m2的闪光刺激，以2000hz的采样频率记录300ms；低、高滤波通频带截止分别设置为1.25hz和100hz。
19.优选，所述的视觉诱发电位记录前处理，是在进行视觉诱发电位记录前，将小鼠在不透光的暗室中进行8小时以上暗适应，然后麻醉小鼠，0.5％托品酰胺滴眼液扩瞳5分钟。
20.优选，所述的麻醉小鼠是使用小腿肌肉注射盐酸塞拉嗪和腹腔注射戊巴比妥钠的联合方法麻醉小鼠，其中，盐酸塞拉嗪的注射量为25～30mg/kg，戊巴比妥钠的注射量为50～70mg/kg。
21.优选，所述的小鼠为3月龄的小鼠。
22.优选，在整个记录过程中，小鼠被放置在检测设备自带的加热平台(恒温37℃)上保持体温，用1％-2％羟丙基甲基纤维素溶液保持角膜湿润。
23.本发明还提供所述的小鼠视觉诱发电位记录方法在检测视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,rgc)数量减少、功能障碍和/或与大脑连接障碍的视觉反应中的应用。
24.本发明建立了一种新的、微创的小鼠视觉诱发电位记录方法(侵入方法，inv)，并与现有的皮下方法(sub)进行了一系列比较。数据表明本发明建立的侵入方法(ivn)是可靠的，可以记录波形好、振幅大的vep，提示vep受活性电极位置影响较大。在视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,rgc)缺失的c57或cd1视神经夹伤(optic nerve crush,onc)模型小鼠以及brn3b
ap/ap
突变小鼠中，vep振幅显著降低。
25.本发明新建立的小鼠视觉诱发电位记录方法非常可靠和稳定，尤其适用于检测rgc数量减少、功能障碍或与大脑连接障碍的视觉反应。
26.本发明建立的小鼠视觉诱发电位记录方法——侵入方法(inv)与现有的皮下方法(sub)相比，可记录到相对稳定、波形良好、波幅更大的vep。与颅骨预植入螺钉记录方法相比，可减少预植入螺钉对小鼠脑组织的损伤。
附图说明
27.图1是电极位置和vep波形信号示意图；图a、图b分别为皮下记录方法(sub)的顶部和侧面图；图中标注的数字分别对应为：1、鼻子部位参考电极；2、尾巴部位接地电极；3、活性电极；图c、图d分别为侵入记录方法(inv)的顶部和侧面图；将活性电极插入矢状线和人字缝的交点，活性电极与头顶部的水平夹角为30
°
～45
°
，活性电极阻抗保持在1.5-2kω；图e为inv中活性电极位置示意图，圆圈标出的是活性电极插入位置；图f为vep代表波形图，参数如图所示：n1幅值(amplitude)指从基线到最显著的负向波峰的值，p1幅值指从最显著的负向波峰到第一个正向波峰之间的值；潜伏期(latency)定义为从刺激开始到n1、p1出现的时间；l.n1表示n1潜伏期；l.p1表示p1潜伏期。
28.图2是sub和inv两种方法记录c57小鼠在不同光强刺激下的vep反应；对两种方法记录到vep的n1振幅进行定量和比较，可观察到n1振幅随刺激光强的增加而增加，在0.1cd.s/m2左右达到顶峰；同时，inv组n1振幅显著高于sub组的n1振幅；sub组：n＝5；inv组：n＝4，统计学意义：***p《0.001。
29.图3是sub和inv两种方法记录c57小鼠vep差别；图a、图b分别为两种方法在白天记录到的c57小鼠vep波形，n为每组小鼠数量，每组5只；图c、图d对应为两种方法在白天记录到的c57小鼠vep的n1和p1幅值以及潜伏期的定量比较；图e、图f分别为两种方法在晚上记录到的c57小鼠vep波形，每组5只；图g、图h对应为两种方法在晚上记录到的c57小鼠vep的n1和p1幅值以及潜伏期的定量比较；图a、b、e、f中的灰色虚线代表所有小鼠vep的记录曲线，黑色实线代表所有记录的平均值曲线；统计学意义：*p《0.05；***p《0.001。
30.图4是sub和inv两种方法记录cd1小鼠vep差别；图a、图b分别为两种方法在白天记录到的cd1小鼠vep波形，n为每组小鼠数量，每组5只；图c、图d对应为两种方法在白天记录到的cd1小鼠vep的n1和p1幅值以及潜伏期的定量比较；图e、图f分别为两种方法在晚上记录到的cd1小鼠vep波形，每组5只；图g、图h对应为两种方法在晚上记录到的cd1小鼠vep的n1和p1幅值以及潜伏期的定量比较；图a、图b、图e、图f中的灰色虚线代表所有小鼠vep的记录曲线，黑色实线代表所有记录的平均值曲线；统计学意义：*p《0.05；***p《0.001。
31.图5是使用sub和inv方法记录同一只动物的vep；图a为在同一只c57小鼠中，先用sub方法记录vep，然后用inv方法记录vep；小鼠数量n＝3；图b、图c分别为同一只c57小鼠sub和inv两种方法记录vep的n1和p1幅度或潜伏期的定量和比较；图a中的灰色虚线代表所有小鼠vep的记录曲线，黑色虚线代表sub方法所有记录的平均值曲线，黑色实线代表inv方法所有记录的平均值曲线；统计学意义：**p《0.01；***p《0.001。
32.图6是使用inv方法记录brn3b
ap/ap
小鼠、c57和cd1视神经夹伤(onc)模型小鼠的vep；图a为使用inv方法记录的野生型(wt)小鼠和brn3b
ap/ap
小鼠的vep波形，灰色虚线代表所有小鼠vep的记录曲线，黑色实线和黑色虚线分别代表wt和brn3b
ap/ap
小鼠记录的平均值曲线，n为每组小鼠数量，每组n＝5；图b、图c分别为使用inv方法记录的wt与brn3b
ap/ap
小鼠的vep的n1、p1波幅及潜伏期比较；图d为使用inv方法记录到的c57视神经夹伤(onc)模型小鼠vep波形，c57小鼠左侧视神经被夹伤，右侧视神经不做手术，小鼠数量n＝4；图e、图f分别为使用inv方法记录的c57视神经夹伤(onc)模型小鼠右眼(re)和左眼(le)vep振幅或潜伏期的比较；图g为使用inv方法记录到的cd1视神经夹伤(onc)模型小鼠vep波形，cd1小鼠左侧视神经被夹伤，右侧视神经不做手术，小鼠数量n＝5；图h、图i使用inv方法记录的cd1视神经夹伤(onc)模型小鼠右眼(re)和左眼(le)vep振幅或潜伏期的比较，onc：视神经夹伤；图d和图g中的灰色虚线代表所有小鼠vep的记录曲线，黑色实线和黑色虚线分别代表左眼(le)和右眼(re)记录的平均值曲线；统计学意义：*p《0.05；***p《0.001。
具体实施方式
33.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
34.实施例1
35.所有小鼠实验均按照iacuc(institutional animal care and use committee)标准进行，并经中山大学和中山眼科中心批准。c57bl/6和cd1(cd-1,ham/icr)小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。brn3b
ap/ap
突变小鼠是一种rgc损伤小鼠，采用标准pcr程序测定小鼠基因型。约3个月大的小鼠用于记录vep。在进行vep记录之前，每组小鼠在不透光的暗室中进行8小时以上暗适应。白天测试时间为8：00～13：00，晚上测试时间为18：00～23：00。为了保持不同组别小鼠相同的暗适应时间，白天记录的暗适应时间从前一天20：00开始，夜间记录的暗适应时间从白天8：00开始。使用小腿肌肉注射盐酸塞拉嗪(25～30mg/kg)和腹腔注射戊巴比妥钠(50～70mg/kg)的联合方法麻醉小鼠，0.5％托品酰胺滴眼液扩瞳5分钟。使用celeris小动物视觉电生理检测系统(厂家：diagnosys，型号：d430，供应商名称：武汉视博医疗器械有限责任公司)记录小鼠vep。整个记录过程都保持黑暗条件，检测设备自带的安全灯[red(670nm)and infrared(940nm)]leds】用于照明。小鼠被放置在检测设备自带的加热平台(恒温37℃)上保持体温，用1-2％羟丙基甲基纤维素溶液保持角膜湿润。
[0036]
在所有的记录中，接地电极和参考电极分别插入尾巴和鼻子的皮下(图1a-d)，两种电极的阻抗均维持在1.5-2kω。将两个带集成刺激器的角膜电极置于湿润的角膜表面。对于皮下方法(sub，参照文献marenna et al.,2019和ridder and nusinowitz,2006中的皮下方法)，将活性电极插入头部中线视觉皮层位置的皮下，以两耳中点为参照(图1a,b)，皮下活性电极的阻抗维持在1.5-2kω之间。对于侵入方法(inv)，将小鼠头顶部的毛剃掉，
用手术刀将皮肤切开一个口，露出头顶部矢状线和人字缝。然后将活性电极插入矢状线与人字缝的交点，活性电极与头顶部的水平夹角约为30
°
～45
°
，缓慢进针约5-6mm深度(图1c-e)，在此深度的活性电极阻抗维持在1.5～2kω之间。首先在0.001、0.01、0.05、0.1、1cd.s/m2的光强刺激范围内使用sub和inv两种方法进行vep记录(图1f)，根据实验结果(图2)，0.05cd.s/m2可获得较大vep波幅，此时vep反应并未达到平台期，因此我们选取0.05cd.s/m2强度用于后续实验。其他参数设置如下：通过角膜刺激器向左右每只眼睛分别给予100次1hz、0.05cd.s/m2的闪光刺激，以2000hz的采样频率记录300ms。对于每只老鼠，我们进行了5次记录。vep的低、高滤波通频带截止分别设置为1.25hz和100hz。
[0037]
使用上述的皮下方法(sub)和侵入方法(inv)两种方法记录c57小鼠vep差别对比结果如图3所示，在白天记录vep，与sub方法相比，inv方法记录到的vep波形质量更好；inv记录的n1和p1振幅(n1,47
±
2μv；p1:70
±
4μv)比sub记录的两者振幅(n1,19
±
1μv；p1,25
±
1μv)分别明显增加247.4％和280.0％；inv记录的n1和p1潜伏期(n1,41
±
1ms；p1,61
±
1ms)比sub记录的两者潜伏期(n1,46
±
1ms；p1,79
±
1ms)分别显著缩短10.9％和22.8％(图3a-d)。与白天记录得到的结果一致，在晚上使用两种方法记录vep，inv仍然是更好的检测方法。在晚上，inv记录的n1和p1振幅(n1:76
±
5μv；p1:109
±
8μv)比sub记录的两者振幅(n1:19
±
1μv；p1:23
±
2μv)分别显著增加300％和473.9％；同时，晚上inv记录的p1潜伏期显著缩短13.3％(inv:n1,45
±
2ms；p1,65
±
2ms；sub:n1,48
±
2ms；p1,75
±
3ms)(图3e-h)。这些结果表明，无论在白天还是晚上，inv都是一种有效的检测vep的方法。
[0038]
使用上述的皮下方法(sub)和侵入方法(inv)两种方法记录cd1小鼠vep差别对比结果如图4所示，在cd1小鼠中，无论是白天还是晚上记录vep，inv记录到的波形图都优于sub，并且n1和p1振幅明显增加[sub at day(n1:17
±
2μv；p1:20
±
2μv)；inv at day(n1:64
±
5μv；p1:92
±
5μv)；sub at night(n1:17
±
2μv；p1:19
±
3μv)；inv at night(n1:55
±
3μv；p1:74
±
4μv)].，这与在c57小鼠中得到的结论是一致的；相较于sub，inv记录的vep的潜伏期明显缩短，除了晚上n1潜伏期。这些结果进一步表明inv可有效记录小鼠的vep。
[0039]
使用上述的皮下方法(sub)和侵入方法(inv)两种方法记录同一只c57小鼠的vep结果如图5所示。为了排除小鼠自身的影响，我们在同一组小鼠中先使用sub记录再使用inv记录vep。结果显示，inv记录的n1和p1的振幅显著大于sub，且inv记录的潜伏期缩短，这与不同组小鼠得出的结论一致。
[0040]
使用上述的侵入方法(inv)记录brn3b
ap/ap
小鼠、c57和cd1视神经夹伤(onc)模型小鼠的vep结果如图6所示。在brn3b
ap/ap
小鼠中，视网膜rgcs缺失约70％；使用inv记录brn3b
ap/ap
小鼠vep；结果显示，与野生型小鼠的n1和p1振幅(n1:76
±
5μv；p1:109
±
8μv)相比，brn3b
ap/ap
小鼠的n1和p1振幅(n1:21
±
1μv；p1:31
±
1μv)分别显著降低72.4％和71.6％；n1和p1的潜伏期分别显著延长11.1％和9.2％(野生型：n1,45
±
2ms,p1,65
±
2ms；brn3b
ap/ap
:n1:50
±
1ms,p1:71
±
1ms)(图6a-c)。使用inv检测左侧视神经夹伤14天的c57和cd1小鼠vep，结果显示，c57和cd1小鼠的左眼vep几乎消失；与未进行视神经夹伤手术的右眼相比，n1和p1振幅均降低90％以上(图6d-i)。这些结果表明inv能够可靠地、有效地评估视觉损伤小鼠的视觉电生理学。