一种烟草苗期青枯病抗性鉴定的方法与流程

1.本发明属于烟草抗病育种技术领域，具体涉及一种烟草苗期青枯病抗性鉴定的方法。


背景技术：

2.烟草青枯病(tobacco bacterial wilt)是影响我国烟草生产的主要病害，由青枯雷尔氏菌[ralstonia pseudosolanacearum (e.f.smith)]引起的细菌性土传病害，烟株一旦感病通常会发病死亡，是烟草上毁灭性病害之一。该病广泛分布于温带、亚热带和热带地区，由于病原在土壤中可以长期存活、寄主广，烟草全生育期均可被侵染，防治难度大，最经济有效的防治措施是选育和应用抗病品种。
[0003]
选育和应用抗病品种是建立在准确的病害抗性鉴定基础上。由于苗期鉴定可以在可控的人工气候室进行，受环境的影响较小，因此烟草青枯病的抗性鉴定多以苗期为主，除传统的伤根灌注青枯菌构建病圃(gb/t 23224-2008烟草品种抗病性鉴定)外，还有利用青枯菌悬浮液作为漂浮池水浸根接种(许文，刘勇，姬广海，卢秀萍，李永平.烟草青枯病苗期抗性鉴定的漂浮池恒温水培接种法研究，中国烟草科学，2013，34(2)：45-48.)、伤根连续浸泡接种(王新，吴新儒，王卫锋，薄韶云，王静，孙玉合，刘贯山.烟草抗青枯病突变体的室内接种鉴定，分子植物育种，2018，16(19)：6468-6475.) 等方式构建病圃。评价抗性的指标以病情指数为主，原烟草行业标准的4档抗性划分(yc/t 41-1996烟草品种抗病性鉴定)、福建的6档抗性划分(方树民，顾刚，张仁椒，林海，陈剑芳.烤烟新品种岩烟97抗青枯病鉴定初报，福建农业科技，1997(3)：16.)和国家标准(gb/t 23224-2008烟草品种抗病性鉴定)6档抗性划分，划分的依据均为满足条件下某个发病时段的病情指数或几个发病时段的平均病情指数。在烟草苗期青枯病抗性评价实践中，对同一品种的抗性评价结果往往不尽相同，采用相对病情指数(范江，刘勇，李永平，周冀衡.烟草苗期青枯病抗性鉴定及其抗性评价方法的比较，云南农业大学学报，2014，29(4)：487-493.)、统计学t测验校正档次边界品种(王玉.烟草青枯病抗性的大田鉴定及苗期鉴定方法研究，2018，福建农林大学硕士专业学位论文)、苗期与田间鉴定和植株内病菌群体数量及其分布检测等综合方法(中国发明专利200510062017.0番茄青枯病抗性鉴定方法)可以减少评价结果的偏差，可仍然没有考虑到病害发生、蔓延的过程。尽管萎蔫指数(王玉.烟草青枯病抗性的大田鉴定及苗期鉴定方法研究，2018，福建农林大学硕士专业学位论文)和全生育期病情指数的变化曲线类型划分品种抗性类别(孙学永，周应兵，杨华应，高正良，竟丽丽，李廷春.烟草种质抗青枯病鉴定及其抗性分类，中国烟草学报，2011，17(6)61-66，88.)顾及到病害发生、蔓延的过程，但萎蔫指数却采用大田的某个发病时段的病情指数，而不是与大田的整个发病时段病情指数进行相关性回归分析，全生育期青枯病的变化仅以病情指数变化曲线进行简单的划分，让整个生育期抗性评价大打折扣，限制了这两种方法的规模化应用。综合考虑烟草青枯病苗期抗性鉴定的幼苗苗龄、接种方式和接种浓度、以及评价方式，需要寻求更有效的烟草苗期青枯病抗性鉴定方法。


技术实现要素：

[0004]
基于清楚知悉上述现有技术缺陷，本发明提供一种烟草苗期青枯病抗性鉴定的方法。
[0005]
本发明采用如下技术方案实现。
[0006]
一种烟草苗期青枯病抗性鉴定的方法，包括小十字期移栽漂浮育苗、大十字期标准化根系微创后高浓度定株接种青枯菌构建微病圃、高温高湿诱发病害、系统病害调查评价抗性等4个步骤，具体包括：
[0007]
(a)小十字期移栽漂浮育苗：将烟草种子撒播于装满湿润基质的容器，每个容器播1种品种或材料，在25
±
2℃、光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度1000-1600lx的人工气候室培育，播种后每5-7d施入250-300倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，浅层湿润育苗至小十字期，挑选健壮、整齐一致的幼苗移栽至漂浮盘，漂浮于水深 4-6cm的漂浮池，覆透明地膜保湿36-48h，在膜上均匀地戳100mm2透气孔、每漂浮盘等面积的膜上戳5-7个透气孔，继续培养3-4d，揭膜，移栽后每7-10d施入100-150倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，培育至大十字期，用于接种；
[0008]
(b)大十字期标准化根系微创后高浓度定株接种青枯菌构建微病圃：步骤(a)培育至大十字期烟苗创伤前，漂浮盘沥水20-24h，创伤时采用1000μl或1250μl移液器配套枪头的尖端套牢200μl枪头以30-45
°
的角度距离烟茎3-5mm处对称戳2个深35-40mm的小坑伤根；配50ml枪头或100ml玻璃移液管的连续加样器2.0-2.5ml的低剂量加注 1-3
×
109cfu/ml的高浓度青枯菌悬浮液至每株烟苗伤根处外2-3mm的四周；
[0009]
(c)高温高湿诱发病害：接种后诱发病害高温为30
±
2℃，光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度为2000-2600lx，高湿是通过降低漂浮池水位(幼苗最高处到漂浮池池顶的距离5-10cm)、池水自然挥发保留于漂浮池内的幼苗茎叶，维持基质表面的润湿，根系的基质渗透吸水至饱和维持湿度；
[0010]
(d)系统病害调查评价抗性：继续以步骤(c)所述的温湿度和光照条件培育步骤(c)处理的烟苗，每10-15d施入 200-300倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，每3-10d按病害严重度调查记录病情，计算病情指数，30d 病害调查共3-9次，以时间间隔与病情指数计算病害曲线下面积(a
udpc
)和病程相对抗性指数(r
ricd
，relative resistanceindex of course disease)，基于不同抗性水平的对照品种数值范围划定抗性水平。
[0011]
本发明利用烟草植株幼苗期易感病性以及烟草青枯病易在高温高湿发病的特性，采用撒播的小十字期幼苗移栽漂浮育苗至大十字期，幼苗标准化根系微创后高浓度定株接种青枯构建微病圃，增加植株根系的感病性；利用漂浮育苗设置创造高温高湿环境，有效诱发病害，提高了烟草青枯病抗性鉴定的准确性与重现性；系统调查病害，利用获得的至少3 次以上的连续病害调查数据，综合病害发病过程(简称病程)，以病程相对抗性指数，基于不同抗性水平的对照品种数值范围划定抗性水平，显著提高了烟草青枯病抗性鉴定的准确性、稳定性、可比性。总之，本发明将青枯病抗性鉴定与漂浮育苗融合在一起具有操作程序化、降本、省空间、省工、选择效率高、烟草青枯病抗性表型鉴定准确、稳定、可比性强等优点，从播种到鉴定完成通常2个月就可结束，提高了烟草青枯病抗性鉴定的时效性和规模化，值得推广。
[0012]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0013]
1、与常规的漂浮育苗相比，本发明不采用直播成苗，而是采用撒播浅层湿润育苗至小十字期后移栽漂浮盘，覆膜培养成活后，浅水漂浮育苗至大十字期，比常规的漂浮育苗时间缩短5-7d，同一材料的幼苗生长更整齐一致，克服了常规漂浮育苗出现弱苗、不整齐的弊端，避免了弱苗更易感病对鉴定结果的干扰；
[0014]
2、与现有的烟草苗期青枯病抗性鉴定相比，本发明利用烟草青枯菌易侵染有伤口的幼嫩烟根的生物学特性，采用高浓度定株接种标准化创伤、伤口适中的低苗龄烟根，模拟高温高湿的人工环境诱发病害，避免了苗龄、创伤伤口的差异以及接种、环境条件的变化对鉴定结果的影响，提高了烟草青枯病抗性鉴定的准确性、重现性；
[0015]
3、本发明的抗性水平是对病害曲线下面积参数评价抗性的继承与发展，在获得病害曲线下面积参数的基础上，利用病程相对抗性指数评价，充分利用了各个调查时期(不同生长期)的病情数据，在利用感病对照指示与标尺校正的同时，基于多个不同单位多次文献报道、反复鉴定验证的抗、中抗、中感、感病等不同抗性水平的对照品种划定抗性等级，是一种动态分类方法，克服了以往静态分类划分稳定差、可比性不强的缺陷，评价方法更具科学性、重现性；
[0016]
3、本发明操作程序化，减少了烟草青枯病抗性鉴定的误差；
[0017]
4、本发明将青枯病抗性鉴定与漂浮育苗融合在一起，具有降本、省空间、省工、选择效率高、烟草青枯病抗性表型鉴定准确等优点；
[0018]
5、本发明从播种到鉴定完成通常2个月就可结束，与现有青枯病苗期抗性鉴定相比，缩短了10-15d的鉴定时间，可不间断或部分重叠成批次地进行抗性鉴定，提高了烟草青枯病抗性鉴定的时效性和规模化。
附图说明
[0019]
图1小十字期烟苗与大十字期烟苗对照图；其中左图为小十字期烟苗(苗龄14-18d、真叶2片)，右图为大十字期烟苗(苗龄23-28d、真叶4片)。
[0020]
图2为标准化创伤与接种对照图；左图为标准化创伤，右图为接种，图中展示有标准化创伤枪头套。
[0021]
图3为接种30d后抗感对照品种的发病症状图；左图漂浮盘边端2行为抗病对照品种d101，右图漂浮盘边端2行为感病对照品种长脖黄。
[0022]
图4为不同抗性水平的病害流行曲线图。
[0023]
图5为烟草近等基因系单株群体抗感表型分布图。
具体实施方式
[0024]
下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
[0025]
本发明一种烟草苗期青枯病抗性鉴定的方法，包括小十字期移栽漂浮育苗、大十字期标准化根系微创后高浓度定株接种青枯菌构建微病圃、高温高湿诱发病害、系统病害调查评价抗性等4个步骤，具体包括：
[0026]
(a)小十字期移栽漂浮育苗：将烟草种子撒播于装满湿润基质的容器，每个容器播1种品种或材料，在25
±
2℃、光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度1000-1600lx的人工
气候室培育，播种后每5-7d施入250-300倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，浅层湿润育苗至小十字期，挑选健壮、整齐一致的幼苗移栽至漂浮盘，漂浮于水深 4-6cm的漂浮池，覆透明地膜保湿36-48h，在膜上均匀地戳100mm2透气孔、每漂浮盘等面积的膜上戳5-7个透气孔，继续培养3-4d，揭膜，移栽后每7-10d施入100-150倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，培育至大十字期，用于接种；
[0027]
(b)大十字期标准化根系微创后高浓度定株接种构建微病圃：步骤(a)培育至大十字期烟苗创伤前，漂浮盘沥水20-24h，创伤时采用1000μl或1250μl移液器配套枪头的尖端套牢200μl枪头以30-45
°
的角度距离烟茎3-5mm处对称戳2个深 35-40mm的小坑伤根；配50ml枪头或100ml玻璃移液管的连续加样器2.0-2.5ml的低剂量加注1-3
×
109cfu/ml的高浓度青枯菌悬浮液至每株烟苗伤根处外2-3mm的四周；
[0028]
(c)高温高湿诱发病害：接种后诱发病害高温为30
±
2℃，光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度为2000-2600lx，高湿是通过降低漂浮池水位(幼苗最高处到漂浮池池顶的距离5-10cm)、池水自然挥发保留于漂浮池内的幼苗茎叶，维持基质表面的润湿，根系的基质渗透吸水至饱和维持湿度；
[0029]
(d)系统病害调查评价抗性：继续以步骤(c)所述的温湿度和光照条件培育步骤(c)处理的烟苗，每10-15d施入 200-300倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，每3-10d按病害严重度调查记录病情，计算病情指数，30d 病害调查共3-9次，以时间间隔与病情指数计算病害曲线下面积(a
udpc
)和病程相对抗性指数(r
ricd
，relative resistanceindex of course disease)，基于不同抗性水平的对照品种数值范围划定抗性水平。
[0030]
步骤(a)所述的撒播容器为花盆或筛筐，所述的漂浮盘为96-200孔商业化烟草漂浮育苗盘，所述的浅层湿润育苗为育苗容器下沉贴于水层底部，通过基质毛细管渗透吸水湿润基质至水饱和，通常出苗前水深为基质厚度的1/3-1/2，出苗后水深为基质厚度的1/6-1/4；所述的材料抗性筛查时每品种或材料至少18株，复筛时每品种或材料至少18株、至少3次重复。
[0031]
步骤(b)所述的青枯菌悬浮液，采用保存的青枯菌在含有ttc(2，3，5-氯化三苯基四氮唑，0.05g/l)的cpg 培养基(蛋白胨10g，葡萄糖10g，酪朊水解物1g，琼脂粉17g，水1 000ml，ph 7.0)上28℃培养48h活化1-2 次，挑取典型青枯单菌落用市售的青枯病检测试纸条测定为阳性后，再在无ttc的cpg培养基平板上高密度划线扩繁，将菌苔刮下，灭菌水调节青枯菌浓度，青枯菌浓度以od
600
快速计测(1.0-1.2)、稀释涂布于无ttc的cpg培养基平板上计数验证。
[0032]
步骤(d)所述的病害严重度，分级方法为：
[0033]
0级：全株无病；1级：病株1/2以下叶片凋萎；3级：病株1/2-2/3叶片凋萎；5级：病株2/3以上叶片凋萎；7级：病株叶片全部凋萎；9级：病株基本枯死；
[0034]
步骤(d)所述的病情指数(di)，采用如下公式计算：
[0035][0036]
其中，i：病情级数(0-9)；xi：i级植株株数；
[0037]
步骤(d)所述的病情指数感病对照品种至少有1次调查时不低于60，烟草苗期青枯病抗性鉴定有效，否则为无效。
[0038]
步骤(d)所述的病害曲线下面积(a
udpc
)公式如下：
[0039][0040]
其中，yi为第i次记载的病情指数(包括接种当天或前/后1天的初始病害调查，该次的病情指数为0，默认为第1 次，接种后顺延)，y
i 1
为第i 1次记载的病情指数，t
i 1-ti为第i 1次与第i次记载的间隔时间(d)；
[0041]
步骤(d)所述的病程相对抗性指数r
ricd
＝100
×
(a
udpcck-a
udpct
)/a
udpcck
，式中a
udpcck
为感病对照品种病害曲线下面积，a
udpct
为测试品种病害曲线下面积；
[0042]
步骤(d)所述的基于不同抗性水平对照品种数值范围划定抗性水平，分为5个等级：免疫或高抗(i)：r
ricd 100；抗(r)：r
ricd 30.1-99.9；中抗(mr)：r
ricd 20.1-30.0；中感(ms)：r
ricd 10.1-20.0；感(s)：r
ricd 10.0及以下(含负数)。
[0043]
步骤(d)所述的感病对照品种为长脖黄，所述的不同抗性水平的对照品种为多个不同单位多次文献报道、反复鉴定验证的抗、中抗、中感、感病品种，其中抗病品种d101可以作为抗性对照品种验证烟草苗期青枯病抗性鉴定结果的可靠性。
[0044]
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
[0045]
实施例1
[0046]
烟草青枯病抗源的筛选、验证与抗性水平划分
[0047]
1材料与方法
[0048]
1.1材料
[0049]
烟草品种：d101、2015-614、g3、oxford207、22-326、反帝三号、岩烟97、6036、gdsy-1、g21、大叶密合、贵烟14、fj1604、yk1833、09-18-3、633k、yk2003、k326、2014-502、云烟300、hn2146、翠碧一号、云烟201、红花大金元、长脖黄、hb1709、beinhart 1000-1，其中抗病对照品种为d101、感病对照品种为长脖黄，其他不同抗性水平的对照品种为多个不同单位多次文献报道、反复鉴定验证(表1)。
[0050]
病菌为烟草青枯病病原菌青枯雷尔氏菌[ralstonia pseudosolanacearum(e.f.smith)]，编号为y45(王敏，刘勇，李梅云，姬广海，李永平.云南省烟草上青枯雷尔氏菌的致病力、生化型和致病型研究，西南农业学报，2009，22(3)：636-640.)。
[0051]
1.2方法
[0052]
1.2.1烟苗的培育
[0053]
烟草种子撒播于装满湿润基质的边长与高均为6cm、筛孔2-4mm的筛筐，每个筛筐播1种品种或材料，在25
±
2℃、光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度1000-1600lx的人工气候室培育，播种后每5-7d施入250-300倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，浅层湿润育苗至小十字期(图1)，挑选健壮、整齐一致的幼苗移栽至162孔漂浮盘，漂浮于水深4-6cm的漂浮池，覆透明地膜保湿36-48h，在膜上均匀地戳100mm2透气孔、每漂浮盘等面积的膜上戳5-7 个透气孔，继续培养3-4d，揭膜，移栽后每7-10d施入100-150倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，培育至大十字期(图1)，用于接种。
[0054]
1.2.2病菌悬浮液制备
[0055]
采用保存的青枯菌在含有ttc(2，3，5-氯化三苯基四氮唑，0.05g/l)的cpg培养基(蛋白胨10g，葡萄糖10 g，酪朊水解物1g，琼脂粉17g，水1 000ml，ph 7.0)上28℃培养48h活
化1次，挑典型青枯单菌落用市售的青枯病检测试纸条测定为阳性后，再在无ttc的cpg培养基平板上扩繁，将菌苔刮下，灭菌水配成1-3
×
109cfu/ml(od
600
值为1.0-1.2，稀释涂平板计数验证)的青枯菌悬浮液。
[0056]
1.2.3伤根灌注法接种
[0057]
创伤：创伤前，漂浮盘沥水20-24h，创伤时采用1000μl或1250μl移液器配套枪头的尖端套牢200μl枪头以30-45
ꢀ°
的角度距离烟茎3-5mm处对称戳2个深35-40mm的小坑伤根(图2)。
[0058]
灌注接种：配50ml枪头或100ml玻璃移液管的连续加样器2.0ml的低剂量加注制备好病菌悬浮液至每株烟苗伤根处外2-3mm的四周，每品种或材料至少18株，重复至少3次。
[0059]
1.2.4病害诱发与调查
[0060]
接种后诱发病害高温为30
±
2℃，光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度为2000-2600lx，每10-15d施入200-300 倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，每3-10d按病害严重度调查记录病情，计算病情指数，30d病害调查共3-9次。
[0061]
1.2.5抗病评价
[0062]
基于不同抗性水平的对照品种数值范围以病程相对抗性指数划定抗性水平，病程采用病害曲线下面积量化，公式如下：
[0063][0064]
其中，yi为第i次记载的病情指数(包括接种当天或前/后1天的初始病害调查，该次的病情指数为0)，y
i 1
为第i 1 次记载的病情指数，t
i 1-ti为第i 1次与第i次记载的间隔时间(d)。
[0065]
病程相对抗性指数r
ricd
＝100
×
(a
udpcck-a
udpct
)/a
udpcck
，式中a
udpcck
为感病对照品种病害曲线下面积，a
udpct
为测试品种病害曲线下面积。
[0066]
2结果和分析
[0067]
伤根灌注法接种鉴定结果见表1，基于不同抗性水平的对照品种数值范围以病程相对抗性指数划定抗性水平，划分的抗性水平可分为5个等级：免疫(i)：r
ricd 100；抗(r)：r
ricd 30.1-99.9；中抗(mr)：r
ricd 20.1-30.0；中感(ms)： r
ricd 10.1-20.0；感(s)：r
ricd 10.0及以下(含负数)。这些品种/品系的鉴定结果与文献报道的鉴定结果完全吻合，说明该方法稳定、可靠，可用于烟草苗期的青枯病抗性鉴定，特别是规模化鉴定。
[0068]
以4个类型代表品种如抗病的d101、中抗的fj1604、中感的k326、感病的长脖黄可以作出4种类型病害流行变化曲线，如图4，抗病与感病的30d发病症状如图3，表明烟草品种对青枯病的抗性普遍较弱，抗病(含中抗)品种主要表现在发病时间推迟、蔓延速度慢，这也提示生产中利用抗性品种也同样需要及时进行病害防治。
[0069][0070]
实施例2
[0071]
烟草重组自交系单株群体的青枯病抗性鉴定
[0072]
1材料与方法
[0073]
1.1材料
[0074]
烟草重组自交系单株群体以红花大金元与beinhart 1000-1杂交、再自交而成的f8单株群体(hbf8)，以及抗病对照品种d101、感病对照品种长脖黄。
[0075]
病菌为烟草青枯病病原菌青枯雷尔氏菌[ralstonia pseudosolanacearum(e.f.smith)]，编号为y45(王敏，刘勇，李梅云，姬广海，李永平.云南省烟草上青枯雷尔氏菌的致病力、生化型和致病型研究，西南农业学报，2009，22(3)：636-640.)。
[0076]
1.3方法
[0077]
1.3.1烟苗的培育
[0078]
烟草种子撒播于装满湿润基质的直径与高均为6cm花盆，每个花盆播1种材料，在25
±
2℃、光周期为12-16h光照/8-12h黑暗、光照度1000-1600lx的人工气候室培育，播种后每5-7d施入250-300倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为 20∶20∶20)1次，浅层湿润育苗至小十字期，挑选健壮、整齐一致的幼苗移栽至136孔漂浮盘，漂浮于水深4-6cm的漂浮池(配套育苗箱)，覆透明地膜保湿36-48h，在膜上均匀地戳100mm2透气孔、每漂浮盘等面积的膜上戳5-7个透气孔，继续培养3-4d，揭膜，移栽后每7-10d施入100-150倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，培育至大十字期(图1)，用于接种。
[0079]
1.3.2病菌悬浮液制备
[0080]
采用保存的青枯菌在含有ttc(2，3，5-氯化三苯基四氮唑，0.05g/l)的cpg培养基(蛋白胨10g，葡萄糖10 g，酪朊水解物1g，琼脂粉17g，水1 000ml，ph 7.0)上28℃培养48h活化1次，挑典型青枯单菌落用市售的青枯病检测试纸条测定为阳性后，再在无ttc的cpg培养基平板上扩繁，将菌苔刮下，灭菌水配成1-3
×
109cfu/ml(od
600
值为1.0-1.2，稀释涂平板计数验证)的青枯菌悬浮液。
[0081]
1.3.3伤根灌注法接种
[0082]
创伤：创伤前，漂浮盘沥水20-24h，创伤时采用1000μl或1250μl移液器配套枪头的尖端套牢200μl枪头以30-45
ꢀ°
的角度距离烟茎3-5mm处对称戳2个深35-40mm的小坑伤根。
[0083]
灌注接种：配50枪头或100ml玻璃移液管的连续加样器2.5ml的低剂量加注制备好病菌悬浮液至每株烟苗伤根处外2-3mm的四周，每品种或材料至少18株，重复至少3次。
[0084]
1.3.4病害诱发与调查
[0085]
接种后诱发病害高温为30
±
2℃，光周期为12-16h光照/8-12h黑暗，光照度为2000-2600lx，每10-15d施入200-300 倍可溶性育苗肥(n∶p2o5∶k2o为20∶20∶20)1次，每3-10d按病害严重度调查记录病情，计算病情指数，30d病害调查共3-9次。
[0086]
1.3.5抗病评价
[0087]
基于不同抗性水平的对照品种数值范围以病程相对抗性指数划定抗性水平，病程采用病害曲线下面积量化，公式如下：
[0088][0089]
其中，yi为第i次记载的病情指数(包括接种当天或前/后1天的初始病害调查，该次的病情指数为0)，y
i 1
为第i 1 次记载的病情指数，t
i 1-ti为第i 1次与第i次记载的间隔时间(d)。
[0090]
病程相对抗性指数r
ricd
＝100
×
(a
udpcck-a
udpct
)/a
udpcck
，式中a
udpcck
为感病对照品种病害曲线下面积，a
udpct
为测试品种病害曲线下面积。
[0091]
单株群体抗性水平以5个等级分类：免疫(i)：r
ricd 100；抗(r)：r
ricd 30.1-99.9；中抗(mr)：r
ricd 20.1-30.0；中感(ms)：r
ricd 10.1-20.0；感(s)：r
ricd 10.0及以下(含负数)。
[0092]
2结果和分析
[0093]
烟草重组自交系f8群体178份单株的青枯病抗性鉴定结果表明，抗青枯病的株系有13个、占7.30％，中抗的15个、占8.43％，中感的36个、占20.22％，感病的114个、占64.05％，说明群体中抗病株系的数量远远低于感病的株系，抗病的仅占15.73％。
[0094]
与亲本的烟草青枯病抗感表型比较，烟草重组自交系f8群体中，与感病亲本红花大金元表型相同的比例较大，占比高达64.05％，出现了比感病亲本更感病的单株；与抗病亲本beinhart 1000-1表型相同的为极少数，占比仅为7.30％，没有出现比抗病亲本更抗的单株；还出现与亲本抗感表型不同的类型即表现为中抗、中感的类型。总体来看，烟草重组自交系f8群体抗感表型类型较为丰富，有抗病、中抗、中感和感病等多种类型，抗感表型整体呈现为正态分布(图5)，表明抗青枯病是微效多基因控制的数量遗传性状。
[0095]
以上所述的仅是本发明的部分具体实施例(由于本发明包含数值范围，故实施例不能穷举，本发明所记载的保护范围包含本发明的数值范围和其他技术要点范围)，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。