基于计算机视觉高通量筛选微生物的方法及存储介质

1.本发明涉及微生物筛选技术领域，尤其涉及一种基于计算机视觉高通量筛选微生物的方法及存储介质。


背景技术：

2.常用的快速筛选微生物技术主要包括：螺旋平板计数法、滤膜法、纸片法，以及artp法、电化学法、颜色变化、流式细胞技术、激光扫描技术、热量法和放射测量法，还有在基因芯片基础上的微流控技术，但是这些快速检测微生物的技术绝大部分所需要的仪器和试剂相对精细且昂贵，操作人员需要经过专业的培训并具有扎实的生物学基础知识。
3.常用的提高筛选通量的主要方法就是采用微孔板筛选技术。然而微孔板筛选技术仍旧面临很多挑战，如：从传统的高容量摇瓶培养转换到只有几毫升甚至微升级的微孔板培养，菌体生长代谢及产物合成会受到巨大的影响，此外还包括微孔中氧传递效果，物料混合，培养过程的蒸发量，交叉污染等等。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种基于计算机视觉高通量筛选微生物的方法及存储介质，能够有效解决在现有技术方案中庆大霉素高产菌株筛选效率低的问题。
5.根据本发明的一方面，提供一种基于计算机视觉高通量筛选微生物的方法，所述方法包括：获取预处理后的微生物菌落的图像信息；从所述图像信息中提取图像特征；基于所述图像特征建立生物菌落筛选模型；以及根据所述生物菌落筛选模型从待检生物菌落集合中筛选出目标特征符合预设要求的生物菌落。
6.进一步地，所述获取预处理后微生物菌落的图像信息包括：获取多个孔板上生物菌落的多个子图像，并确定每一个孔板对应的子图像的位置参数，其中所述多个孔板设置在孔板组件上；识别每一个子图像的目标轮廓；以及将全部所述子图像的目标轮廓及其所确定的区域作为微生物菌落的所述图像信息。
7.进一步地，所述对所述图像信息提取图像特征包括：在所述目标轮廓所确定的区域中选择一个预设大小的识别区域；针对每一所述识别区域，计算该识别区域内与所述目标特征相关联的至少一个特征参数，并将计算出的全部特征参数作为所述图像特征。
8.进一步地，所述图像特征包括下列中的一个或多个：红蓝绿子像素的亮度值、色调、饱和度、lab色彩模式下的青色占比、洋红色占比、黄色占比、黑色占比、以及微生物菌落发酵天数。
9.进一步地，所述根据所述图像特征建立生物菌落筛选模型包括：获取至少一个孔板组件的至少一个时刻的图像信息；将所述图像信息划分成训练参数合集和校验合集；基于所述训练参数合集采用预设的建模算法建立回归模型；基于所述校验合集对全部回归模型进行校验，并将准确率最高的回归模型作为所述筛选模型。
10.进一步地，采用比色法建立所述回归模型。
11.进一步地，所述微生物菌落为小单孢菌属，所述比色法包括快速检测小单孢菌属产生的庆大霉素的效价。
12.进一步地，所述目标特征包括产物产量、副产物产量、菌体量、营养缺陷型中的一个或多个。
13.进一步地，所述获取多个孔板上生物菌落的多个子图像包括：在封闭的场景中设置固定光源；在孔板组件的正上方设置成像系统，并使所述成像系统、所述固定光源及所述孔板组件在高度方向上对齐；驱使所述成像系统采集并生成所述子图像。
14.根据本发明的另一方面，提供了一种存储介质，所述存储介质中存储有多条指令，所述指令适于由处理器加载以执行前述任一所述的基于计算机视觉高通量筛选微生物的方法。
15.本发明的优点在于，通过比色法在封闭的场景中获取多个孔板上生物菌落的多个子图像，并确定每一个孔板对应的子图像的位置参数。对所述图像信息提取图像特征，根据所述图像特征建立生物菌落的筛选模型，且根据所述生物菌落的筛选模型获取目标特征符合预设要求的生物菌落。从而实现高效率的筛选。
附图说明
16.下面结合附图，通过对本发明的具体实施方式详细描述，将使本发明的技术方案及其它有益效果显而易见。
17.图1为本发明实施例提供的一种基于计算机视觉高通量筛选微生物的方法的步骤流程图。
18.图2为本发明实施例提供的步骤s110的子步骤流程图。
19.图3为本发明实施例提供的步骤s120的子步骤流程图。
20.图4为本发明实施例提供的步骤s130的子步骤流程图。
21.图5为本发明实施例提供的检测结果图。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.现在参阅图1，图1为本发明实施例提供的基于计算机视觉高通量筛选微生物的方法。如图1所示，
24.步骤s110：获取预处理后的微生物菌落的图像信息。
25.步骤s120：从所述图像信息中提取图像特征。
26.步骤s130：基于所述图像特征建立生物菌落筛选模型。
27.步骤s140：根据所述生物菌落筛选模型从待检生物菌落集合中筛选出目标特征符合预设要求的生物菌落。
28.在一些实施例中，步骤s110包括如下步骤：
29.步骤s210：获取多个孔板上生物菌落的多个子图像，并确定每一个孔板对应的子
图像的位置参数，其中所述多个孔板设置在孔板组件上。
30.示例性地，在一个封闭的场景中设置有一个固定光源，并在孔板组件的正上方设置成像系统，所述成像系统、所述固定光源及所述孔板组件在高度方向上对齐，用以所述成像系统生成所述子图像。具体地，封闭的场景的主要设备是摄像机(fujifilm x-a2)。摄像机置于封闭的场景中，通过遥控快门获取子图像。封闭的场景以避免反射效应，支架用于固定摄像机，在封闭的场景中有一个固定的光控制(即固定光源)，以保证测量过程中图像的再现性。在所有实验中，子图像都是以jpg格式存储的。摄像机参数为f5.6，快门速度为1/2.5， iso为800，手动对焦，手动白平衡。
31.步骤s220：识别每一个子图像的目标轮廓。
32.示例性地，对子图像预处理，重命名子图像明确文件路径导入子图像后颜色模式转为灰度，对子图像二值化，对子图像进行模糊消噪后使用opencvthreshold函数(ret,dst＝cv2.thresh(src,thresh,maxval,type)对子图像二值化，对于给定的阈值，大于阈值使用maxval(设定为255即白色)表示，小于阈值使用0表示。通过对阈值在110-200进行参数调整，其中在160-190区间内可以正确的识别24孔板，达到区分前景色和背景色的目的。
33.基于上述子图像二值化使用轮廓检测函数cv2.findcontours(image,mode, method)进行边缘检测，model为cv2.retr_list，检测的轮廓不建立等级关系。 method为cv2.chain_approx_simple，该方法通过压缩水平方向，垂直方向，对角线方向的元素，只保留该方向的终点坐标，例如一个矩形轮廓只需4 个点来保存轮廓信息，可有效减少运算量。利用轮廓信息建立最小外接矩形，从而得到目标轮廓。
34.步骤s230：将全部所述子图像的目标轮廓及其所确定的区域作为微生物菌落的所述图像信息。
35.在一些实施例中，步骤s120包括如下步骤：
36.步骤s310：在所述目标轮廓所确定的区域中选择一个预设大小的识别区域。
37.示例性地，在目标轮廓中选择一个500*500像素大小的象限作为识别区域。
38.步骤s320：针对每一所述识别区域，计算该识别区域内与所述目标特征相关联的至少一个特征参数，并将计算出的全部特征参数作为所述图像特征。
39.所述图像特征包括：红蓝绿子像素的亮度值、色调、饱和度、青色、洋红色、黄色、黑色及微生物菌落发酵天数。例如可以计算红(r)、绿(g)、蓝 (b)的平均值，亮度和三种相对颜色(相对红色(rr＝r/l)、相对绿色 (rg＝g/l)、相对蓝色(rb＝b/l))，以及色调、饱和度和lab模式中的亮度，青色，洋红色，黄色和黑色以及发酵天数(day)，其中l是r、g和b 的平均值。
40.在一些实施例中，步骤s130包括如下步骤：
41.步骤s410：获取至少一个孔板组件的至少一个时刻的图像信息。
42.步骤s420：将所述图像信息划分成训练参数合集和校验合集。
43.步骤s430：基于所述训练参数合集采用预设的建模算法建立回归模型；
44.步骤s440：基于所述校验合集对全部回归模型进行校验，并将准确率最高的回归模型作为所述筛选模型。
45.在一些实施例中，对不同发酵阶段的8组24孔板(24孔板即孔板组件，8 组即为8个孔板组件)进行图像信息的获取，每组4次检测重复，提取数据后共计768个样本矩阵，用比
色法快速检测庆大霉素效价建立回归模型。过程中涉及的模型包括：偏最小二乘回归(pls)、支持向量机(包括核函数”linear”,”rbf”,”poly”)、随机森林回归(rf)及梯度提升决策树(gbr)。模型评估在python环境下sklearn模块中进行。默认随机参数下对768组数据进行50次交叉验证评估模型得分。即在768建模样本中，拿出49/50样本(训练参数)进行建模型，留小部分样本(校验合集)用刚建立的回归模型进行预测，并求这小部分样本的预测误差，记录预测误差的平方之和。对768个数据点绘制学习曲线，并使用交叉验证10次计算准去率，评估不同模型对不同样本数据量的适应能力，并将准确率最高的回归模型作为所述筛选模型。
46.示例性地，本发明中所述的随机森林(rf)回归在大型数据集上是有效的，其中它结合了来自多个决策树算法的预测的优点。每棵树都是独立生长的，导致rf拥有更好的泛化程度，并且比任何单模型都具有更高的预测能力。rf的过程包括集成学习的三个主要步骤。首先，它是一个bootstrap aggregation (bagging)过程，在这个过程中，从原始数据集中随机进行抽样，并替生成多个子样本数据集。当从其子样本数据集构建每个决策树模型时，bagging减少了原始数据集中的偏差和差异。其次，通过一个子样本数据集，将生成一个决策树模型，因此在训练过程中，许多决策树将成长为子样本组成的决策树。在每个决策树中，决策节点根据测试函数得分判断每个样本数据点，并根据其特征将其传递给树的其他分支。将叶节点导出为预测值，该预测值由包含在所有单个决策树的每个叶节点中的输出的平均值计算得出。最后，通过平均每个决策树的预测值来计算rf的预测值。在python环境下sklearn模块进行随机森林调参，模型函数及调整参数为randomforestclassifier(n_estimators,max_depth, min_samples_split,min_samples_leaf,max_features,max_leaf_nodes, random_state＝20)。调参优先度n_estimators》max_depth》min_samples_leaf》 min_samples_split》max_features。
47.示例性地，所述微生物菌落为小单孢菌属，所述比色法为小单孢菌属产生的庆大霉素在酸性环境下磷钨酸钠溶液反应，庆大霉素最大吸收波长与庆大霉素效价呈正相关。目标特征包括产物产量、副产物产量、菌体量、营养缺陷型。
48.在本实施例中，所述微生物菌落发酵产生的一种氨基糖苷类广谱抗生素，即庆大霉素(gentamicin,gm)。
49.庆大霉素含量测定包括紫外分光光度法和高效液相色谱法，其中紫外分光光度法为
50.样品预处理：取一定体积发酵液用20％硫酸调整溶液ph为1.5-2.0后超声 30min，再将发酵液用20％氢氧化钠调节ph为6.4-6.8，最后将预处理后的发酵液4000r/min离心20min取上清备用。
51.庆大霉素含量测定：分别取1.5ml磷钨酸钠水溶液与酸化后发酵液上清液，加入100ml的容量瓶中，混合均匀，静置30min后定容至100ml，最后将反应后的发酵液4000r/min离心20min取上清，加入96孔石英酶标板中在247nm 波长下测量吸光度，最后将其吸光度带入标准曲线中计算出庆大霉素含量。
52.高效液相色谱法：
53.衍生剂配置：称取1g邻苯二甲醛，2.34954g硼酸，加入5ml甲醇及95ml 超纯水，利用超声清洗仪使其完全溶解，然后加入2ml硫代乙醇酸混匀，用 45％的氢氧化钠调ph至
10.4，放在4℃冰箱避光保存，保存时间不超过1个月。
54.流动相配置：称取3.636g庚烷磺酸钠，加入225ml超纯水(超纯水使用0.22μm的水相滤头过滤后方能使用)、730ml甲醇、45ml乙酸，超声20min 脱气泡，保存于4℃冰箱中待用。
55.标准曲线制作及样品前处理：将庆大霉素标品1000u浓度稀释成不同梯度的标准样品，用移液枪吸取200μl不同浓度的标液，依次向其中加入1.8ml 超纯水、0.8ml衍生剂、2.2ml甲醇，混合均匀后放入60℃水浴锅中孵育15 min，冷却至室温后用0.22μm的水相滤头过滤，将滤液转入到液相小瓶进行测定。吸取酸化处理后的样品0.2ml，其余操作流程同上。
56.在诱变过程筛选高产菌株，诱变的过程如下：
57.体系为10μl单孢子悬液，诱变距离为2mm，诱变时间为210s进行artp 诱变。将诱变后的平板培养基内菌落进行孔板培养。挑选生长旺盛，面积小且突起的孢子，每个孔内接5个单菌落，进行种子培养60h。在无菌环境下每天对发酵孔板进行拍摄，过程检测庆大霉素含量。将高产株进行连续5代的平板转接培养，并接入发酵摇瓶中，验证菌株的稳定性。通过快速检测方法法快速测定发酵液效价。并在5l生物反应器中进行验证。
58.上述中5l生物反应器发酵培养方法：
59.摇瓶种子培养：将配制好的50ml种子培养基倒入500ml锥形瓶中灭菌，然后在超净工作台内用无菌接种铲挖取2～3cm2的斜面孢子块加入到三角瓶中，用8层纱布封口。最后放置在转速为250rpm，温度为34℃，湿度为40％-60％的摇床上进行培养至42-54h。
60.发酵罐前处理：主要包括溶氧电极、ph电极及重量的标定，反应器气密性的检查。ph电极先将其放入到4.00的标准溶液中，待其示数稳定后进行确定，然后将电极放入6.86的标准溶液中，同样在示数稳定后进行确定。接着将溶氧电极插入饱和的无水亚硫酸钠溶液中，当其示数稳定后可手动确定零点。将发酵罐中所有仪器安装完毕后向发酵罐内通入空气，在罐压达到0.05mpa时关闭进气口和出气口，一段时间后罐压仍维持不变则认为反应器的气密性良好。
61.火焰圈接种：取已经培养好的种子摇瓶6个，将种子培养液通过带有火圈的接种口倒入装有2700ml发酵液的5l发酵罐中。待所有参数稳定后标定溶氧满度。通过发酵罐夹套中的循环水将发酵液的温度控制在34℃左右。通过补加葡萄糖(30％(w/v))使发酵液的ph值控制在6.9～7.1。通过控制搅拌转速和通气量，使得发酵液中的溶氧大于30％。搅拌桨最高转速为700rpm，最大通气量为5000ml/min。
62.发酵参数测定方法：
63.发酵过程使用湿重来表征菌体浓度，取10ml发酵液于10ml离心管中， 5000rpm离心10min，测定上清液体积，计算菌浓。dns法对发酵液残糖进行测量。
64.利用过程质谱仪测定发酵尾气中的co2和o2的浓度，通过软件包计算出 our与cer等在线生理参数。
65.本发明可实现在artp诱变庆大霉素高产菌株中拥有快速、实时、非侵入式的优点，在24孔板发酵发酵培养中完成高通量效价检测，标记高产菌株。本发明通过artp诱变方式获得3005株诱变菌株，经过24孔板培养进行初步筛选，测定结果如下图5中的(a)。其中含量高于对照组诱变菌株共计405株，效价高于对照组10％的高产菌株有175株，其中最高效价为988u/ml，多数诱变菌株发酵的效价低于对照组(577.91u/ml)。
66.对初筛高于对照组效价10％的诱变菌株进行复筛，共计175株如下图5中 (b)。对初筛获得的175株高产菌株进行摇瓶复筛，结果如图。得到高于对照组效价10％以上的突变株15株。其中复筛最高效价为998u/ml，进行连续5 代的平板转接培养，通过拍照实时检测庆大霉素含量，该菌株仍具有高产特性。
67.在维持相同的接种量、通气量、温度以及发酵阶段转速条件下，庆大霉素生产菌与诱变菌在补料分批发酵过程中庆大霉素效价出现了显著的差异。对比出发菌，诱变菌在整个发酵过程中呈现了显著的优势。整个发酵过程中出发菌与诱变菌在碳源消耗情况呈现了较为一致的趋势，但是诱变菌发酵液中的总糖水平始终低于出发菌的总糖水平，并且相较于出发菌，发酵后期诱变菌的our， cer保持更高的水平。随着发酵培养的持续，当菌体生长受到碳氮源限制出现了“平台”甚至下降现象。之后通过补加相关碳源，细胞利用该种基质，表现了 our与cer的二次上升，这时提供的碳源主要用作菌体维持，实际上此时表征了抗生素生产的开始，即初级代谢向次级代谢转化，这是一种发生在核糖体上的空载trna的严谨响应，诱变株相较于出发株这一过程明显提前。这些结果均表明经过诱变筛选后的菌株具有更强的代谢能力和产素水平如下图5中的 (c,d,e,f,g,h,i)。
68.本发明的优点在于，通过比色法在封闭的场景中获取多个孔板上生物菌落的多个子图像，并确定每一个孔板对应的子图像的位置参数。对所述图像信息提取图像特征，根据所述图像特征建立生物菌落的筛选模型，且根据所述生物菌落的筛选模型获取目标特征符合预设要求的生物菌落。从而实现高效率的筛选。
69.本发明还提供一种存储介质，所述存储介质中存储有多条指令，所述指令适于由处理器加载以执行前述任一所述的基于计算机视觉高通量筛选微生物的方法。
70.综上所述，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，但上述优选实施例并非用以限制本发明，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与润饰，因此本发明的保护范围以权利要求界定的范围为准。